何燕超，張靜，馮凈凈，揭志軍

1. 復旦大學附屬上海市第五人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200240； 2. 復旦大學社區(qū)健康研究中心(籌)，上海 200240

甲型H1N1流感病毒(簡稱H1N1)是最常見的呼吸道病毒，呈季節(jié)性流行，部分H1N1感染可進展為重癥，出現(xiàn)病毒性肺炎，進展速度快，早期即可出現(xiàn)呼吸衰竭，病死率高。目前研究發(fā)現(xiàn)，H1N1重癥感染可能與過度的炎癥反應相關，但具體作用機制仍不明確[1]。

缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1α是一種異源二聚體，由α和β 2個亞基組成。HIF-1α主要存在于細胞質(zhì)內(nèi)，而HIF-1β存在于細胞核內(nèi)。生理狀態(tài)下HIF-1α會被脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylases，PHDs)識別并迅速泛素化進而降解。缺氧狀態(tài)下PHDs活性受抑制，導致HIF-1α水平升高，HIF-1α可轉(zhuǎn)移到核內(nèi)與HIF-1β結(jié)合形成活性HIF-1，繼而作用于DNA激活一系列反應[2]。目前，HIF-1α已被證明可以參與血管生成、內(nèi)皮細胞分化及纖維化，其與腫瘤的發(fā)病及自身免疫性疾病的活動密切相關。而HIF-1α在呼吸道病毒感染中的相關研究較少，尚不明確其作用[3-4]。近年來，一些動物研究發(fā)現(xiàn)，機體感染H1N1后，即使在不缺氧的炎癥狀態(tài)下亦可誘導肺HIF-1α水平升高，因此推測HIF-1α可能參與了H1N1感染的炎癥反應[5-6]。鑒于此，本研究檢測肺巨噬細胞感染H1N1后HIF-1α、干擾素(interferon，IFN)-γ、白細胞介素(interleukin，IL)-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α和M蛋白(M protein，MBP)的變化，并將HIF-1α活性抑制后，檢測IL-6、TNF-α相關通路核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、促分裂原活化的蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)等蛋白的表達變化，探討HIF-1α在H1N1感染誘導的炎癥反應中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和病毒小鼠巨噬細胞系(RAW264.7)、犬腎細胞系(MDCK)、流感病毒A/PR/8(H1N1)病毒株來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)。

1.1.2 試劑實時聚合酶鏈反應(real-time polymerase chain reaction，real-time PCR)試劑盒、Trizol、RNA溶解液購自北京全式金生物技術有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜、標準蛋白質(zhì)溶液(BSA)、噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自上海碧云天生物技術有限公司；HIF-1α抗體、NF-κB抗體、MAPK抗體、Akt抗體、MBP抗體、β-actin抗體購自美國Affinity公司；羊抗鼠-HRP購自中國索萊寶公司；蛋白marker購自美國Thermo Scientific 公司；2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-MeOE2)購自美國Selleck Chemicals公司。

1.1.3 主要儀器生物倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；臺式低速離心機購自上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設備廠；離心機、熒光定量PCR儀購自德國Eppendorf公司；低溫(4 ℃)離心機、酶標儀購自德國Thermo公司；電泳儀購自中國君意公司。

1.2 方法

1.2.1 H1N1 PR8病毒懸液的制備此操作在生物安全二級(biosafety level 2，BSL-2)實驗室完成，復蘇MDCK細胞，加入細胞培養(yǎng)基(90% MEM細胞培養(yǎng)液+10%小牛血清)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)2代，將H1N1 PR8病毒原液稀釋后用T25細胞瓶接種于MDCK細胞，用40×物鏡每日觀察細胞的生長狀態(tài)。當75%～100%細胞出現(xiàn)病變時，反復凍融2次，用10 mL 無菌移液管吸取病毒液置于15 mL無菌離心管中，混勻病毒。收獲的病毒液用半數(shù)組織培養(yǎng)物感染量(50% tissue culture infectious dose，TCID50)法測定病毒懸液的毒力：將病毒液作連續(xù)10倍稀釋，計算各組出現(xiàn)陽性孔率。lgTCID50=L-D(S-0.5)，L：最高濃度稀釋度的對數(shù)，D：稀釋對數(shù)之間的差，S：陽性孔比率總和。將病毒液凍于 -80 ℃冰箱待后續(xù)實驗使用。

1.2.2 H1N1PR8感染細胞復蘇RAW264.7細胞，加入細胞培養(yǎng)基(90% MEM細胞生長液+10%小牛血清)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)2代后接種于12孔板，設3個復孔，用H1N1PR8感染細胞，調(diào)整感染復數(shù)(multiplicity of infection, MOI；MOI是指病毒感染單位數(shù)與細胞數(shù)的比值)為1，分別在0、6、12、24、48 h后收集細胞，提取總蛋白及RNA待檢測。以感染滅活H1N1PR8的RAW264.7細胞為對照組。

1.2.3 H1N1PR8感染抑制試驗復蘇RAW264.7細胞傳代培養(yǎng)(方法同感染實驗)2代后接種于12孔板，設3個復孔，應用H1N1PR8(MOI=1)感染細胞，同時加入HIF-1α抑制劑 2-MeOE-2 (10 nmol/L)，培養(yǎng)細胞24 h，對照組加入蛋白酶體抑制劑對照品。

1.2.4 PCR檢測細胞因子mRNA水平收集細胞加入1 mL Trizol、200 μL氯仿振蕩裂解細胞提取RNA，用異丙醇沉淀、乙醇清洗，再加入適量RNA溶解液溶解沉淀物，運用兩步法實時PCR進行反轉(zhuǎn)錄RNA并擴增(95 ℃ 3 min、95 ℃ 30 s+55 ℃ 20 s 40個循環(huán)、72 ℃ 20 s；95 ℃ 15 s+60 ℃ 15 s；20 min升溫 95 ℃ 15 s)，具體引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot, WB)檢測關鍵蛋白將蛋白裂解液加入經(jīng)胰酶消化的各組細胞以提取蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。每孔上樣100 μg細胞總蛋白，經(jīng)分離膠凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜(條件：4 ℃，100 V/100 mA)，用含3% 標準蛋白質(zhì)溶液(BSA)的封閉液浸泡PVDF膜，置室溫搖床封閉2 h。分別加入HIF-1a抗體、β-actin抗體、NF-κB抗體、MAPK抗體、AKT抗體、MBP抗體4 ℃孵育過夜，洗去多余抗體；加入羊抗鼠-HRP置室溫孵育2 h，洗去多余抗體(同前)；經(jīng)底物化學發(fā)光反應后用X線膠片壓片，依次放入顯影液顯影。

1.2.6 細胞存活和生長實驗(MTT比色法)用10%胎牛血清懸浮細胞，將細胞接種到96孔板，104個/孔，設3個復孔，給予H1N1 PR8(MOI=1)感染細胞(抑制試驗需加入2-MeOE-2)；在培養(yǎng)0、6、12、24、48 h后每孔加入MTT溶液(儲存濃度5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)在37 ℃，CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸除上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min使結(jié)晶物充分融解；選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，繪制細胞生長曲線。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 H1N1感染巨噬細胞后的表型變化

H1N1 PR8感染小鼠巨噬細胞RAW264.7后，在顯微鏡下觀察可見其在感染后6 h即出現(xiàn)細胞聚集現(xiàn)象，感染后24 h見壞死細胞增多，細胞量減少，感染后48 h見壞死細胞明顯增多，細胞量明顯減少。H1N1 PR8-MBP mRNA水平變化基本與細胞病變表現(xiàn)一致，其在感染后24 h達到高峰，到48 h 開始下降。MTT細胞生長實驗結(jié)果顯示，感染后12 h小鼠巨噬細胞RAW264.7吸光值較于正常對照開始顯著下降。具體結(jié)果如圖1、圖2所示。

A: 0 h post infection. B: 6 h post infection. C: 12 h post infection. D: 24 h post infection. E: 48 h post infection. F: Virus titer of PR8 infect RAW264.7. Note: compared with 0 HPI, *P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001; HPI: hour post infection.

A: Compared with un-infected group. B: Compared with 0 HPI.

2.2 H1N1感染巨噬細胞后HIF-1α及炎癥因子mRNA水平增高

通過PCR檢測H1N1 PR8感染小鼠巨噬細胞RAW264.7后HIF-1α及其他細胞因子mRNA表達水平的變化，發(fā)現(xiàn)HIF-1α在感染后6 h開始升高，感染后12 h迅速上升，24 h達到峰值。IFN-γ、IL-6、TNF-α變化趨勢基本與HIF-1α一致，在感染6 h開始升高，感染24 h達到高峰，但在感染12 h并未進入快速上升期。具體結(jié)果如圖2所示。

2.3 H1N1感染巨噬細胞后HIF-1α蛋白及NF-κB通路蛋白表達增高

通過WB進一步檢測了H1N1 PR8感染小鼠巨噬細胞RAW264.7后HIF-1α及炎癥相關信號通路蛋白表達變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1α蛋白在感染后6 h明顯增多，24 h達到峰值，與mRNA水平變化基本一致。NF-κB通路蛋白在感染后12 h明顯增多，48 h開始減少，而MAPK、AKT等通路蛋白并未見顯著變化。另外，檢測RAW264.7細胞內(nèi)H1N1PR8的MBP水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在12 h開始增多，24 h達到峰值，結(jié)果與其mRNA變化基本一致。結(jié)果如圖3所示。

Note: NF-κB, nuclear factor-κB; MBP, PR8 M protein; MAPK, mitogenactivated protein kinase; HIF-1a, hypoxia inducible factor-1a; AKT, phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B; ACTB, β-actin.

2.4 HIF-1α蛋白與參與炎癥反應

在給予小鼠巨噬細胞感染H1N1的同時，加入2-MeOE-2(10 nmol/L)/蛋白酶體抑制劑對照品，培養(yǎng)細胞24 h，在顯微鏡下觀察可見加入抑制劑組(簡稱實驗組)細胞數(shù)量較加入蛋白酶體抑制劑對照品組(簡稱對照組)多，壞死細胞亦較對照組少，MTT細胞生長實驗亦顯示實驗組吸光度值高于對照組。同時，通過PCR檢測炎癥因子mRNA的水平，發(fā)現(xiàn)實驗組IL-6、TNF-α等炎癥因子的mRNA水平較對照組顯著下降(P<0.05)。另外，IFN-γ及MBP mRNA的水平亦有下降(P<0.05)。結(jié)果如圖4所示。

A: Co-culture with placebo 24 h post infection. B: Co-culture with 2-MeOE-2 24 h post infection. C: The changes of HIF-1α、IFN-γ、IL-6、TNF-α and M-protein mRNA level when co-culture with 2-MeOE-2. D: The change of cell growth when co-culture with 2-MeOE-2.

2.5 HIF-1α可通過NF-κB通路促進炎癥反應

重復上述試驗，進一步通過WB檢測發(fā)現(xiàn)實驗組NF-κB通路蛋白表達下降，而MAPK、AKT等通路蛋白無變化，同時發(fā)現(xiàn)H1N1PR8的MBP亦表達減少。另外， 2-MeOE-2可在細胞感染后 24 h 顯著抑制HIF-1α蛋白表達。結(jié)果如圖5所示。

Note: NF-κB, nuclear factor-κB; MBP, PR8 M protein; MAPK, mitogenactivated protein kinase; HIF-1α, hypoxia inducible factor-1α; AKT, protein kinase B; ACTB, β-actin; 24 h: co-culture with placebo 24 h post infection; 24 h+2-MeOE-2: co-culture with 2-MeOE-2 24 h post infection.

3 討論

全球每年有300萬～500萬嚴重流感病例。據(jù)美國疾病預防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)調(diào)查，2019—2020年流感季中有 1 900 萬人感染流感病毒，至少有1萬人死亡[7]。流感病情嚴重程度與其誘導的過度炎癥反應密切相關，但其具體機制尚不明確。因此，本研究從 HIF-1α 參與H1N1誘導炎癥反應機制的角度出發(fā)，探索其炎癥反應機制。已有研究論證巨噬細胞一方面可以吞噬并識別流感病毒，從而分泌 IL-6/TNF-α等炎癥因子誘導炎癥反應；另一方面，它也可以直接分泌IFN-γ等，具有直接抗病毒的作用[8-9]。因此，本研究建立流感病毒感染巨噬細胞模型，探索HIF-1α在其中誘導炎癥反應的機制。

本研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞感染流感病毒后6 h出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，12 h出現(xiàn)細胞壞死現(xiàn)象，48 h可見大量細胞壞死。由MTT細胞生長曲線結(jié)果可知，巨噬細胞感染H1N1PR8后12 h生長受抑制，48 h明顯受抑制。進一步研究發(fā)現(xiàn)，病毒復制率在24 h達到高峰，IFN-γ、IL-6、TNF-α mRNA表達水平與病毒復制率基本一致。這些結(jié)果說明巨噬細胞可分泌IFN-γ抗病毒，同時可分泌IL-6、TNF-α 參與炎癥反應。其他一些動物研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致。Halstead等[9]研究發(fā)現(xiàn)小鼠感染H1N1PR8后可促進M1型巨噬細胞分化，促進炎癥反應，同時亦可誘導巨噬細胞分泌IFN-γ；Xu和Liu[10]進一步研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞感染H1N1PR8后可通過NF-κB通路誘導炎癥反應。本研究中HIF-1α mRNA水平相對IL-6、TNF-α等炎癥因子更早升高，說明 HIF-1α 可能更早參與流感病毒誘導的炎癥反應。在蛋白水平檢測HIF-1α，發(fā)現(xiàn)其在6 h即開始顯著上升，24 h達到最高峰。HIF-1α、IFN-γ、IL-6、TNF-α 等在48 h表達下降，可能與流感病毒感染巨噬細胞導致壞死相關。之前篩查細胞感染病毒后NF-κB、APK、AKT等炎癥相關通路蛋白[11-13]表達在上述時間點變化，發(fā)現(xiàn)NF-κB通路蛋白在感染12 h開始增高。這可能說明，NF-κB通路是HIF-1α的通路蛋白，此結(jié)果與Xu和Liu[10]的研究結(jié)果一致。目前，關于HIF-1在流感領域的研究較少。Guo等[14]給予肺上皮細胞A549、單核細胞THP-1不同滴度的H1N1PR8感染，24 h后收樣，并未發(fā)現(xiàn)HIF-1α mRNA在感染后有變化，進一步研究發(fā)現(xiàn)A549、THP-1細胞感染流感病毒后，HIF-1α轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)量增多，這與本研究得到的結(jié)果有相似之處。

因各類蛋白在24 h變化最明顯，本研究選擇在感染24 h加入HIF-1α抑制劑2-MeOE-2，發(fā)現(xiàn)加入2-MeOE-2后壞死細胞數(shù)較單純感染組明顯減少；在mRNA水平，IL-6、TNF-α、IFN-γ、MBP等均有明顯下降；在蛋白水平，NF-κB、MBP表達均有下降。結(jié)果表明，HIF-1α通過NF-κB通路上調(diào)IL-6、TNF-α等參與H1N1誘導的炎癥反應。MBP蛋白受抑制可能為炎癥反應受抑制的間接表現(xiàn)，不能說明HIF-1α有直接抗病毒作用。本研究得到的結(jié)論仍有其局限性，須通過更進一步的動物試驗及臨床檢測結(jié)果來驗證。

綜上所述，H1N1感染后巨噬細胞中的HIF-1α可直接誘導炎癥反應的產(chǎn)生，其途徑可能是通過激活NF-κB通路促進IL-6、TNF-α等炎癥因子的分泌參與炎癥反應。在本研究的細胞試驗中，HIF-1α展現(xiàn)出良好的前景，可能為流感治療提供一個新視點。