鄭潔，邵素菊,2*，何竹青

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450008)

支氣管哮喘[1](簡稱哮喘)是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。世界各國支氣管哮喘流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示[2]，成人哮喘患病率為1.2%～2.5%。隨著全球經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，哮喘的發(fā)病率逐年增高，給人類的身心健康帶來巨大威脅。哮喘的病因病機(jī)復(fù)雜，至今尚未完全清楚，其中氣道慢性炎癥在哮喘發(fā)病過程中起重要作用，EOS是導(dǎo)致支氣管哮喘氣道炎癥的主要炎性細(xì)胞之一[3]，其凋亡不足或延遲使氣道內(nèi)EOS大量浸潤，加重氣道炎癥，參與哮喘發(fā)作。本實(shí)驗(yàn)所選取的肺俞、大椎、風(fēng)門，是全國名老中醫(yī)邵經(jīng)明教授總結(jié)出的防治肺系疾病的有效腧穴[4-5]。筆者在邵老的研究基礎(chǔ)上，以這3個(gè)穴位為主治療肺系疾病開展了多項(xiàng)臨床研究[6-8]，均證實(shí)了其有效性與安全性。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠哮喘模型，觀察針灸對(duì)哮喘模型大鼠肺組織中嗜酸性粒細(xì)胞凋亡的影響，以探討針灸治療哮喘的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只健康雄性SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購置于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào)：SCXK(豫)2017-0001，飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 試劑及儀器

卵蛋白(北京索萊寶科技有限公司)；氫氧化鋁干粉(上海麥克林生化科技有限公司)；水合氯醛(上海麥克林生化科技有限公司)；蘇木素-伊紅染色試劑(武漢賽維爾生物科技有限公司)；嗜酸性粒細(xì)胞染色液(北京雷根生物技術(shù)有限公司)；4%多聚甲醛、一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、抗熒光衰減封片劑(大連美侖生物技術(shù)有限公司)。

一次性毫針(“中研太和”，0.30 mm×13 mm，天津億朋醫(yī)療器械有限公司)；艾條(0.7 cm×12 cm，湖香艾生物科技有限公司)；壓縮式霧化器NE-C30(大連歐姆龍有限公司)；萬分之一電子天平BSA124S-CW、生物顯微鏡BA210、OLYMPUS熒光顯微鏡及成相系統(tǒng)U-RFL-T(河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供)。

1.3 模型建立

參考相關(guān)文獻(xiàn)中有關(guān)大鼠哮喘模型的制備[9]。在實(shí)驗(yàn)第1天和第8天，模型組和各治療組大鼠腹腔注射1 mL 10%復(fù)合卵蛋白溶液致敏，空白組用1 mL 0.9%氯化鈉溶液代替。從實(shí)驗(yàn)第15天開始，將大鼠置于自制霧化吸入箱內(nèi)，模型組和各治療組大鼠霧化噴入1%卵蛋白溶液20 min激發(fā)哮喘，每日1次，共7次?？瞻捉M用0.9%氯化鈉溶液代替激發(fā)20 min。以大鼠出現(xiàn)呼吸加快，抓耳撓腮，煩躁不安，打噴嚏，嚴(yán)重者出現(xiàn)四肢癱軟，行動(dòng)遲緩或俯伏不動(dòng)，紫紺等癥狀；連續(xù)激發(fā)后大鼠毛色變暗，失去光澤，反應(yīng)遲鈍，即為造模成功。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

將大鼠在適宜溫度、濕度和通風(fēng)良好的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，用計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)軟件產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)字表，將40只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、針刺組、艾灸組，每組10只。針刺組從實(shí)驗(yàn)第15天起，針刺大鼠“肺俞”“大椎”“風(fēng)門”3穴，其中“肺俞”直刺6 mm、“大椎”直刺5 mm、“風(fēng)門”直刺6 mm，3穴均采用平補(bǔ)平瀉手法，每10 min行針1次，留針20 min，起針后激發(fā)20 min，每日1次，共針刺7次；艾灸組從實(shí)驗(yàn)第15天起，在距離“肺俞”“大椎”“風(fēng)門”3穴上方2～3 cm處行懸灸10 min，灸畢激發(fā)20 min，每日1次，共艾灸7次；模型組按前面造模方法造模；空白組按照造模方法用0.9%氯化鈉溶液代替卵蛋白。模型組與空白組每天均給予相同的抓握刺激，不做任何治療，每日1次，共7次。

1.5 標(biāo)本取材

末次治療24 h內(nèi)，在大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛，待大鼠麻醉后，75%酒精消毒胸部皮毛，打開胸腔，暴露肺及心臟，摘取右肺中葉組織，立即用0.9%的生理鹽水沖洗干凈，然后迅速放入4%多聚甲醛中固定1周，4 ℃保存，切片待測(cè)。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)及方法

1.6.1 HE染色法觀察肺組織病理形態(tài)

62 ℃烤片30 min，二甲苯脫蠟：二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅱ5 min、二甲苯Ⅲ 10 min，梯度乙醇水化：無水乙醇Ⅰ3 min、無水乙醇Ⅱ3 min、95%酒精Ⅰ3 min、95%酒精Ⅱ3 min、90%酒精3 min，蘇木素染色5 min，1%鹽酸酒精分化2～3 s，肥皂水反藍(lán)15 min，伊紅染色8 min，梯度乙醇脫水：80%酒精1 min、90%酒精1 min、95%酒精Ⅰ1 min、95%酒精Ⅱ1 min、無水乙醇Ⅰ3 min、無水乙醇Ⅱ3 min，二甲苯透明：二甲苯Ⅰ2 min、二甲苯Ⅱ2 min，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.6.2 標(biāo)記嗜酸性粒細(xì)胞的組化染色法測(cè)量嗜酸性粒細(xì)胞總數(shù)

將HE染色步驟中蘇木素染色15 min、伊紅染色8 min換為Lea蘇木素染色1 min、Carbol 2R染色15 min，其他步驟同前。顯微鏡下觀察嗜酸性粒細(xì)胞核為藍(lán)色，通常2～3葉，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)充滿粗大、均勻的磚紅色或鮮紅色顆粒，大多數(shù)分布于支氣管與血管周圍的肺間質(zhì)中，少量分布于肺泡。每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞總數(shù)，取平均值為該切片代表值。

1.6.3 TUNEL法檢測(cè)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡率

62 ℃烤片1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，滴加Proteinase K(用PBS按1∶100比例稀釋)于肺組織37 ℃孵育30 min，暗室中滴加TUNEL檢測(cè)液[TdT Enzyme(10×)]與FITC-12-dUTP Labeling Mix按1∶9比例混合)于肺組織37 ℃孵育60 min，暗室中滴加抗熒光衰減封片劑封片。在HE染色的同一視野中計(jì)數(shù)凋亡的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)，取每張切片5個(gè)視野的均值為該切片代表值。

嗜酸性粒細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡的嗜酸性粒細(xì)胞/嗜酸性粒細(xì)胞總數(shù)×100%

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察

空白組大鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，支氣管管腔規(guī)則，支氣管及肺間質(zhì)內(nèi)未見炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠支氣管管腔明顯縮窄，氣道黏膜水腫，平滑肌及周圍血管肥大增厚，支氣管及肺間質(zhì)內(nèi)有大量嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤；針刺組與艾灸組大鼠支氣管管腔略增厚，氣道黏膜輕度水腫，支氣管及肺間質(zhì)內(nèi)有少量炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)變化(HE染色，×400)

2.2 各組大鼠肺組織內(nèi)EOS計(jì)數(shù)比較

與空白組相比，模型組大鼠肺組織內(nèi)EOS計(jì)數(shù)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，針刺組、艾灸組大鼠肺組織內(nèi)EOS計(jì)數(shù)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；針刺組與艾灸組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1和圖2。

表1 各組大鼠肺組織內(nèi)EOS計(jì)數(shù)比較個(gè))

圖2 各組大鼠肺組織內(nèi)EOS表達(dá)(標(biāo)記嗜酸性粒細(xì)胞的組化染色法，×400)

2.3 各組大鼠肺組織內(nèi)EOS凋亡率比較

與空白組相比，模型組大鼠肺組織內(nèi)EOS凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，針刺組、艾灸組大鼠肺組織內(nèi)EOS凋亡率明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；針刺組與艾灸組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2和圖3。

表2 各組大鼠肺組織內(nèi)EOS凋亡率比較

圖3 各組大鼠肺組織內(nèi)EOS凋亡率比較(TUNEL法，×400)

3 討論

氣道慢性炎癥目前被認(rèn)為是哮喘的基本病理改變和反復(fù)發(fā)作的主要原因。在哮喘的病理過程中，有嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞在氣道內(nèi)浸潤和聚集，其中EOS浸潤是氣道炎癥發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。當(dāng)EOS活化、壞死時(shí)，釋放多種毒性蛋白，合成各種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)[10]，引起上皮脫落，血漿外滲，基底膜增厚，平滑肌細(xì)胞增殖，從而損傷氣道上皮，降低氣道防御功能；并可激發(fā)自身和其他細(xì)胞釋放更多的細(xì)胞因子，從而加重氣道炎癥。所以減少氣道內(nèi)EOS浸潤，有助于氣道炎癥消退。相關(guān)研究證實(shí)[11-13]，哮喘模型大鼠肺泡灌洗液、靜脈血、肺組織中EOS水平均高于對(duì)照組。

細(xì)胞凋亡[14]是1972年病理學(xué)家Keer等首先提出，它是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束自己生命的過程，最后細(xì)胞脫落離體，或者裂解成凋亡小體，被其他細(xì)胞吞噬。EOS是哮喘發(fā)生過程中最重要的炎癥細(xì)胞，其在肺內(nèi)浸潤募集與其凋亡失衡有關(guān)。EOS凋亡后，被巨噬細(xì)胞吞噬，從而防止細(xì)胞內(nèi)毒性物質(zhì)釋放，有利于炎癥消退，減輕哮喘癥狀。戴紹文等[15]對(duì)哮喘患者行支氣管激發(fā)試驗(yàn)后，患者外周血和痰液中EOS凋亡率明顯下降，并且哮喘組患者EOS凋亡率顯著低于對(duì)照組。王明明[16]觀察到幼齡哮喘豚鼠肺泡灌洗液中存在EOS凋亡不足的現(xiàn)象。吳兆利等[17]研究發(fā)現(xiàn)，哮喘大鼠肺組織中EOS凋亡指數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組，針刺“足三里”穴后，可以促進(jìn)EOS凋亡，減輕哮喘炎性反應(yīng)。因此提高EOS凋亡可以減輕炎癥發(fā)生，緩解哮喘；當(dāng)氣道中EOS凋亡受抑制，炎癥發(fā)生則加快，從而加重哮喘。

哮喘屬“哮病”“喘證”的范疇，其病因病機(jī)復(fù)雜，但總結(jié)起來不外乎宿痰潛伏于肺，每遇風(fēng)、寒、濕等六淫外邪之侵襲；或情志失調(diào)，或飲食不節(jié)，或勞欲久病等，使臟腑功能失調(diào)，痰濁內(nèi)生，壅塞氣道，哮喘而發(fā)。本實(shí)驗(yàn)選取邵老治療哮喘經(jīng)驗(yàn)要穴，即肺俞、大椎、風(fēng)門。肺俞位于足太陽膀胱經(jīng)，為肺臟精氣輸注之處，是治療肺疾的重要腧穴，有調(diào)理肺臟、止咳平喘之功。邵老通過三因素二水平正交試驗(yàn)[18]，證實(shí)了三穴平喘作用以肺俞為最佳，從而使肺俞上升為第一主穴。大椎位于督脈，為手足三陽經(jīng)與督脈之交會(huì)穴，被稱為“諸陽之會(huì)”，具有統(tǒng)攝全身陽氣的功能，針之可溫陽散寒、降逆平喘。張偉等[19]報(bào)道懸灸大鼠“大椎”穴可降低NGF、SP、CGRP、NKA等含量，從而降低神經(jīng)源性反應(yīng)，緩解哮喘氣道炎癥。風(fēng)門位于足太陽膀胱經(jīng)，因其為風(fēng)邪出入之門戶而得名，乃搜風(fēng)要穴。針之穴可疏風(fēng)解表、宣肺平喘。三穴合用，哮喘發(fā)作期可宣肺理氣、平喘降逆；緩解期可扶正祛邪、補(bǔ)益肺氣。

本研究觀察針灸“肺俞”“大椎”“風(fēng)門”3穴對(duì)哮喘模型大鼠肺組織中EOS凋亡的影響，結(jié)果顯示，針刺組與艾灸組大鼠肺組織內(nèi)EOS凋亡率明顯高于對(duì)照組，EOS總數(shù)明顯低于對(duì)照組，說明針刺與艾灸均可以通過誘導(dǎo)EOS凋亡，減輕EOS在氣道的浸潤，從而控制哮喘炎癥反應(yīng)。