閆 茹， 馮 薇,2?， 王璽婧

(1.北京林業(yè)大學(xué)水土保持學(xué)院 寧夏鹽池毛烏素沙地生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站，100083，北京;2.北京林業(yè)大學(xué) 水土保持國家林業(yè)局重點實驗室，100083，北京； 3.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院， 102442，北京)

植被恢復(fù)是恢復(fù)不斷退化的生態(tài)系統(tǒng)和改善惡劣環(huán)境的最有效方法之一，是我國北方地區(qū)防治荒漠化的重要手段[1], 植被恢復(fù)的應(yīng)用可以有效地防止風(fēng)蝕，提高土壤肥力，改變土壤理化性質(zhì)，促進土壤形成[2]。然而，以植物固沙為主要措施的生態(tài)重建與恢復(fù)工程仍處于初步恢復(fù)階段，自我調(diào)節(jié)能力較弱，穩(wěn)定性較差極易出現(xiàn)反復(fù)[3]；因此，及時有效地監(jiān)測和評價不同沙區(qū)固沙植被的穩(wěn)定性是確保人工固沙效果實現(xiàn)沙區(qū)生態(tài)恢復(fù)的重要工作。

近年來，隨著地下生態(tài)學(xué)的深入發(fā)展，土壤真菌在植被恢復(fù)與重建過程中的作用備受關(guān)注[4-5]。一方面，在荒漠生態(tài)系統(tǒng)中，土壤真菌具有良好的抗壓性和抗旱性，可以很好地適應(yīng)嚴酷的環(huán)境條件，在貧瘠干旱的土壤中表現(xiàn)出高度多樣性和廣泛分布性[6]，并在生物多樣性保護和維持生態(tài)系統(tǒng)功能方面發(fā)揮著重要作用[7-8]。另一方面，土壤真菌作為土壤生態(tài)系統(tǒng)重要的分解者，分解轉(zhuǎn)化土壤有機質(zhì)、釋放養(yǎng)分、參與土壤物質(zhì)循環(huán)和能量流動，能敏感的反應(yīng)土壤環(huán)境變化[9]；因此，對荒漠化地區(qū)生態(tài)恢復(fù)過程中土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的深入研究，將有助于荒漠生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性的研究與保護，為評價植被恢復(fù)與重建過程中土壤質(zhì)量和土壤肥力變化提供科學(xué)依據(jù)。

土壤真菌與植物群落關(guān)系密切，土壤真菌可提高土壤養(yǎng)分利用率、降低水分消耗、調(diào)節(jié)植物多樣性和生產(chǎn)力。植物可通過根系分泌物和脫落物等物質(zhì)為真菌提供生長所需的碳源和能源，進而影響真菌的種類和數(shù)量[10]。同時，土壤真菌多樣性及其組成依賴于土壤性質(zhì)，如土壤水分、養(yǎng)分和pH值[11-12]，植物還可以通過改變土壤理化性質(zhì)間接影響土壤真菌多樣性。盡管植物對土壤真菌具有重要的生態(tài)作用，但相對于土壤細菌群落，特別是在荒漠生態(tài)系統(tǒng)中，植物種類對土壤真菌組合的影響仍然知之甚少，對于荒漠化地區(qū)不同固沙植物下是否存在特定的土壤真菌組合，目前的認識非常有限。本研究擬采用高通量18SrRNA基因測序技術(shù)對呼倫貝爾沙地3種固沙植物差巴嘎蒿(Artemisiahalodendron)、小葉錦雞兒(Caraganamicrophylla)和樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)下土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進行研究，探究土壤真菌群落對不同固沙植物的響應(yīng)，并確定哪種固沙植物更適合重建退化的呼倫貝爾沙地。

1 研究區(qū)概況

研究地點位于內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾沙地，地理坐標(biāo)為E 119°54′、N 48°50.4′。海拔670 m左右。該地區(qū)為溫帶半干旱大陸性氣候，多年平均降雨量為307.7 mm，主要降雨事件發(fā)生在6—9月。土壤類型以風(fēng)沙土為主，土壤結(jié)構(gòu)性較差，易受風(fēng)蝕。2006年以來，該地區(qū)通過人工種植固沙植被的方式，防止土壤進一步沙化。植被恢復(fù)前，該地區(qū)為半固定沙地(植被覆蓋率<15%)，干旱植被稀疏。本研究在該地區(qū)選取優(yōu)勢物種分別為差巴嘎蒿、小葉錦雞兒、和樟子松的3種植被恢復(fù)區(qū)作為研究樣地，且恢復(fù)年限均為8年左右，植被覆蓋率均在60%以上(表1)。

表1 樣地植物的基本信息

2 材料與方法

2.1 土壤樣品采集

2015年6月，在每個樣地內(nèi)，隨機設(shè)置3個20 m×20 m的樣方，各樣方間距為20 m。在每個樣方內(nèi)隨機選擇3株植物，分別在植物的東西南北4個方向采集土壤樣品，采樣前去除土壤表層枯落物，使用滅菌土鉆采集0～10 cm的表層土樣，并將每個樣地采集的土壤樣品混合為1個混合樣，用便攜式冰箱保鮮帶回實驗室。土壤樣品過2 mm篩，一部分用于土壤理化分析，另一部分放置-40 ℃超低溫冰箱保存，用于高通量測序送檢。共采集土壤混合樣品9個(3種植物×3個重復(fù))。

2.2 土壤理化性質(zhì)分析

土壤水分采用烘干法(105 ℃干燥24 h)。土壤pH值采用土水比為1∶2.5的土壤浸提液進行測定。土壤有機碳、全氮、水解性氮、全磷和有效磷分別采用重鉻酸鉀氧化外加熱法、半微量凱氏法、堿解擴散法、酸溶-鉬銻抗比色法和NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定。土壤酶活性使用過1 mm篩的風(fēng)干土進行測定，蔗糖酶活性、脲酶活性、過氧化氫酶活性和磷酸酶活性分別采用菲林滴定法、苯酚鈉-次氯酸鈉比色法、KMnO4滴定法和磷酸苯二鈉比色法測定。

2.3 土壤DNA提取和高通量測序

稱取0.2 g新鮮土壤樣品，使用E.Z.N.A.Soil DNA Kit試劑盒，按照說明書要求提取土壤微生物的DNA，并使用Qubit2.0熒光計檢測DNA濃度，瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性。使用PCR擴增儀，對土壤真菌18SrRNA基因V4區(qū)進行PCR擴增。PCR所用的引物為V43NDF(CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN (barcode) GGCAAGTCTGGTGCCAG)和Euk_V4_R(GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAG-AATTCCAACGGTATCTRATCRTCTTCG)。PCR產(chǎn)物檢測合格后，使用Miseq測序平臺進行測序。對測序原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控、篩選和拼接，以97%的相似性將所有樣品的有效序列數(shù)據(jù)聚類為OTUs(操作分類單元，operational taxonomic units)。使用RDP classifier軟件和Silva數(shù)據(jù)庫獲取OTUs的物種注釋信息。對所有樣品數(shù)據(jù)進行均一化處理，得到OUT豐度數(shù)據(jù)以及微生物多樣性數(shù)據(jù)。測序服務(wù)委托上海生工生物工程股份有限公司完成。

2.4 數(shù)據(jù)處理

使用JMP(11.0.0)統(tǒng)計分析軟件，對數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析和單因素方差分析；使用OriginPro 2015繪制土壤真菌群落組成圖；使用OmicShare Tools 云平臺進行冗余分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 土壤理化性質(zhì)及酶活性

分析不同固沙植物下土壤理化性質(zhì)表明，除土壤含水量無顯著差異外，其他土壤性質(zhì)均有顯著差異(表2)。土壤全氮和堿解氮在樟子松和小葉錦雞兒下的質(zhì)量分數(shù)顯著高于差巴嘎蒿(P<0.05)，土壤有機碳和速效磷在樟子松下的質(zhì)量分數(shù)顯著高于小葉錦雞兒和差巴嘎蒿(P<0.05)，而土壤全磷在差巴嘎蒿下的質(zhì)量分數(shù)和pH值顯著高于樟子松。此外，不同固沙植物下土壤酶活性亦存在顯著差異(P<0.05)。樟子松下土壤磷酸酶和土壤過氧化氫酶的活性顯著高于小葉錦雞兒和差巴嘎蒿。小葉錦雞兒下蔗糖酶活性顯著高于其他固沙植物，土壤脲酶活性在3種固沙植物下無顯著差異。

3.2 土壤真菌群落多樣性及結(jié)構(gòu)組成

對12個樣地的土壤樣品所得測序序列，以97%相似性閥值進行OUT聚類，獲得151條真菌群落結(jié)構(gòu)組成信息。通過分類鑒定可知，真菌包含9門22綱44目55科63屬。用ACE和Chao1指數(shù)估計真菌的分類學(xué)豐富度即物種數(shù)量多少，用Shannon和Simpson指數(shù)分析真菌群落的多樣性(圖1)。結(jié)果表明3種植被類型的分類學(xué)豐富度無明顯差異(P<0.05)，但小葉錦雞兒的多樣性比差巴嘎蒿和樟子松的低(P<0.05)。土壤真菌在門分類水平下，主要類群有子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、隱真菌門(Cryptomycota)和球囊菌門(Glomeromycota)，其中子囊菌門在3種固沙植物下的相對豐度均>65%(圖2a)，且在門水平上不同固沙植物間土壤真菌的相對豐度無顯著差異。在綱分類水平下，主要類群有座囊菌綱(Dothideomycetes)、壺菌綱(Chytridiomycetes)、盤菌綱(Pezizomycetes)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、傘菌綱(Agaricomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、球囊菌綱(Glomeromycetes)，在小葉錦雞兒下座囊菌綱的相對豐度顯著高于樟子松，而盤菌綱和散囊菌綱的相對豐度顯著低于樟子松(P<0.05;圖2b)。在屬水平上，相對豐度>1%的優(yōu)勢屬有9個(圖2c)。其中樟子松下相對豐度最高的屬是踝節(jié)菌屬(Talaromyces)和毛殼菌屬(Chaetomium)，小葉錦雞兒下豐度最高的屬是Boeremia和Paraphaeosphaeria，差巴嘎蒿下相對豐度最高的屬是旋孢腔菌屬(Cochliobolus)。不同固沙植物間無顯著差異的屬有毛霉屬(Mucor)、假裸囊菌屬(Pseudogymnoascus)、Fimicolochytrium、乳牛肝菌屬(Suillus)。

表2 不同固沙植物土壤理化性質(zhì)和土壤酶活性

圖1 不同固沙植物土壤真菌群落多樣性Fig.1 Diversities of fungi community under different sand-fixing plants

圖2 不同固沙植物土壤真菌群落組成Fig.2 Composition of fungi community under different sand-fixing plants

3.3 土壤性質(zhì)對土壤真菌群落的影響

如圖3所示，通過冗余分析(redundancy analysis，RDA)發(fā)現(xiàn)，所有的環(huán)境變量共可解釋90.06%(RDA1: 67.13%; RDA2: 22.93%)的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的變化。土壤有機碳與第1排序軸相關(guān)性最大(相關(guān)系數(shù)為-0.446 13)，土壤速效磷與第2排序軸相關(guān)性最大(相關(guān)系數(shù)為0.999 85)，表明土壤有機碳和速效磷是解釋土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。差巴嘎蒿主要分布在第3象限，各樣品組內(nèi)之間距離較近，與土壤含水量和全磷呈正相關(guān)，表明該樣地中土壤含水量和全磷是驅(qū)動土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素；樟子松主要分布在第2象限，各樣品組內(nèi)之間距離較近，與土壤有機碳和速效磷呈正相關(guān)，表明該樣地中土壤有機碳和速效磷是驅(qū)動土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素；小葉錦雞兒樣品主要分布在第1和第4象限，各樣品組內(nèi)之間距離較遠，表明該樣地土壤真菌的生態(tài)位較為分化，受多種土壤養(yǎng)分的影響。結(jié)合組間相似性分析表明，3種固沙植物土壤真菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著差異(P<0.05；表3)。

SWC: 土壤含水量 Soil moisture content. SOC: 有機碳 Soil organic carbon. TN: 全氮 Total nitrogen. TP: 全磷 Total phosphorus. HN: 堿解氮 Hydrolytic nitrogen. AP:速效磷 Available phosphorus. 圖3 土壤性質(zhì)與真菌關(guān)系冗余分析的二維排序Fig.3 Ordination diagram for redundancy analysis of relationship between soil properties and fungi

表3 組間相似性分析

4 討論

土壤真菌具有良好的抗壓性和抗旱性，可以很好地適應(yīng)荒漠生態(tài)系統(tǒng)等土壤養(yǎng)分和水分受限制的環(huán)境條件[6-7]。植被恢復(fù)重建后，土壤水分狀況得到改善，根系分泌物及枯落物分解促使土壤有機質(zhì)增加，有利于增加土壤真菌數(shù)量及多樣性[13]。本研究中不同固沙植物建設(shè)后，樟子松下的土壤全氮、堿解氮、有機碳和速效磷等表征土壤養(yǎng)分的指標(biāo)均高于小葉錦雞兒和差巴嘎蒿，表明樟子松在沙區(qū)植被恢復(fù)中更利于土壤養(yǎng)分恢復(fù)及土壤肥力的提高。然而，不同固沙植物下土壤真菌豐富度并無顯著差異(圖1)，可能因為土壤真菌具有較寬的生態(tài)位，不同固沙植物間土壤養(yǎng)分的差異并未造成真菌物種數(shù)量的改變，只是改變了物種的多樣性(圖1)。

呼倫貝爾沙地土壤中主要的真菌類群有子囊菌門、接合菌門、壺菌門、擔(dān)子菌門、隱真菌門和球囊菌門，其中子囊菌門在3種固沙植物下的相對豐度均>65%(圖2a)，這與毛烏素沙地、庫布齊沙漠、騰格里沙漠和烏蘭布和沙漠的調(diào)查結(jié)果一致[14-15]。大約98%的已知真菌種類屬于子囊菌門或擔(dān)子菌門，由于子囊菌比擔(dān)子菌具有更快的進化速度和更豐富的物種[16]，且子囊菌的進化主要受建立者效應(yīng)的影響具有較強的抗壓性，因此在干旱、缺水生存條件惡劣的沙地，子囊菌比擔(dān)子菌更適于生存。

子囊菌門中相對豐度較高的4個綱為座囊菌綱、散囊菌綱、盤菌綱和糞殼菌綱(圖2b)。這4種真菌類群多數(shù)是腐生菌，具有較強的耐受性且在生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)過程中起著重要的作用，是植物生物量的降解者[7]，但有研究表明4種真菌類群的進化速率不同，糞殼菌綱最快，散囊菌綱次之，座囊菌綱和盤菌綱最慢[16]。本研究中，在樟子松下散囊菌綱和盤菌綱的相對豐度最高，小葉錦雞兒下座囊菌綱的相對豐度最高，糞殼菌綱的相對豐度在三者間無顯著差異(圖2b)，表明樟子松下土壤真菌具有更快的進化速率，能促進土壤有機質(zhì)分解，加快土壤碳循環(huán)過程，促進土壤有機碳的積累。

從屬水平來看樟子松下相對豐度較高的屬有踝節(jié)菌屬和毛殼菌屬(圖2c)。其中踝節(jié)菌屬是一種重要的真菌拮抗劑即土壤病原菌的生物防治劑，同時它具有產(chǎn)生磷酸酶和可溶性色素的能力[17]；毛殼菌是一種土壤病原菌生物防治劑，亦是一種常見的土壤殖民者和纖維素生產(chǎn)者，具有降解纖維素和其他有機物質(zhì)的能力[18]。其他具有顯著差異的屬有Boeremia、Paraphaeosphaeria和旋孢腔菌屬(圖2c)。其中，Boeremia和旋孢腔菌屬是一類病原菌[19]；Paraphaeosphaeria屬能產(chǎn)生抗真菌物質(zhì)和溶菌作用，殺死病原菌的菌絲體和菌核，在植物菌核病的生物防治方面發(fā)揮重要作用[20]。以上結(jié)果表明，從屬水平來看樟子松下的真菌群落組合有利于磷酸酶的產(chǎn)生及纖維素等土壤有機質(zhì)的降解。

土壤酶直接參與著土壤中許多重要的生物化學(xué)循環(huán)，土壤酶活性可以反映土壤肥力狀況及微生物數(shù)量[21]。分析比較不同固沙植物下土壤酶活性發(fā)現(xiàn)，樟子松下土壤磷酸酶和過氧化氫酶的活性顯著高于小葉錦雞兒和差巴嘎蒿。土壤磷酸酶活性影響著土壤有機磷的分解轉(zhuǎn)化及其生物有效性，土壤過氧化氫酶影響土壤有機質(zhì)的轉(zhuǎn)化體現(xiàn)了土壤腐殖質(zhì)化水平[22]。結(jié)合上述結(jié)果，樟子松下相對豐度較高的踝節(jié)菌屬具有產(chǎn)生磷酸酶的能力、毛殼菌具有降解纖維素和其他有機物質(zhì)的能力以及散囊菌綱和盤菌綱具有較快的進化速率使土壤磷含量增加，表明樟子松下土壤真菌群落在土壤磷的轉(zhuǎn)化與利用和土壤有機質(zhì)的分解與利用兩個方面優(yōu)于小葉錦雞兒和差巴嘎蒿，且踝節(jié)菌屬可能是產(chǎn)生磷酸酶的主要類群。此外，有研究表明人工固沙植被建立后土壤酶活性恢復(fù)速率不同，不同土壤酶恢復(fù)速率依次為多酚氧化酶、過氧化氫、淀粉酶、酸性磷酸酶、纖維素酶、蔗糖酶和尿酶[23-24]。因此，土壤磷酸酶和過氧化氫酶活性較高，亦能表明樟子松下土壤恢復(fù)的效果更好。

分析影響土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的因素發(fā)現(xiàn)，不同固沙植物下的樣品距離較近且不同固沙植物樣品間具有顯著差異(圖3，表3)，這一結(jié)果進一步證實不同固沙植物的建設(shè)會影響土壤真菌群落組成及結(jié)構(gòu)。以往研究表明，與受土壤參數(shù)影響較大的細菌不同，真菌的組成與植物的關(guān)系更為密切。一方面，由于真菌體積較大，移動性差，群落分布明顯受到空間限制，土壤真菌活性常常與根系或大營養(yǎng)斑塊緊密聯(lián)系[25]。另一方面，真菌多數(shù)作為分解者且多數(shù)的植物殘體分解酶由真菌產(chǎn)生，其數(shù)量和結(jié)構(gòu)易于受到植物殘體的影響[26]。此外，本研究表明土壤有機碳和速效磷是影響土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。以往研究發(fā)現(xiàn)，土壤碳儲量的變化取決于土壤真菌群落組成的變化，而不是碳含量影響真菌群落[27]。土壤真菌作為土壤微生物的重要組成部分，其本身生物量就是土壤有機碳庫的重要組成部分[28]。土壤真菌及其龐大的菌根菌絲亦是土壤呼吸的主要貢獻者之一，并且它們還可通過保護團聚體中的有機碳不被侵蝕，從而抑制土壤碳的釋放，促進土壤碳的積累[29-30]。因此，本研究中不同固沙植物下土壤有機碳含量的不同，可能是由于它們具有不同的真菌組合，而樟子松下的土壤真菌組合更利于土壤有機碳的積累。土壤中磷的移動性很差，只能通過擴散過程到達根系表面，導(dǎo)致根際磷脅迫[31]，叢枝菌根真菌與植物根系建立共生關(guān)系后，菌絲通過分泌有機酸、磷酸酶和鐵載體等方式提高根際有效磷濃度以滿足植物對磷的需求[32]。因此，不同的真菌組合會影響土壤磷的轉(zhuǎn)化和利用，而不同植物種會影響真菌組合的數(shù)量和多樣性，本研究中樟子松下較高的土壤速效磷的含量表明樟子松下的土壤真菌組合具有較高的磷元素的轉(zhuǎn)化能力，可提高土壤磷的植物利用率。由此可見，本研究中土壤有機碳與土壤速效磷對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的解釋，實則為不同固沙植物下不同的土壤真菌組合具有不同的碳轉(zhuǎn)化和磷轉(zhuǎn)化能力，使土壤有機碳和速效磷含量發(fā)生變化，表明土壤真菌群落結(jié)構(gòu)對不同的植被類型表現(xiàn)出明顯的敏感性，具有調(diào)控土壤碳磷循環(huán)的潛力。然而，不同固沙植物下具體是哪些真菌組合在發(fā)揮著促進碳循環(huán)和磷循環(huán)的功能特性，還需要未來通過宏基因組測序技術(shù)和同位素標(biāo)記等技術(shù)進一步探究。

5 結(jié)論

呼倫貝爾沙地不同固沙植物下的優(yōu)勢真菌類群有子囊菌門、接合菌門、壺菌門、擔(dān)子菌門、隱真菌門和球囊菌門，植被類型的不同顯著影響真菌群落的相對豐度。呼倫貝爾沙地3種不同固沙植物中，樟子松下土壤磷酸酶和土壤過氧化氫酶的活性約為差巴嘎蒿和小葉錦雞兒的2倍，具有較強的土壤有機磷和有機質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化能力。另外，樟子松下散囊菌綱(0.032 4%)、盤菌綱(0.074 4%)、踝節(jié)菌屬(0.030 7%)和毛殼菌屬(0.068 7%)的相對豐度顯著高于差巴嘎蒿(0.009 4%、0.054 9%、0.008 5%和0.033 1%)和小葉錦雞兒(0.003 2%、0.008 9%、0.002 5%和0.019 8%)，具有較好的碳循環(huán)潛力；因此，從土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的角度來看，樟子松在固定移動沙丘和提高土壤肥力方面是較為適宜的樹種。