曹妙，蘇珊，葉玲，陸路，楊慶來，姜世勃

1. 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)健委/醫(yī)科院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 200032； 2. 埃默里大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)系埃默里疫苗中心， 美國亞特蘭大 GA30322

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)分為 1型和2型，是一種雙股正鏈RNA病毒，隸屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬，可在受體(CD4)和輔助受體(CCR5或CXCR4)的介導(dǎo)下通過膜融合的方式感染免疫細(xì)胞，并破壞人體免疫系統(tǒng)，最終引起獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS，即艾滋病)，甚至導(dǎo)致死亡[1-2]。據(jù)聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署(United Nations AIDS Program, UNAIDS)報(bào)道(1)數(shù)據(jù)來源于http://www.unaids.org/。，截至2019年底，HIV累計(jì)造成約 3 300 萬人死亡；全球現(xiàn)存HIV感染者約 3 800 萬，每年新感染人數(shù)約為170萬，每年與HIV感染有關(guān)的死亡人數(shù)約為69萬。

疫苗是控制傳染病傳播的重要措施。據(jù)數(shù)學(xué)模型統(tǒng)計(jì)分析預(yù)測，在保持當(dāng)前診斷和治療條件不變的情況下，如果從2020年開始70%的人群接種保護(hù)率達(dá)到50%的HIV疫苗，那么到2035年將保護(hù) 1 700 萬人免受HIV感染[3]。然而，在過去的40年里，盡管全球在研究HIV疫苗方面做出了大量的努力，但至今仍未能研發(fā)出一種有效的HIV疫苗[4]。HIV疫苗研發(fā)失敗與其包膜蛋白序列高度可變性和高度糖基化的特性有關(guān)，即高度可變序列導(dǎo)致病毒對機(jī)體產(chǎn)生的HIV中和抗體發(fā)生免疫逃逸，而糖基化則為一些保守的表位提供庇護(hù)，使其不能被免疫系統(tǒng)識別而難以誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生[5]。

與HIV-2相比，HIV-1具有更強(qiáng)的毒力和感染性，HIV-1的包膜蛋白gp120和gp41是暴露在病毒顆粒表面的主要抗原，上面有許多能夠被廣譜中和抗體識別的位點(diǎn)，如gp120的CD4結(jié)合位點(diǎn)[6-7]、gp120的V1V2環(huán)[8]、gp120的V3聚糖[9]以及位于gp41胞外域C末端的近膜端外部區(qū)域(membrane-proximal external region, MPER)[10-12]，它們是研發(fā)疫苗的關(guān)鍵免疫原。與包膜蛋白上的其他位點(diǎn)相比，gp41的MPER(660LLELDKWASLWNWFD-ITNWLWYIK683)在疫苗設(shè)計(jì)上具有更大的吸引力。然而，由于MPER免疫原性比較差，旨在誘導(dǎo)MPER特異性中和抗體產(chǎn)生的疫苗策略迄今為止均未成功[13-21]。在HIV-1包膜蛋白的天然構(gòu)象中，gp41總是被空間位阻比較大的gp120覆蓋，導(dǎo)致gp41上的免疫表位，尤其是MPER表位難以被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識別[22]。去除gp120雖然可以有效暴露gp41上的免疫表位，但單獨(dú)的gp41或MPER多肽卻無法模擬包膜蛋白的天然構(gòu)象，且誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體亦沒有中和活性[21]；而在沒有g(shù)p120存在的情況下，gp41的N末端七肽重復(fù)域(N-terminal heptad repeat, NHR)和C末端七肽重復(fù)域(C-terminal heptad repeat, CHR)往往會(huì)通過強(qiáng)烈的相互作用形成融合后的6螺旋(6-helix bundle, 6-HB)構(gòu)象[23]。與MPER以及gp41融合前構(gòu)象相比，6-HB是一種非常強(qiáng)的免疫顯性抗原，容易誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量針對它的非中和抗體，從而削弱MPER的免疫原性。因此，如何在充分暴露MPER中和表位的情況下盡可能模擬gp120/gp41的天然構(gòu)象并避免gp41的免疫顯性抗原位點(diǎn)暴露，是亟須解決的問題。

Ye等[24]研究發(fā)現(xiàn)，使用空間位阻更小的流感病毒A/Aichi/2/1968(H3N2)血凝素(hemagglutinin，HA)頭部結(jié)構(gòu)域HA1替代HIV-1的gp120，與gp41構(gòu)建成HA/gp41嵌合DNA疫苗，不但可以有效展示位于gp41上的MPER表位，還能正常表達(dá)于細(xì)胞表面，這在一定程度上模擬了gp120/gp41在病毒包膜上的狀態(tài)。但該嵌合疫苗也存在一些問題：①使用了同一株流感病毒A/Aichi/2/1968(H3N2)的HA1亞基，在經(jīng)過反復(fù)多次的免疫后，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了大量針對流感病毒HA的抗體，這在一定程度上影響了HIV-1 gp41的免疫原性；②未能解決gp41的NHR和CHR相互作用形成6-HB構(gòu)象的問題。

本文基于HA/gp41嵌合疫苗的研究，通過在gp41的NHR和CHR引入一系列突變來阻止兩者相互作用形成6-HB結(jié)構(gòu)，以維持gp41融合前的天然構(gòu)象；并以柔性連接子GSGSGSGS替代NHR和CHR之間的環(huán)區(qū)來盡可能規(guī)避gp41上的顯性非中和表位，得到gp41的突變體gp41-1605，并用此構(gòu)建新型HA/gp41嵌合疫苗。為了避免使用相同HA1構(gòu)建的新型HA/gp41嵌合疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更多針對HA1的抗體，首先使用一系列序列差異較大的流感病毒HA1亞基替代HIV-1的gp120亞基來構(gòu)建HA/gp41嵌合DNA，并通過體外實(shí)驗(yàn)證明這些嵌合DNA能在細(xì)胞表面正常表達(dá)并被MPER中和抗體結(jié)合，同時(shí)失去與gp41非中和抗體結(jié)合的能力。隨后，在新西蘭大耳兔上通過肌肉免疫的方式對疫苗的有效性進(jìn)行評估。本研究期望為HIV-1疫苗的研究提供有益的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 多肽所有多肽(純度>98%)均由KarebayBiochem公司(中國寧波)合成。

1.1.2 細(xì)胞和病毒株HeLa細(xì)胞和U87細(xì)胞來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。MT-2細(xì)胞、HIV-1實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株 HIV-1ⅢB(KJ925006.1)及表達(dá)T7聚合酶的牛痘病毒VTF7-3均來源于美國國立衛(wèi)生研究院艾滋病試劑項(xiàng)目(NIH AIDS Reagent Program)。

1.1.3 蛋白及抗體識別N36和C34多肽的多克隆抗體NY364由美國紐約血液中心杜蘭英博士惠贈(zèng)[25]；6-HB特異性小鼠單克隆抗體(NC-1)[26]、特異性識別NHR三聚體的鼠單克隆抗體18D3[27]、識別HIV-1 gp41 loop中顯性抗原位點(diǎn)的小鼠單克隆抗體F240[28]、MPER特異性小鼠單克隆非中和抗體(5F3)[29]以及MPER特異性人單克隆中和抗體(4E10和2F5)[10, 29-30]均來自美國國立衛(wèi)生研究院艾滋病試劑項(xiàng)目；甲型流感H3N2(A/Aichi/2/1968)HA和抗甲型流感H3N2(A/Aichi/2/1968)HA(HA1亞單位)的兔多克隆抗體均購自北京索萊寶生物公司；特異性識別甲型流感H3N2(A/Aichi/2/1968)HA的免疫兔血清Jose由David Steinhauer博士惠贈(zèng)[31]。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新西蘭大耳兔(9月齡雌兔，3～3.5 kg)，在復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生臨床中心飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測NHR和CHR突變多肽相互間形成6-HB的情況以N36和C34分別作為NHR和CHR的代表多肽，于37 ℃孵育30 min形成6-HB，將其作為陽性對照。將可以結(jié)合N36和C34多肽的NY364抗體包被于96孔聚苯乙烯板中，4 ℃過夜；將濃度為5 μmol/L的被檢多肽(N36突變多肽或C34突變多肽)與5 μmol/L 的檢測多肽(C34突變多肽或N36突變多肽)以1∶1的體積比混合，37 ℃孵育30 min；在包被NY364抗體的96孔板中加入封閉液[含體積分?jǐn)?shù)為1%的脫脂牛奶的0.05%吐溫-20磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline-Tween-20，PBS-T)]，置于37 ℃封閉2 h后，每孔加入多肽混合物 50 μL，再置于 37 ℃孵育1 h；洗去多肽，每孔加入對HIV-1 gp41的6-HB結(jié)構(gòu)具有特異性的單克隆抗體NC-1(濃度5 μg/mL)50 μL，37 ℃孵育1 h；洗去NC-1抗體，每孔加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的兔抗鼠單克隆抗體50 μL(用PBS-T 1∶4 000 稀釋)，37 ℃孵育1 h；洗去HRP標(biāo)記的單克隆抗體后每孔加入 50 μL ELISA底物顯色液；待顯色明顯后，加入 50 μL 濃硫酸終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定各孔在 450 nm 處的吸光度值(A450)。

1.2.2 ELISA檢測N36突變多肽形成三聚體的能力以原始多肽N36作為陽性對照。將濃度為 5 μmol/L 的N36突變多肽包被于96孔聚苯乙烯板中，置于4 ℃過夜；用封閉液在37 ℃封閉2 h后，每孔加入HIV-1的NHR三聚體特異性單克隆抗體18D3(濃度為 5 μg/mL)50 μL[27]，37 ℃孵育 1 h；洗去18D3抗體，每孔加入50 μL用PBS-T以 1∶4 000 稀釋的 HRP標(biāo)記的兔抗鼠單克隆抗體，37 ℃孵育1 h；洗去HRP標(biāo)記的單克隆抗體后每孔加入 50 μL ELISA底物顯色液；待顯色明顯后，加入 50 μL 濃硫酸終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的吸光度值(A450)。

1.2.3 構(gòu)建包含不同gp41突變的新型HA/gp41嵌合DNA將用于體外表達(dá)驗(yàn)證的HA/gp41嵌合DNA構(gòu)建到pBlueScript Ⅱ KS載體中[32]；動(dòng)物免疫用的HA/gp41嵌合DNA用pCAGGS表達(dá)[33]。具體方法如下：以流感病毒A/Aichi/2/1968(H3N2)的HA質(zhì)粒為模板，分別以GCCACCAT-GAAGACCATCATTGCT和ATTGCGCCGAA-TAGGCCTCGAGTTTGTTTCTCTG作為上、下游引物，在3′末端或HA1編碼序列引入XhoI限制性酶切位點(diǎn)(劃線部分為酶切位點(diǎn))；以HIV-189.6的包膜蛋白質(zhì)粒為模板，分別以CAAACTCGAG-GCATCGGCGCCGTTAATGGC和TCAAGGG-CAGCAGGTCTGGAA作為上、下游引物，在gp41的5′末端引入XhoI限制性酶切位點(diǎn)(劃線部分為酶切位點(diǎn))，通過聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)分別對HA1基因和gp41基因進(jìn)行擴(kuò)增。將HA1基因的擴(kuò)增產(chǎn)物通過酶切、連接克隆到pBlueScript Ⅱ KS載體中[32]。根據(jù)碧云天定點(diǎn)突變試劑盒設(shè)計(jì)引物，在gp41的NHR區(qū)和CHR區(qū)引入相應(yīng)的突變；通過酶切、連接將突變后的gp41克隆到帶有HA1的pBlueScript Ⅱ KS載體中，在gp41上構(gòu)建包含不同突變位點(diǎn)的HA/gp41嵌合DNA：HA/gp41-1686、HA/gp41-1605、HA/gp41-GSL、HA/gp41-EKL、HA/gp41-CM、HA/gp41-NM(見表1)。

表1 HA/gp41疫苗的構(gòu)建

1.2.4 ELISA檢測包含不同gp41突變的HA/gp41嵌合DNA用ELISA對HA/gp41嵌合DNA在細(xì)胞表面的表達(dá)及對HIV-1中和/非中和抗體的識別分別進(jìn)行檢測，檢測方法如下[32]：轉(zhuǎn)染前將 1×104個(gè)HeLa細(xì)胞鋪在96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中，隔夜生長至密度為90%左右；用重組痘苗病毒VTF7-3感染細(xì)胞，在感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)值為10的情況下感染2 h后，用構(gòu)建于pBlueScript Ⅱ KS載體的疫苗質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以pBlueScript Ⅱ KS空載體作為陰性對照。轉(zhuǎn)染后18 h，用PBS將96孔板中的細(xì)胞洗1遍，以2%甲醛固定后用牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)阻斷進(jìn)行封閉。洗去BSA后，將細(xì)胞與特異性識別流感病毒株A/Aichi/2/1968(H3N2)HA1的兔免疫血清(Jose)[31]常溫孵育1 h；洗去血清后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，常溫孵育45 min；洗去HRP標(biāo)記的單克隆抗體后每孔加入50 μL ELISA底物顯色液；待顯色明顯后，加入50 μL濃硫酸終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的吸光度值(A450)。

在檢測嵌合HA/gp41疫苗抗原對MPER特異性中和抗體、非中和抗體、6-HB特異性抗體以及免疫顯性表位非中和抗體的識別時(shí)，一級抗體分別用MPER特異性中和抗體(4E10和2F5)[10, 29-30]、6-HB特異性抗體(NC-1)[26]、MPER非中和抗體(5F3)以及gp41 環(huán)區(qū)免疫顯性表位特異性非中和抗體(F240)[28]進(jìn)行檢測。

1.2.5 構(gòu)建包含不同HA1亞單位的HA/gp41-1605嵌合DNA對gp41上包含不同突變位點(diǎn)的HA/gp41的特性進(jìn)行檢測后，在HA/gp41-1605的基礎(chǔ)上，使用不同流感病毒[A/Shanxi/10/2006(H5N1)、A/California/07/2009(H1N1)、A/Qinghai/1/2005(H5N1)和A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)]的HA1亞基取代HA/gp41-1605的HA1結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建包含不同HA1的嵌合DNA：HA/gp41-1605、HA(SX)/gp41-1605、HA(CA)/gp41-1605、HA(QH)/gp41-1605以及HA(PR8)/gp41-1605；構(gòu)建用于動(dòng)物免疫的包含不同HA的HA/gp41-1605 DNA時(shí)，將pBlueScript Ⅱ KS載體替換為pCAGGS載體。

1.2.6 ELISA檢測包含不同HA1亞單位的HA/gp41-1605嵌合抗原用ELISA對HA/gp41-1605嵌合抗原在細(xì)胞表面表達(dá)及對HIV-1中和/非中和抗體識別分別進(jìn)行檢測，檢測方法同1.2.4小節(jié)。一級抗體分別用特異性識別流感病毒株A/Aichi/2/1968(H3N2)HA1的免疫血清Jose、中和抗體(4E10和2F5)及非中和抗體(F240和5F3)進(jìn)行檢測。

1.2.7 動(dòng)物免疫所有DNA疫苗均采用磷酸鋁作為佐劑，多肽疫苗均采用Sigma佐劑系統(tǒng)(Sigma Adjuvant System, SAS)。每次免疫前均通過耳緣靜脈采集血樣，免疫時(shí)所有兔子均通過后腿外側(cè)肌肉接種疫苗，每只兔子每次接受的DNA劑量為500 μg，多肽劑量為50 μg。免疫前一天將抗原與佐劑混合制成免疫用疫苗，4 ℃保存。具體方法如下。①DNA疫苗：用0.9%生理鹽水將嵌合DNA稀釋至0.5 mg/mL，再按1∶1的體積比加入磷酸鋁佐劑(Sigma公司)，持續(xù)吹打混勻5 min以上，置于 4 ℃ 保存?zhèn)溆?。②多肽疫苗：用二甲亞?Dimethyl sulfoxide, DMSO)溶解10E8-4P多肽，再用0.9%生理鹽水將多肽稀釋至0.25 mg/mL，使用注射器將多肽加到2 mL 45 ℃預(yù)熱的SAS佐劑中，旋渦混勻至少5 min，暫存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 免疫兔血清中特異性抗體檢測使用ELISA檢測免疫兔血清中的HA、gp41 CHR、gp41 NHR、6-HB、MPER以及10E8表位特異性抗體的產(chǎn)生情況，具體如下：將多肽(或流感病毒HA蛋白)稀釋至5 μg/mL，用碳酸鹽緩沖液包被至96孔聚乙烯板中，4 ℃過夜；用封閉液封閉后，每孔加入50 μL用PBS-T稀釋100倍的免疫兔血清，置于37 ℃孵育1 h后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，常溫孵育45 min；每孔加入50 μL ELISA底物顯色液；待顯色明顯后，加入50 μL濃硫酸終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的吸光度值(A450)。檢測血清中的HA抗體時(shí)，以特異性識別流感病毒株A/Aichi/2/1968(H3N2)HA1的抗體作為陽性對照；檢測血清中g(shù)p41 CHR和NHR特異性抗體時(shí)，以NY364抗體作為陽性對照。

在檢測6-HB特異性抗體時(shí)，首先將5 μg/mL 6-HB特異性抗體NC-1包被于96孔聚乙烯板中，4 ℃ 保存過夜；并將原始N36和C34多肽按1∶1比例混合，置于37 ℃孵育30 min；待用封閉液對 NC-1 抗體進(jìn)行封閉后，加入N36和C34多肽混合物，37 ℃孵育1 h后，每孔加入50 μL用PBS-T稀釋100倍的免疫兔血清，以NY364抗體作為陽性對照，37 ℃孵育1 h，加入HRP結(jié)合的羊抗兔IgG抗體，常溫孵育45 min后每孔加入50 μL ELISA底物顯色液；待顯色明顯后，加入50 μL濃硫酸終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的吸光度值(A450)。

1.2.9 免疫兔血清對HIV-1ⅢB的中和活性檢測免疫兔血清用無血清的改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)梯度稀釋，在96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入50 μL稀釋血清，并加入50 μL含100 TCID50的HIV-1ⅢB病毒株，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，設(shè)置病毒對照孔和細(xì)胞對照孔。30 min后，每孔加入100 μL 1×104MT-2細(xì)胞，過夜感染，然后用含10% 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的新鮮DMEM更換培養(yǎng)上清液。感染后第4天，待觀察到病毒對照孔出現(xiàn)明顯病變后，從每孔中收集50 μL培養(yǎng)上清液，與等體積的5% Triton X-100混合，并通過ELISA檢測p24抗原。

2 結(jié)果

2.1 NHR區(qū)的N36-M3、N36-M4、N36-M6和N36-M9突變有助于維持gp41融合前的天然構(gòu)象

為了鑒定NHR上能夠阻止gp41形成融合后的6-HB結(jié)構(gòu)并維持gp41融合前非6-HB天然構(gòu)象的關(guān)鍵氨基酸，本研究基于之前關(guān)于NHR和CHR上位點(diǎn)突變的報(bào)道，在N36的CHR結(jié)合位點(diǎn)引入1～2個(gè)氨基酸突變[23, 34-38]，并通過帶電荷的谷氨酸(E)和賴氨酸(K)替換N36上亮氨酸(L)和異亮氨酸(I)等疏水性氨基酸，在N36多肽內(nèi)部引入E-K鹽橋以穩(wěn)定其α-螺旋構(gòu)象并阻止N36和CHR相互作用，得到10條N36突變多肽(N36-M1～N36-M10，見表2)。為了篩選NHR上能夠阻斷6-HB結(jié)構(gòu)形成的有效突變位點(diǎn)，使用ELISA檢測了10條N36突變多肽形成三聚體構(gòu)象和與原始C34多肽作用形成6-HB構(gòu)象的能力。結(jié)果顯示，N36上這些突變都能有效阻斷N36與原始C34形成6-HB構(gòu)象(見圖1A)。并且在這10條N36突變肽中，N36-M3(L568P/V570E)、N36-M4(L568P/W571E/Q575K)、N36-M6(L556K/V570P)和N36-M9(T569P/Q575A)還能形成N36三聚體構(gòu)象(見圖1B)。

A: The interaction between NHR mutant peptides and CHR peptide C34 to form 6-HB conformation. B: The ability of N36 mutant peptide to form NHR-trimer.

表2 NHR和CHR突變多肽序列

2.2 CHR區(qū)中C34-M1、C34-M3和C34-M4突變有助于維持gp41融合前的天然構(gòu)象

在C34突變多肽的設(shè)計(jì)上，主要通過在C34與NHR結(jié)合的位點(diǎn)引入E-K鹽橋(如W631K/I635E、Y638K/I642E和L645E/S649K)來阻斷C34與NHR的相互作用，以達(dá)到阻止6-HB形成的目的。最終，得到了5條C34突變多肽(C34-M1～C34-M5，見表1)，并使用6-HB特異性抗體(NC-1)，通過ELISA檢測這些C34突變多肽能否與原始N36多肽相互作用形成6-HB結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，C34-M1(W631K/I635E)、C34-M3(Y638K/I642E)和C34-M4(L645E/S649K)均不能與N36形成6-HB結(jié)構(gòu)(見圖2)。

The interaction between CHR mutant peptides and natural NHR peptide N36 to form 6-HB conformation detected by ELISA.

2.3 NHR區(qū)N36-M6突變和CHR區(qū)C34-M1、C34-M3突變組合能夠維持gp41融合前的天然構(gòu)象

上述結(jié)果表明，在C34突變多肽中，只有C34-M1、C34-M3和C34-M4這3條突變多肽在與原始N36多肽作用后未形成6-HB結(jié)構(gòu)，因此進(jìn)一步檢測這3條C34突變多肽能否與10條N36突變多肽形成6-HB結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，C34-M1和C34-M3只能與N36-M4形成6-HB構(gòu)象，而C34-M4可以與2條N36突變多肽(N36-M4、N36-M9)形成6-HB構(gòu)象(見圖3)，表明以C34-M1和C34-M3為代表的W631K/I635E和Y638K/I642E突變可以作為嵌合疫苗構(gòu)建過程中CHR區(qū)突變的候選者。考慮到在N36突變多肽中， 僅N36-M3、N36-M4、N36-M6以及N36-M9能夠維持三聚體構(gòu)象， 而N36-M4和N36-M9還有可能與C34突變多肽形成6-HB，因此，排除N36-M4和N36-M9兩種突變策略。由于原始N36多肽在PBS中的溶解性不佳，進(jìn)一步檢測10條N36突變多肽在PBS中的溶解性后，發(fā)現(xiàn)所有N36突變多肽在PBS中的溶解性都比原始N36多肽更好，而其中N36-M2(L556K/L568P)和N36-M6(L556K/V570P)具有最高的溶解度(見表3)?？紤]到N36-M2無法模擬天然的三聚體結(jié)構(gòu)，最終確定將以N36-M6(L556K/V570P)為代表的突變多肽應(yīng)用到構(gòu)建HA/gp41嵌合疫苗的策略中。

C34-M1 (A), C34-M3 (B) and C34-M4 (C) forming 6-HB conformation with N36 mutations detected by ELISA.

表3 NHR及其突變多肽在PBS中的溶解性

2.4 HIV-1 gp41上不同位點(diǎn)的突變對HA/gp41 DNA疫苗抗原性的影響

為了確定用于動(dòng)物免疫的嵌合DNA的具體構(gòu)建方案，須明確HIV-1 gp41上不同位點(diǎn)的突變對HA/gp41 DNA疫苗抗原性的影響差異。首先，以流感病毒株A/Aichi/2/1968(H3N2)HA1亞基取代HIV-1包膜蛋白gp120，并在gp41上引入T569P突變以增加疫苗的表面穩(wěn)定性，構(gòu)建了6株在gp41上包含不同突變的HA/gp41嵌合DNA，克隆到pBlueScript Ⅱ KS質(zhì)粒載體中。6株嵌合DNA構(gòu)建策略如下：①HA/gp41-1686在gp41區(qū)域僅包含T569P突變；②HA/gp41-1605在gp41區(qū)域不僅包含T569P突變，而且包括NHR(L556K/V570P)和CHR(W631K/I635E/Y638K/I642E)的突變，并且用免疫性弱且更靈活的GSGSGSGS接頭序列替代了含有免疫優(yōu)勢表位的gp41環(huán)；③HA/gp41-GSL除包含T569P突變外，還使用GSGSGSGS取代環(huán)；④HA/gp41-EKL除包含T569P突變外，還使用更堅(jiān)固的EAAAKEAAAKEAAAK接頭取代環(huán)；⑤HA/gp41-CM僅含有CHR突變(W631K/I635E/Y638K/I642E)及T569P突變；⑥HA/gp41-NM僅含有NHR(L556K/V570P)突變及T569P突變(見表1)。

隨后，用ELISA檢測細(xì)胞表面抗原，以確定HA/gp41-1686、HA/gp41-1605、HA/gp41-GSL、HA/gp41-EKL、HA/gp41-CM和HA/gp41-NM嵌合蛋白是否能正確折疊并成功轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面。如圖4A所示，所有HA/gp41嵌合疫苗抗原都能在細(xì)胞表面被流感病毒毒株A/Aichi/2/1968(H3N2)HA1的特異性兔免疫血清(Jose)識別，說明這些疫苗抗原均能在細(xì)胞內(nèi)合成后被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面；進(jìn)一步使用ELISA檢測細(xì)胞表面嵌合蛋白對MPER特異性中和抗體(4E10)和6-HB特異性非中和抗體(NC-1)的反應(yīng)。結(jié)果表明，HA/gp41-1605保留了對4E10的反應(yīng)性(見圖4B)，而無法被NC-1識別(見圖4C)，說明HA/gp41-1605能夠更好地展示MPER表位，且不會(huì)形成6-HB構(gòu)象。此外，與其他HA/gp41嵌合蛋白相比，HA/gp41-1605也無法被非中和抗體(5F3和F240)識別(見圖4D、4E)，說明HA/gp41-1605可能是一個(gè)比較合適的候選嵌合疫苗。

2.5 包含不同甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)HA1亞基的HA/gp41-1605嵌合抗原對相關(guān)抗體的反應(yīng)

為了避免具有相同流感病毒HA1亞基的嵌合疫苗反復(fù)免疫誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更多針對HA1的抗體，依據(jù)HA/gp41-1605的構(gòu)建方式，使用不同流感病毒HA1[A/Shanxi/10/2006(H5N1)、A/California/07/2009(H1N1)、A/Qinghai/1/2005(H5N1)、A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)]構(gòu)建HA(SX)/gp41-1605、HA(CA)/gp41-1605、HA(QH)/gp41-1605以及HA(PR8)/gp41-1605嵌合DNA(見圖5A)，并以相同的方式檢測這些嵌合抗原在細(xì)胞表面的表達(dá)以及被HIV-1中和抗體和非中和抗體識別的情況。結(jié)果顯示，替換了HA1之后，嵌合蛋白都不能被流感病毒毒株A/Aichi/2/1968(H3N2)HA1的兔免疫血清(Jose)識別(見圖5B)；同時(shí)，新構(gòu)建的嵌合蛋白都能被MPER特異性中和抗體(4E10和2F5)識別(見圖5C、5D)。以上說明新構(gòu)建的嵌合蛋白能在細(xì)胞體系上正常表達(dá)，且保留了展示MPER表位的能力。此外，與HA/gp41-1605類似，替換了HA1的嵌合蛋白也不能被gp41特異性非中和抗體5F3以及F240識別(見圖5E、5F)。

Construction of HA/gp41-1605 DNA with different HA1 subunits (A); Recognition of the cell-expressed HA/gp41-1605 chimeric DNA vaccine antigen by HA[A/Aichi/2/1968(H3N2)]-specific antibody (Jose, B); MPER-specific neutralizing antibody (4E10, C); MPER-specific neutralizing antibody (2F5, D); MPER-specific non-neutralizing antibody (5F3, E); gp41 loop-specific non-neutralizing antibody (F240, F). HA/gp41-1686 is the positive control antigen for the antibodies tested, while pBlueScript II KS vector is the negative control (see the “Control” in each figure).

2.6 序貫免疫包含不同IAV HA1的HA/gp41-1605嵌合DNA疫苗可有效避免機(jī)體產(chǎn)生針對HA的抗體

為了增強(qiáng)免疫效果，使用HA/gp41-1605嵌合DNA疫苗進(jìn)行序貫免疫，同時(shí)在DNA免疫前后分別使用之前開發(fā)的包含4個(gè)串聯(lián)10E8表位的10E8-4P多肽進(jìn)行加強(qiáng)免疫。將9只新西蘭大耳兔隨機(jī)分為3組(每組3只)，具體免疫程序如表4所示。第1組為實(shí)驗(yàn)組(1～3號)，前5次分別使用含有不同HA1的HA/gp41-1605嵌合DNA疫苗免疫，最后采用10E8-4P多肽進(jìn)行加強(qiáng)免疫；第2組為對照組(4～6號)，每次均采用HA/gp41-1686(包含同一HA1且gp41未經(jīng)阻斷6-HB形成突變改造的嵌合DNA疫苗)進(jìn)行免疫，最后2次仍然采用10E8-4P多肽進(jìn)行加強(qiáng)免疫；第3組(7～9號)與第1組采用相同的免疫原，只是在免疫程序上首先使用多肽免疫，再使用DNA疫苗免疫。

表4 動(dòng)物免疫程序

在經(jīng)過7次免疫后，首先檢測免疫兔血清對HA1[A/Aichi/2/1968(H3N2)]抗原的識別能力。如圖6所示，第2組中的5號、6號兔在第2次免疫后就產(chǎn)生了針對HA1(H3)的抗體，說明一直免疫同種HA1的HA/gp41嵌合蛋白確實(shí)存在誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性HA1抗體的問題。而在第1組和第3組使用包含不同HA1嵌合DNA疫苗進(jìn)行序貫免疫的6只大耳兔中，僅有1只在第5次免疫后產(chǎn)生了針對HA1(H3)的抗體，說明使用不同HA1作為嵌合疫苗頭部的免疫策略對于規(guī)避更為顯性的HA1免疫原性確有一定作用。

Anti-HA antibody in immunized rabbit sera with 1: 100 dilution was detected by ELISA. HA antibody against A/Aichi/2/1968(H3N2) HA was used as positive control.

2.7 序貫免疫包含不同IAV HA1亞基的 HA/gp41-1605嵌合DNA疫苗能夠有效避免產(chǎn)生針對gp41上非中和表位的抗體

進(jìn)一步檢測免疫兔血清與gp41 CHR、gp41 NHR和6-HB的結(jié)合情況。9只大耳兔均未產(chǎn)生針對HIV-1 gp41 NHR結(jié)構(gòu)域以及6-HB結(jié)構(gòu)的抗體(見圖7B、7C)，說明疫苗策略確實(shí)能夠有效避免gp41上非中和位點(diǎn)產(chǎn)生抗體。此外，在對照組(第2組)的1只大耳兔血清中檢測到了針對HIV-1 gp41 CHR結(jié)構(gòu)域的抗體(見圖7A)，而第1組與第3組的6只大耳兔均未產(chǎn)生針對gp41上其他表位的抗體，在一定程度上證明了新構(gòu)建的嵌合疫苗能更好地避免其他非中和表位產(chǎn)生抗體。

Recognition of HIV-1 gp41 CHR domain (A), NHR domain (B) and 6-HB conformation (C) by antibodies in rabbit antisera, respectively. NY364 antibody was used as positive control.

2.8 包含不同 HA1 的 HA/gp41-1605 嵌合DNA疫苗的序貫免疫可誘導(dǎo)MPER特異性抗體產(chǎn)生，但對HIV-1不具有中和作用

檢測免疫兔血清與MPER多肽以及10E8表位多肽的結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)除實(shí)驗(yàn)組(第1組)1號兔在第7次免疫后產(chǎn)生了針對MPER多肽的抗體外，其他兔血清中均未檢測到MPER特異性抗體(見圖8A)。所有兔血清中均未檢測到針對10E8表位的抗體(見圖8B)，也未檢測到對HIV-1ⅢB感染具有抑制作用的中和抗體(見圖9)。

Recognition of HIV-1 gp41 MPER peptide (A) and 10E8 epitope (B) by antibodies in rabbit antisera.

MT-2 cells were infected by 100 TCID50 HIV-1 in the presence or absence of rabbit antisera at different dilutions. The p24 antigen was detected by sandwich ELISA.

3 討論

針對艾滋病疫苗設(shè)計(jì)，位于HIV-1 gp41的MPER因具有以下特性而表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢。①M(fèi)PER序列在不同亞型的HIV-1毒株中相對保守，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體不易使HIV-1發(fā)生免疫逃逸。相比之下，gp120在表面存在許多具有免疫優(yōu)勢的可變區(qū)，可能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量沒有中和活性的抗體[39-40]；此外，gp120是一個(gè)高度糖基化蛋白，這些復(fù)雜而密集的糖基化位點(diǎn)可能對gp120上保守的抗原表位形成遮蓋，導(dǎo)致其難以被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識別[41]。②MPER在HIV-1感染以及病毒和細(xì)胞的膜融合過程中發(fā)揮著重要作用[42]。有研究發(fā)現(xiàn)，刪除HIV-1的MPER上17個(gè)氨基酸(665WASLWNWFDITNWLWYI683)后，HIV-1在細(xì)胞間傳播以及進(jìn)入靶細(xì)胞的能力將受到影響[43]；而MPER上659LLELDKWASLW671序列的刪除也影響了HIV-1感染靶細(xì)胞后合胞體的形成[44]。③多個(gè)從HIV-1感染者體內(nèi)分離出的單克隆抗體被證明具有中和HIV-1的能力，如2F5、4E10和10E8就能分別通過識別MPER的656NEQELLELDK-WASLWN671、671NWFDITNWLWYIK683以及664DKWASLWNWFDITNWLWYIK683序列，進(jìn)而中和57%～67%、～98% 和～98%的HIV-1臨床株[12]。

迄今為止，針對MPER開發(fā)的HIV-1疫苗未能誘生高效、廣譜的HIV-1中和抗體，這可能是由MPER的免疫原性差以及其中和位點(diǎn)未能充分暴露，且在gp41的環(huán)區(qū)和6-HB結(jié)構(gòu)中存在的免疫優(yōu)勢位點(diǎn)可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量非中和抗體，進(jìn)一步削弱MPER中和位點(diǎn)免疫原性引起的[45]。先前的研究發(fā)現(xiàn)，使用IAV的HA1亞基替代HIV-1的gp120與gp41構(gòu)成的HA/gp41嵌合疫苗抗原，不僅能在一定程度上模擬gp120/gp41包膜蛋白的結(jié)構(gòu)，還能有效暴露gp41上的免疫表位。但HA1和gp41的環(huán)及融合后6-HB結(jié)構(gòu)的強(qiáng)免疫原性可能削弱了MPER的免疫原性，導(dǎo)致未能誘導(dǎo)產(chǎn)生高效的MPER特異性中和抗體[24]。本研究通過在gp41的NHR和CHR引入突變來穩(wěn)定其融合前非6-HB結(jié)構(gòu)的天然構(gòu)象，用免疫原性弱的氨基酸片段替換環(huán)，并使用空間位阻較小的、不同流感病毒毒株的HA1亞基替換gp120，以期更好地暴露gp41中MPER抗原表位。結(jié)果顯示，表達(dá)于細(xì)胞表面的HA/gp41-1605嵌合蛋白能夠被MPER特異性中和抗體4E10和2F5所識別，表明其能有效展示MPER的中和抗體結(jié)合表位。此外，有研究報(bào)道，NHR兩段α-螺旋之間的L568-V570區(qū)域存在一個(gè)轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，并且有研究發(fā)現(xiàn)在N36的L568位點(diǎn)引入脯氨酸(P)突變能夠降低6-HB結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[37]，并顯著增強(qiáng)MPER區(qū)4E10表位的免疫原性[38]。在設(shè)計(jì)gp41突變體時(shí)，發(fā)現(xiàn)在L568-V570的轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)中引入一個(gè)P突變的NHR突變多肽不能與原始C34多肽形成6-HB結(jié)構(gòu)，表明引入P突變可能對阻斷6-HB結(jié)構(gòu)的形成格外重要。

之前，對于10E8-4P的構(gòu)象分析發(fā)現(xiàn)，10E8-4P表現(xiàn)出排列良好的串聯(lián)螺旋構(gòu)象，能夠使10E8表位中的關(guān)鍵氨基酸殘基有效暴露。與僅包含一個(gè)10E8表位的多肽10E8-1P相比，10E8-4P不僅顯示出更好的抗原性，而且誘發(fā)了針對HIV-1假病毒的中和抗體應(yīng)答[46]。本研究在進(jìn)行疫苗免疫原性評估時(shí)，采用了兩種不同的策略。第一，先用嵌合HA/gp41-1605疫苗對新西蘭大耳兔進(jìn)行序貫免疫以激活所有針對HIV-1 gp41的B細(xì)胞；再用包含10E8表位的10E8-4P多肽進(jìn)一步進(jìn)行加強(qiáng)免疫，以期刺激產(chǎn)生MPER特異性抗體。第二，先用10E8-4P多肽進(jìn)行免疫以激活針對天然或非天然構(gòu)象的MPER抗體，再用包含MPER表位天然構(gòu)象的嵌合HA/gp41-1605疫苗進(jìn)行序貫免疫，以期得到針對天然構(gòu)象的中和抗體。

結(jié)果表明，兩種免疫策略在誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生方面并無明顯差異。嵌合疫苗HA/gp41-1605的序貫免疫的確能有效避免機(jī)體產(chǎn)生針對HA的抗體和針對gp41上免疫優(yōu)勢區(qū)的非中和表位抗體，但是卻不能誘導(dǎo)產(chǎn)生具有中和活性的MPER特異性抗體?？赡艿脑蛉缦?。①在自然狀態(tài)下， MPER具有天然的柔性，能夠以不同的構(gòu)象與不同的中和抗體結(jié)合[12, 47-48]，雖然融合前的非6-HB構(gòu)象可能是gp41誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的天然構(gòu)象，但在gp41的NHR和CHR引入突變后可能也影響了MPER的構(gòu)象。而最近的研究也發(fā)現(xiàn)，MPER不是穩(wěn)定的三聚體結(jié)構(gòu)，而是適應(yīng)于融合后結(jié)構(gòu)變化的動(dòng)態(tài)片段[49]，這在一定程度上增加了模擬MPER天然構(gòu)象進(jìn)行疫苗研發(fā)的難度。②有研究發(fā)現(xiàn)4E10、10E8和2F5 等MPER特異性中和抗體既能結(jié)合病毒包膜上的MPER，又能結(jié)合合成的MPER多肽。但是，如果突變?nèi)コパa(bǔ)決定區(qū)的H3(complementarity-determining region-H3, CDR-H3)后，這些抗體只能識別MPER多肽，而不再識別膜上的MPER，并且同時(shí)失去了中和活性[50-52]。目前，發(fā)現(xiàn)的MPER抗體都有很長的CDR-H3，可能需要長時(shí)間的體細(xì)胞高頻突變才能實(shí)現(xiàn)，而本研究的免疫時(shí)間可能還不夠長，故誘導(dǎo)的抗體只能識別MPER多肽，不能識別膜上的MPER，因此沒有中和活性。③針對MPER的廣譜中和抗體大多具有自身反應(yīng)性，可能削弱抗體的中和作用[53-54]。例如：疫苗刺激可能產(chǎn)生MPER特異性廣譜中和抗體的pre-B細(xì)胞，在骨髓中發(fā)育時(shí)，其中大多數(shù)可能通過克隆缺失和受體編輯而被去除，因此不能發(fā)育為未成熟的IgM + B細(xì)胞；僅有少數(shù)脂質(zhì)(或其他自身抗原)反應(yīng)性B細(xì)胞能夠成功從骨髓遷移到次級淋巴器官并分化為可產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞。只有少量無反應(yīng)性細(xì)胞可以移動(dòng)至次淋巴器官，因此產(chǎn)生MPER特異性廣譜中和抗體十分困難。

此外，有研究認(rèn)為磷脂可能也在MPER特異性抗體對HIV-1中和方面發(fā)揮作用。比如：MPER的大部分氨基酸都包埋在病毒膜中[55-56]，而MPER上與4E10抗體結(jié)合的3個(gè)至關(guān)重要的疏水性氨基酸(W672、F673和L679)也都被包埋在脂質(zhì)膜中，僅關(guān)鍵氨基酸T676暴露于病毒膜磷脂頭部[55]。大量通過脂質(zhì)體模擬脂膜的MPER疫苗研究發(fā)現(xiàn)，脂膜確實(shí)可以通過促進(jìn)天然構(gòu)象的形成來調(diào)節(jié)MPER的結(jié)構(gòu)，并改善其免疫原性[57-58]。本研究在體外實(shí)驗(yàn)中證明嵌合DNA確實(shí)能夠表達(dá)于細(xì)胞表面，這在一定程度上模擬了MPER在病毒脂膜上的狀態(tài)。不過，表達(dá)于細(xì)胞表面的HA/gp41-1605是否與HIV-1的包膜蛋白具有相同的構(gòu)象并模擬MPER的天然結(jié)構(gòu)尚不清楚。而且，本研究的DNA疫苗是通過局部注射的方式進(jìn)行免疫，可能無法激活大規(guī)模的免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致無法誘導(dǎo)產(chǎn)生具有中和活性的HIV-1抗體。

本研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)于細(xì)胞表面的HA/gp41-1605嵌合蛋白能夠被MPER中和抗體4E10和2F5識別，但是在使用HA/gp41-1605 DNA疫苗免疫家兔后，獲得的血清中的MPER抗體卻不能識別包含4E10和2F5表位的10E8-4P多肽，說明即使將gp41穩(wěn)定在融合前的天然構(gòu)象，MPER仍可能處于動(dòng)態(tài)變化之中。因此，在今后的疫苗設(shè)計(jì)中，可能須考慮如何進(jìn)一步穩(wěn)定MPER構(gòu)象。冠狀病毒疫苗的相關(guān)研究可能會(huì)帶來一些啟示，例如目前進(jìn)入Ⅲ期臨床的新型冠狀病毒mRNA-1273疫苗通過在冠狀病毒刺突(spike，S)蛋白上引入2個(gè)脯氨酸突變(S-2P)來穩(wěn)定S蛋白融合前的構(gòu)象，以增強(qiáng)其免疫原性[59-61]。因此，在HA/gp41-1605的基礎(chǔ)上，可能也可以采用該策略在gp41的MPER引入突變來穩(wěn)定MPER構(gòu)象，進(jìn)一步增強(qiáng)疫苗的免疫原性。

此外，裸露的DNA疫苗也面臨轉(zhuǎn)染效率不高和易被機(jī)體降解的風(fēng)險(xiǎn)[62-63]，這可能是DNA疫苗誘導(dǎo)中和抗體的免疫原性較差的一個(gè)重要原因。當(dāng)前，越來越多的研究將HIV-1疫苗平臺聚焦于病毒樣顆粒(virus-like particles, VLPs)或重組病毒疫苗，它們或能通過模擬天然狀態(tài)下MPER與脂質(zhì)的結(jié)合特征以提高疫苗的免疫原性，或能夠提高DNA疫苗的轉(zhuǎn)染效率和誘導(dǎo)中和抗體的能力。而許多以VLPs或重組病毒為平臺的MPER疫苗，也誘導(dǎo)產(chǎn)生了具有一定中和活性的抗體[24, 64-65]。

綜上所述，在基于MPER的疫苗研發(fā)方面，除了中和抗體表位序列外，MPER的天然構(gòu)象及其在天然狀態(tài)下所處的脂膜環(huán)境，甚至是疫苗形式可能也須予以考慮[66]。