趙云麗 袁勇 馬曉莉 黃川生 文志萍 郭新紅 王新春

摘 要 目的：研究香青蘭總黃酮（TFDM）對(duì)腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）/過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC-1α）信號(hào)通路的影響，探究其保護(hù)大鼠心肌缺血再灌注損傷（MIRI）的作用機(jī)制。方法：將50只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、TFDM組[60 mg/（kg·d），以提取物計(jì)]、Compound C+TFDM組[灌胃60 mg/（kg·d）TFDM+再灌注前15 min尾靜脈注射250 μg/kg Compound C （AMPK抑制劑）]、EX-527+TFDM組[灌胃60 mg/（kg·d）TFDM+再灌注前20 min腹腔注射5 mg/kg EX-527（SIRT1抑制劑）]，每組10只。每天灌胃給藥1次，連續(xù)7 d。末次灌胃給藥后，假手術(shù)組大鼠行假手術(shù)，其余4組大鼠均采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支缺血30 min、再灌注2 h構(gòu)建MIRI模型。再灌注結(jié)束后，采用蘇木精-伊紅染色法觀察大鼠心肌組織病理學(xué)變化;采用反相高效液相色譜法測(cè)定其心肌組織中腺苷三磷酸（ATP）、腺苷二磷酸（ADP）、腺苷一磷酸（AMP）及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的含量;采用實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)大鼠心肌組織中AMPK、SIRT1和PGC-1α mRNA表達(dá)水平;采用Western blotting法檢測(cè)大鼠心肌組織中AMPK蛋白的磷酸化水平和SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌纖維排列紊亂、橫向條紋消失，細(xì)胞腫脹破裂、壞死，細(xì)胞核變形移位;心肌組織中ATP、NAD+含量和AMPK、SIRT1、PGC-1α mRNA表達(dá)水平以及SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），ADP、AMP含量及AMPK蛋白的磷酸化水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，TFDM組大鼠心肌病理學(xué)形態(tài)明顯改善;心肌組織中ATP、NAD+含量和AMPK、SIRT1、PGC-1α mRNA表達(dá)水平以及AMPK蛋白的磷酸化水平和SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），ADP、AMP含量均顯著降低（P<0.01）。與TFDM組比較，Compound C+TFDM組和EX-527+TFDM組大鼠上述指標(biāo)的改善作用均被逆轉(zhuǎn)（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：TFDM可能是通過(guò)激活A(yù)MPK/SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路，調(diào)節(jié)能量代謝，從而發(fā)揮其對(duì)心肌的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞 香青蘭總黃酮;能量代謝;腺苷酸活化蛋白激酶;沉默信息調(diào)節(jié)因子1;過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α;機(jī)制

中圖分類(lèi)號(hào) R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）03-0278-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.03.05

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of Dracocephalum moldavica total flavonoids （TFDM） on AMPK/SIRT1/PGC-1α signaling pathway， and to explore the mechanism of its protective effect on myocardial ischemia reperfusion injury （MIRI） rats. METHODS： Totally 50 healthy male SD rats were randomly divided into sham operation group， model group， TFDM group [60 mg/（kg·d）， by extract]， Compound C+TFDM group [ig administration of 60 mg/（kg·d） TFDM+intravenous injection of 250? ? ? ? μg/kg Compound C （AMPK inhibitor） via tail vein 15 min before reperfusion]， EX-527+TFDM group [ig administration of 60 mg/（kg·d） TFDM+ip injection of 5 mg/kg EX-527 （SIRT1 inhibitor） 20 min before reperfusion]， with 10 rats in each group. They were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 7 days.? After last ig administration， sham operation group underwent sham operation， other 4 groups were established MIRI model by ligating left anterior descending coronary artery， ischemia for 30 min and reperfusion for 2 h. After reperfusion， the myocardial histopathological changes were observed by HE staining; RP-HPLC method was used to determine the contents of ATP， ADP， AMP and NAD+ in cardiac tissue. mRNA expressions of AMPK， SIRT1 and PGC-1α were detected by quantitative real-time PCR assay. Western blotting assay was used to detect the phosphorylation level of AMPK protein and the expressions of SIRT1 and PGC-1α protein in myocardium. RESULTS： Compared with sham operation group， model group showed myocardial fibers arranged disorder and horizontal stripes disappearance， cell swelling burst and necrosis， and nuclei deformation displacement; the contents of ATP and NAD+， mRNA expression of AMPK， SIRT1 and PGC-1α， protein expression of SIRT1 and PGC-1α in cardiac tissue were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）; the contents of ADP and AMP， the phosphorylation level of AMPK protein were increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， myocardial pathological morphology were improved significantly in TFDM group; the contents of ATP and NAD+ in cardiac tissue， mRNA expression of AMPK， SIRT1 and PGC-1α， the phosphorylation level of AMPK protein， the protein expression of SIRT1 and PGC-1α were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）， while the contents of ADP and AMP were decreased significantly （P<0.01）. Compared with TFDM group， improvement effects of Compound C+TFDM group and EX-527+TFDM group on above indexes were reversed? （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： TFDM may play a protective role on myocardium by activating AMPK/SIRT1/PGC-1α signaling pathway and regulating energy metabolism.

KEYWORDS? ?Dracocephalum moldavica total flavonoids; Energy metabolism; AMPK; SIRT1; PGC-1α; Mechanism

心肌缺血再灌注損傷（Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）是心腦血管疾病患者的主要死亡原因之一，會(huì)嚴(yán)重影響缺血性心臟疾病患者的預(yù)后;而且，MIRI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括能量代謝障礙、自由基損傷、鈣超載和細(xì)胞凋亡等[1]，而能量代謝又被認(rèn)為是心肌細(xì)胞活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)[2]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是調(diào)節(jié)能量代謝的核心分子，參與了多種代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)[3]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）是一種具有組蛋白脫乙?；富钚缘霓D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可感受機(jī)體的能量狀態(tài)，調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，也參與了調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝穩(wěn)態(tài)和氧化應(yīng)激損傷的過(guò)程[4]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC-1α）是AMPK和SIRT1的下游靶蛋白，是線粒體生物合成、氧化代謝及細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子[5-6]。

香青蘭總黃酮（Dracocephalum moldavica L. total flavonoids，簡(jiǎn)稱(chēng)“TFDM”）是從新疆特色資源香青蘭植物中提取得到的一類(lèi)天然黃酮類(lèi)活性成分，具有抗氧化及防治心腦血管疾病等作用[7-9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TFDM對(duì)MIRI模型大鼠有明顯的保護(hù)作用[7]，可提高其心肌組織中腺苷三磷酸（ATP）的含量[8]，增強(qiáng)其線粒體活力以及改善其能量代謝紊亂、線粒體結(jié)構(gòu)和功能[9]。而AMPK/SIRT1/PGC-1α作為一條能量感應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，可以通過(guò)感應(yīng)機(jī)體能量及氧化應(yīng)激狀態(tài)從而在能量代謝中發(fā)揮重要作用[10-11]。因此，本研究通過(guò)考察TFDM對(duì)MIRI模型大鼠AMPK/SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路的影響，探討TFDM治療MIRI的作用機(jī)制，為T(mén)FDM防治MIRI提供潛在的治療靶點(diǎn)及理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：HX-300型動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司），Pico-17型臺(tái)式低溫離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），e2695型高效液相色譜（HPLC）儀、Alliance 2695型二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司），XL-200型低速離心儀器（江蘇海門(mén)其林貝爾儀器廠），EM-UC6型超薄型切片儀（美國(guó)Leica公司），VE-180型垂直電泳及電轉(zhuǎn)儀（上海天能科技有限公司），ChemiDoc XRS+型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio Rad公司），Rotor-Gene Q型實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（德國(guó)Qiangen公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有：TFDM提取物（批號(hào)20141008，純度57%，其中田薊苷的含量為82.53 mg/g）由新疆藥物研究所提供;Compound C（AMPK抑制劑，批號(hào)S7840，純度≥99%）、EX-527（SIRT1抑制劑，批號(hào)S1541，純度≥99%）均購(gòu)自美國(guó)Selleck公司;烏拉坦（批號(hào)20151106，純度95%）購(gòu)自武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司;ATP二鈉鹽對(duì)照品（批號(hào)SLBT6850，純度≥99%）、腺苷二磷酸（ADP）二鈉鹽對(duì)照品（批號(hào)SLBM5638V，純度≥95%）、腺苷一磷酸（AMP）鈉鹽對(duì)照品（批號(hào)BCBT3249，純度≥99%）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）對(duì)照品（批號(hào)SLBT3662，純度≥96.5%）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;兔源AMPK多克隆抗體（批號(hào)ab131512）、兔源磷酸化AMPK（p-AMPK）多克隆抗體（批號(hào)ab23875）、鼠源SIRT1單克隆抗體（批號(hào)ab110304）、兔源PGC-1α多克隆抗體（批號(hào)ab191838）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（批號(hào)10494-1-AP）購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;辣根酶素標(biāo)記山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號(hào)141987）、辣根酶素標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)140193）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量測(cè)試盒（批號(hào)A045-4）購(gòu)自南京建成生物工程研究所;聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（批號(hào)R8PA2084）、ECL發(fā)光液（批號(hào)1923101）均購(gòu)自美國(guó)Millopore公司;cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)00422714）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;組織總RNA抽提試劑盒（批號(hào)DP431）、QuantiNovaTM SYBR? Green PCR Kit熒光定量PCR試劑盒（批號(hào)154045739）均購(gòu)自德國(guó)Qiangen公司;PCR試驗(yàn)中的引物序列均由上海生工生物公司設(shè)計(jì)及合成;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)健康SD大鼠50只，雄性，體質(zhì)量230～280 g，由新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供[動(dòng)物使用合格證號(hào)為SYXK（新）2016-0001]。所有大鼠均自由攝食、飲水，并分籠飼養(yǎng)于溫度為22～25 ℃、相對(duì)濕度為40%～60%的環(huán)境中，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。本研究實(shí)驗(yàn)過(guò)程滿足動(dòng)物實(shí)驗(yàn)“3R”原則。

2 方法

2.1 分組與給藥

將50只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、TFDM組、Compound C+TFDM組和EX-527+TFDM組，每組10只。假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水;TFDM組大鼠灌胃60 mg/（kg·d）TFDM（以提取物計(jì)，下同）[8，12];Compound C+TFDM組大鼠灌胃TFDM 60 mg/（kg·d），并于再灌注前15 min尾靜脈注射250 μg/kg Compound C[13];EX-527+TFDM組大鼠灌胃TFDM 60 mg/（kg·d），并于再灌注前20 min腹腔注射5 mg/kg EX-527[14]。藥物均使用生理鹽水溶解，灌胃體積均為2.5 mL/kg，每天灌胃給藥1次，連續(xù)7 d。給藥結(jié)束后，除假手術(shù)組外的其余4組大鼠均建立MIRI模型。

2.2 大鼠MIRI模型的建立及取材

腹腔注射25%烏拉坦（5 mL/kg）將大鼠麻醉后，將其仰位固定，進(jìn)行氣管插管;沿胸骨左緣3～4肋間開(kāi)胸后，立刻連接呼吸機(jī)（呼吸頻率60次/min，潮氣量60? mL/kg，呼吸比3 ∶ 2），暴露心臟，迅速結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，結(jié)扎完成后立刻讓心臟回位;缺血30 min后，剪斷結(jié)扎線，再灌注120 min[9]。再灌注結(jié)束后，迅速剪取心臟，置于冰生理鹽水中，輕柔洗去心腔內(nèi)血液，將整顆心臟置于-80 ℃冰箱中凍存，待測(cè)。假手術(shù)組大鼠進(jìn)行同樣實(shí)驗(yàn)操作，但不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。

2.3 大鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài)觀察

采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察大鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài)變化。取大鼠心臟心尖及左心室壁進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片（厚度為5 μm）。將組織切片經(jīng)二甲苯及梯度乙醇脫蠟后，以蘇木精染色3 min，再以1%鹽酸乙醇分化30 s，然后以0.5%伊紅染色3 min，接著依次經(jīng)梯度乙醇和二甲苯進(jìn)行脫水透明，于通風(fēng)櫥中晾干后，用中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下拍照并觀察大鼠心肌組織的病理學(xué)形態(tài)變化。

2.4 大鼠心肌組織中ATP、ADP、AMP和NAD+含量測(cè)定

按照前期建立的反相HPLC法測(cè)定大鼠心肌組織中ATP、ADP、AMP、NAD+的含量[15]。取大鼠心肌組織適量，迅速稱(chēng)質(zhì)量，冰浴下按3 mL/kg的量分次加入預(yù)冷的0.5 mol/L HClO4溶液，低溫下制備組織勻漿，再于冰上靜置5 min，使蛋白充分沉淀。然后將組織勻漿液在4 ℃下以12 000 r/min離心5 min，取上清，再用2.5 mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)組織上清液的pH至中性，再次在4 ℃下以12 000 r/min離心5 min，以0.22 ?m微孔濾膜過(guò)濾，取濾液，然后按文獻(xiàn)[15]色譜條件進(jìn)樣分析。

2.5 大鼠心肌組織中AMPK、SIRT1和PGC-1α mRNA表達(dá)水平測(cè)定

采用實(shí)時(shí)熒光定量-PCR法測(cè)定大鼠心肌組織中AMPK、SIRT1和PGC-1α mRNA表達(dá)水平。取大鼠心肌組織適量，使用組織總RNA抽提試劑盒提取其總RNA，驗(yàn)證其純度后，按cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法合成cDNA，并以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（共20 μL）包括2×QuantiNova SYBR Green PCR Master mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板 2 μL，ddH2O 6? ? μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性 1 min;95 ℃ 變性10 s，60 ℃退火/延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因的表達(dá)水平。引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

2.6 大鼠心肌組織中AMPK蛋白磷酸化水平及SITR1和PGC-1α 蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

采用Western blotting法檢測(cè)大鼠心肌組織中AMPK蛋白的磷酸化水平及SITR1、PGC-1α蛋白表達(dá)水平。取大鼠心肌組織80 mg，用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取其總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白經(jīng)變性處理（99 ℃，10 min）后，取50 μg在80 V電壓下經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離90 min，濕法轉(zhuǎn)膜（200 mA，120 min）至PVDF膜上;將膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，然后分別加入AMPK一抗（稀釋比例為1 ∶ 500）、p-AMPK一抗（稀釋比例為1：1 000）、SIRT1一抗（稀釋比例為1 ∶ 1 000）、PGC-1α一抗（稀釋比例為1 ∶ 1 000）、GAPDH一抗（稀釋比例為1 ∶ 5 000），4 °C孵育過(guò)夜;以TBST緩沖液洗膜10 min×3次，然后加入相應(yīng)二抗（稀釋比例均為1 ∶ 20 000），室溫孵育1 h;以TBST緩沖液洗膜10 min×3次，采用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影后，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像。采用Image J 1.6.0軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，以p-AMPK與AMPK條帶灰度值的比值表示AMPK蛋白的磷酸化水平，以其余目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶的灰度值比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 TFDM對(duì)MIRI模型大鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài)的影響

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌膜完整，心肌纖維排列整齊、界限清晰、呈束狀分布，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則、分布均勻;模型組大鼠心肌纖維排列紊亂、橫向條紋消失，細(xì)胞腫脹破裂、壞死，細(xì)胞核變形移位;TFDM組大鼠心肌纖維排列相對(duì)整齊、界限較清晰、呈束狀分布;而Compound C+TFDM組和EX-527+TFDM組大鼠心肌組織心肌膜不完整，心肌纖維排列不緊密。各組大鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài)顯微圖見(jiàn)圖1。

3.2 TFDM對(duì)MIRI模型大鼠心肌組織中ATP、ADP、AMP和NAD+含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中ATP、NAD+含量顯著降低（P<0.01），而ADP、AMP含量顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，TFDM組大鼠心肌組織中ATP、NAD+含量顯著升高（P<0.01），ADP、AMP含量顯著降低（P<0.01）;與TFDM組比較，Compound C+TFDM組和EX-527+TFDM組大鼠心肌組織中的ATP、NAD+含量均顯著降低（P<0.01），ADP、AMP含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠心肌組織中ATP、ADP、AMP和NAD+含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 TFDM對(duì)MIRI模型大鼠心肌組織中AMPK、SIRT1和PGC-1α mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中AMPK、SIRT1和PGC-1α mRNA的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，TFDM組大鼠心肌組織中AMPK、SIRT1和PGC-1α mRNA的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與TFDM組比較，Compound C+TFDM組和EX-527+TFDM組大鼠心肌組織中AMPK、SIRT1和PGC-1 α mRNA的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。各組大鼠心肌組織中AMPK、SIRT1、PGC-1α mRNA的表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

3.4 TFDM對(duì)MIRI模型大鼠心肌組織中AMPK蛋白磷酸化及SIRT1、PGC-1α 蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中AMPK蛋白的磷酸化水平顯著升高（P<0.01），SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，TFDM組大鼠心肌組織中AMPK蛋白的磷酸化水平和SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）;與TFDM組比較，Compound C+TFDM組和EX-527+TFDM組大鼠心肌組織中AMPK蛋白的磷酸化水平和SIRT1、PGC-1α 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠心肌組織中p-AMPK、AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá)的電泳圖見(jiàn)圖2，AMPK蛋白磷酸化水平及SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

4 討論

AMPK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是一種調(diào)節(jié)生物能量代謝的核心分子，可參與多種代謝的調(diào)節(jié)過(guò)程[3，16]。相關(guān)研究顯示，心肌缺血再灌注后大鼠心肌組織明顯受損，細(xì)胞處于缺血缺氧的應(yīng)激狀態(tài)，氧供缺乏，導(dǎo)致體內(nèi)ATP生成不足、AMP含量增加，從而使AMPK被磷酸化激活[17]。活化的AMPK（即p-AMPK）可作用于多種下游底物，抑制ATP的消耗，并啟動(dòng)生成ATP的途徑以維持機(jī)體能量代謝平衡，增加細(xì)胞內(nèi)NAD+的含量，繼而使依賴(lài)NAD+的SIRT1被激活而發(fā)揮其相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)[18]。AMPK和SIRT1分別可以通過(guò)磷酸化和去乙?；饔谜{(diào)控PGC-1α的表達(dá);而PGC-1α可調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性，減少M(fèi)DA+及活性氧（ROS）的含量，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，從而保護(hù)心肌缺血性損傷[19-21]。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織明顯受損，病理形態(tài)學(xué)方面主要表現(xiàn)為心肌纖維排列紊亂、橫向條紋消失，細(xì)胞腫脹破裂、壞死，細(xì)胞核變形移位，表明MIRI模型造模成功;而TFDM組大鼠心肌組織的上述癥狀明顯改善，且TFDM能明顯提高大鼠心肌組織中ATP、NAD+的含量，降低ADP、AMP的含量，表明TFDM可通過(guò)改善缺血心肌細(xì)胞ATP的能量代謝，從而保護(hù)受損心肌。在心肌缺血缺氧時(shí)，AMPK作為“細(xì)胞能量感應(yīng)器”，可被迅速磷酸化從而發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠心肌組織中AMPK mRNA的表達(dá)水平顯著降低、AMPK蛋白的磷酸化水平顯著升高，這可能是機(jī)體代償性地產(chǎn)生了p-AMPK，以維持能量穩(wěn)定、減少損傷;此外，SIRT1、PGC-1α mRNA及其蛋白的表達(dá)水平均顯著下降，表明SIRT1、PGC-1α參與了MIRI模型大鼠心肌損傷的過(guò)程。而與模型組比較，TFDM組大鼠心肌組織中AMPK mRNA表達(dá)水平、AMPK蛋白的磷酸化水平進(jìn)一步升高，同時(shí)SIRT1、PGC-1α mRNA及其蛋白表達(dá)水平也均顯著升高，這說(shuō)明TFDM可激活A(yù)MPK通路，并上調(diào)SIRT1、PGC-1α mRNA及其蛋白的表達(dá)。

另外，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，給予抑制劑Compound C和EX-527后，可顯著逆轉(zhuǎn)TFDM對(duì)上述指標(biāo)的調(diào)節(jié)作用。Compound C是AMPK的抑制劑，有學(xué)者在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞試驗(yàn)中已驗(yàn)證過(guò)其安全性和有效性，有一定研究基礎(chǔ)[15];EX-527是SIRT1的抑制劑，其不影響細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞活力和p53調(diào)控的基因的表達(dá)，對(duì)SIRT1具有較高的選擇性[20]。本研究采用這2個(gè)通路抑制劑分別進(jìn)行處理，首先能夠更加明確、直觀地反映TFDM對(duì)AMPK/SIRT1/PGC-1α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響;其次是預(yù)測(cè)AMPK和SIRT1在對(duì)PGC-1α活性的調(diào)節(jié)中誰(shuí)占據(jù)主導(dǎo)作用。本研究結(jié)果提示AMPK/SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路參與了TFDM給藥后對(duì)MIRI模型大鼠的保護(hù)作用，但AMPK和SIRT1在此作用機(jī)制中誰(shuí)占主導(dǎo)位置尚未得到明確結(jié)論。

綜上所述，TFDM在MIRI過(guò)程中可以激活A(yù)MPK/SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路，調(diào)節(jié)能量代謝，從而發(fā)揮其對(duì)心肌組織的保護(hù)作用。

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（收稿日期：2020-11-03 修回日期：2020-12-22）

（編輯：林 靜）