符曉瑩，朱雄，麥珍，王立程，王崇圳，韓麗梅，李歡，陳海

三亞市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科/中心實(shí)驗(yàn)室， 海南 三亞 572000

棲稻假單胞菌(Pseudomonasoryzihabitans，P.oryzihabitans)是一類(lèi)非發(fā)酵的需氧革蘭氏陰性桿菌，該菌廣泛存在于自然界，在稻葉上定植，通常存在于水、泥土和潮濕環(huán)境中，包括醫(yī)院環(huán)境中的下水道、呼吸機(jī)、含水的醫(yī)療器械和洗手盆等[1-2]。1977年，Pien[3]從1例硬膜外腦出血患者的血培養(yǎng)中分離發(fā)現(xiàn)該菌，這是棲稻假單胞菌作為致病菌首次被臨床報(bào)道。目前，棲稻假單胞菌作為條件致病菌和院內(nèi)感染菌，多分離自免疫功能低下、肝臟損傷、腫瘤或慢性腎臟疾病患者[4]，在軟組織感染、肺炎、心內(nèi)膜炎和菌血癥等[1-2, 5-6]中常見(jiàn)，偶見(jiàn)于特殊病例如假體周?chē)P(guān)節(jié)感染[7]等。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)棲稻假單胞菌感染的臨床病例報(bào)道相對(duì)較少，導(dǎo)致臨床醫(yī)務(wù)人員對(duì)該菌的認(rèn)識(shí)不足。本文對(duì)就診于三亞市人民醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)治療病房(intensive care unit，ICU)的1例患者血培養(yǎng)中分離并鑒定出的1株棲稻假單胞菌報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 病例

患者男性，33歲，黎族，公司職員，家住海南省陵水黎族自治縣。該患者于2019年11月17日就診于陵水縣人民醫(yī)院，就診前半月余無(wú)明顯誘因出現(xiàn)雙下肢水腫，未予注意；就診前3 d出現(xiàn)全身乏力、氣短、尿少，伴惡心、嘔吐等癥狀，仍未予注意。就診當(dāng)天以上癥狀進(jìn)一步加重。生化檢查：肌酐234.0 μmol/L，血鉀6.89 mmol/L；胸部、腹部CT：左肺上葉炎癥、心包少量積液、右側(cè)胸腔積液、左側(cè)胸膜增厚、脂肪肝、肝臟形態(tài)增大、腹腔積液、雙側(cè)腎周滲出改變?？h醫(yī)院考慮患者病情極為危重，于就診當(dāng)日便將其轉(zhuǎn)入三亞市人民醫(yī)院搶救，急診科以“腎功能衰竭、高鉀血癥”收入ICU。

入院查體：體溫35.8 ℃，脈搏94次/分，血壓107/83 mmHg(多巴胺維持下)。雙下肢中度水腫，雙小腿見(jiàn)散在色素沉著。血常規(guī)檢查：白細(xì)胞17.23×109/L，中性粒細(xì)胞比率 81.9%，血紅蛋白 137 g/L，血小板200×109/L；生化檢查：肌酐281 μmol/L，降鈣素原3.98 ng/mL，谷丙轉(zhuǎn)氨酶996 U/L，血鉀7.06 mmol/L；心肌鈣蛋白I 1.33 μg/L?；颊呒韧w健，否認(rèn)高血壓、冠心病、糖尿病等病史。

入院診斷：急性腎損傷；肺部感染；膿毒性休克；脂肪肝；肝功能不全；多器官功能障礙綜合征。

治療：入院后告病危，給予靜脈滴注亞胺培南西司他丁(泰能)1.0 g，每8 h 1次，聯(lián)合莫西沙星 0.4 g，每日1次，加強(qiáng)抗感染；并加強(qiáng)炎癥因子清除、補(bǔ)液抗休克以及糾酸對(duì)癥支持治療，但預(yù)后極差。患者入院立即送檢做血培養(yǎng)，24 h后報(bào)告陽(yáng)性，涂片染色鏡檢可見(jiàn)革蘭陰性桿菌?；貓?bào)血培養(yǎng)危急值時(shí)，臨床告知患者已出院。出院原因系患者家屬因自身因素主動(dòng)要求。出院時(shí)患者呈昏迷狀，血壓 83/45 mmHg(去甲腎上腺素3.0 μg·kg-1·min-1、腎上腺素3.0 μg·kg-1·min-1維持下)，血氧飽和度96%。雙側(cè)瞳孔等大等圓2.0 mm，對(duì)光反射稍遲鈍。

1.2 材料與方法

1.2.1 主要試劑哥倫比亞血瓊脂平板、嗜血巧克力瓊脂平板、中國(guó)藍(lán)瓊脂平板和水解酪蛋白瓊脂(Mueller-Hinton, MH)培養(yǎng)基購(gòu)于廣州迪景微生物科技有限公司；血液增菌培養(yǎng)瓶購(gòu)于美國(guó) BD 醫(yī)療器械公司；質(zhì)譜專(zhuān)用基質(zhì)(一般細(xì)菌)購(gòu)于生物梅里埃公司；藥敏試驗(yàn)紙片購(gòu)于Oxoid Limited公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技公司；PCR Master Mix和2000 Marker購(gòu)于上海翊圣科技有限公司。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌 ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 15442由國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心提供。

1.2.2 主要儀器全自動(dòng)血培養(yǎng)儀(BDBACET/FX/200)購(gòu)自美國(guó) BD 醫(yī)療器械公司，迪爾細(xì)菌鑒定系統(tǒng) (DL-96Ⅱ)購(gòu)自珠海迪爾生物工程有限公司，全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)(VITEK MS IVD V3.2)購(gòu)自生物梅里埃公司，PE基因擴(kuò)增儀(PE-9700)購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，高電壓電泳儀(PowerPac HV)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，紫外線透射分析儀(UV-3C)購(gòu)自珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司。

1.2.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)按照《臨床微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序》《實(shí)用臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)與圖譜》等權(quán)威著作和執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)提供的方法[8-9]進(jìn)行。采集后的血培養(yǎng)標(biāo)本立即置于全自動(dòng)血培養(yǎng)儀中35 ℃孵育，24 h后需氧瓶報(bào)陽(yáng)性，立即取出置于生物安全柜內(nèi)進(jìn)行分離培養(yǎng)。用無(wú)菌注射器抽取需氧瓶中血液標(biāo)本適量，分別接種于血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板和中國(guó)藍(lán)瓊脂平板，同時(shí)進(jìn)行涂片及革蘭染色鏡檢。

1.2.4 質(zhì)譜儀鑒定依據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)和《中國(guó)臨床微生物質(zhì)譜應(yīng)用專(zhuān)家共識(shí)》[10]進(jìn)行質(zhì)譜操作和結(jié)果判讀。分離菌在血瓊脂平板生長(zhǎng)24 h后，用一次性無(wú)菌接種環(huán)挑取單個(gè)適量菌落，均勻涂布于靶板，用1 μL基質(zhì)液封板，置室溫干燥后使用VITEK MS IVD V3.2對(duì)分離菌進(jìn)行鑒定。以大腸埃希菌 ATCC 25922進(jìn)行質(zhì)控。

1.2.5 生化試驗(yàn)分離菌在血瓊脂平板生長(zhǎng)24 h后，挑取單個(gè)菌落溶于無(wú)菌生理鹽水，配置成0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙?，選擇迪爾96NE鑒定板，經(jīng)迪爾細(xì)菌鑒定系統(tǒng) DL-96Ⅱ進(jìn)行生化試驗(yàn)。

1.2.6 藥物敏感試驗(yàn)(antimicrobial susceptibility test，AST)參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI )M100抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(2019版)[11]中銅綠假單胞菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行。取0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙壕鶆蛲坎加贛H平板，每個(gè)平板貼的藥敏紙片不超過(guò)5個(gè)，并將平板置于35 ℃普通培養(yǎng)箱中，24 h后測(cè)量抑菌環(huán)的直徑進(jìn)行結(jié)果判讀。以銅綠假單胞菌ATCC 15442進(jìn)行質(zhì)控。

1.2.7 16S rRNA測(cè)序分析分離菌TS383在血瓊脂平板生長(zhǎng)48 h后，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA；實(shí)驗(yàn)所用16S rRNA通用引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGC-TCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACG-ACTT-3′)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)體系為：25 μL PCR Master Mix，上、下游引物和模板DNA各2 μL，加無(wú)核酸水補(bǔ)足至50 μL；反應(yīng)條件為：94 ℃，30 s；52℃，30 s；72 ℃，90 s，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物送北京睿博興科公司研發(fā)部進(jìn)行TA克隆測(cè)序。

1.2.8 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建根據(jù)16S rRNA測(cè)序結(jié)果，運(yùn)用在線Blast軟件進(jìn)行序列比對(duì)，選擇同源性較高的假單胞菌屬部分模式菌株，以醋酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobactercalcoaceticus，A.calcoaceticus)ATCC 23055作為外群菌株，運(yùn)用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。所有菌株16S rRNA序列均從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI) GenBank獲取。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)特征及生化特征

分離株TS383經(jīng)35 ℃ 24 h培養(yǎng)，在血瓊脂平板上可見(jiàn)圓形、皺紋菌落，直徑1～2 mm(見(jiàn)圖1A)；在中國(guó)藍(lán)瓊脂平板上為光滑菌落，微凸起，邊緣整齊(見(jiàn)圖1B)；在巧克力瓊脂平板上可見(jiàn)明顯的異質(zhì)性菌落特征(見(jiàn)圖1C)；固體培養(yǎng)基上的菌落都具有典型黃色色素。進(jìn)行涂片染色鏡檢，顯示為革蘭氏陰性桿菌，無(wú)芽孢，大多散在或成對(duì)排列。該菌氧化酶試驗(yàn)陰性，觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，其他生化特征如表1所示。

A: Cultured on blood agar. B: China blue agar. C: Chocolate agar.

表1 分離株TS383的生化特征(DL-96Ⅱ鑒定)

2.2 質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)鑒定

經(jīng)質(zhì)譜儀VITEK MS IVD V3.2鑒定，分離株TS383為棲稻假單胞菌，置信度為99.9%。

2.3 藥物敏感試驗(yàn)

分離株TS383對(duì)頭孢他啶、頭孢吡肟、慶大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、美羅培南均敏感，對(duì)氨曲南、氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢呋辛耐藥。

2.4 16S rRNA測(cè)序結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)為約1.5 kb的單一條帶(見(jiàn)圖2)，與目的條帶相符。經(jīng)北京睿博興科公司研發(fā)部進(jìn)行TA克隆測(cè)序，將序列遞交GenBank，獲得序列號(hào)MN911431.1，并運(yùn)用在線Blast軟件進(jìn)行序列比對(duì)。經(jīng)比對(duì)，分離株TS383與GenBank中耐冷假單胞菌(Pseudomonaspsychrotolerans，P.psychrotolerans)C36T和P.oryzihabitansNBRC 102199T(LMG 7040T)的同源性最高，分別是99.79%和99.73%。

圖2 分離株TS383的16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3所示。目前假單胞菌屬中的有效命名成員多達(dá)212個(gè)，因此只選擇16S rRNA基因序列同源性較高的部分假單胞菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。模式菌株序列從GenBank獲取，選擇A.calcoaceticusATCC 23055作為外群。使用軟件Mega 7.0比對(duì)序列，手工編輯去除不明確的核苷酸和缺口，并采用最大似然法(maximun likelihood)建樹(shù)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，分離株TS383與P.psychrotoleransC36T以及P.oryzihabitansNBRC 102199T(LMG 7040T)進(jìn)化距離最近，自展值為99%，結(jié)果可靠；且P.psychrotoleransC36T與已鑒定的5株棲稻假單胞菌歸為同一個(gè)集群，距離P.oryzihabitansNBRC 102199T(LMG 7040T)分支長(zhǎng)度為0，距離P.oryzihabitansIAM 1568T分支長(zhǎng)度<0.001，可見(jiàn)親緣關(guān)系十分相近。

Maximum likelihood was used to build the tree based on 16S rRNA sequence analysis. The number in the node is the reliability of the bootstrap test for 1 000 times.

3 討論

3.1 命名與鑒定

由于分類(lèi)學(xué)上存在爭(zhēng)議，棲稻假單胞菌命名經(jīng)過(guò)多次修改。1985年，因該菌形態(tài)學(xué)上類(lèi)似于假單胞菌并可從稻谷中大量分離得到，Kodama等[12]提出命名為棲稻假單胞菌。1987年, Holmes等[13]基于該菌與假單胞菌DNA雜交的同源性較低，提議新屬名黃色單胞菌屬，即棲稻黃色單胞菌(Flavimonasoryzihabitans，F(xiàn).oryzihabitans)。1997年，Anzai等[14]通過(guò)16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化分析方法，發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬、黃色單胞菌屬和金色單胞菌屬同源性>93.9%，提議三者列為同一屬，并入假單胞菌屬。原核生物有效命名表(List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature，LPSN)[15]上注釋該菌的正確命名為P.oryzihabitans，F(xiàn).oryzihabitans為同模異名(homotypic synonym)。

棲稻假單胞菌與假單胞菌屬中大部分菌種差異最為顯著的一點(diǎn)是，其氧化酶試驗(yàn)陰性，這值得微生物檢驗(yàn)人員注意。將本報(bào)告分離的TS383株與P.oryzihabitansHainan[16]和P.oryzihabitansNBRC 102199T的生化特征進(jìn)行對(duì)比，部分酶類(lèi)如鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、賴(lài)氨酸脫羧酶、尿素酶，部分糖類(lèi)如麥芽糖、蔗糖等項(xiàng)目，生化反應(yīng)結(jié)果都不盡相同，有時(shí)傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定儀無(wú)法準(zhǔn)確鑒定。國(guó)外有研究者認(rèn)為，棲稻假單胞菌屬于罕見(jiàn)致病菌，各分離株之間的表型特征差異難以鑒定到種的水平，建議采用16S rRNA測(cè)序等分子鑒定技術(shù)[5,17]。

3.2 與耐冷假單胞菌(P. psychrotolerans)的親緣關(guān)系

耐冷假單胞菌是需氧革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，菌落呈黃色，氧化酶試驗(yàn)陰性、觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，生長(zhǎng)溫度4～37 ℃，由Hauser等[18]在2004年發(fā)表有效命名。Tran等[19]在2017年對(duì)373個(gè)假單胞菌屬細(xì)菌的全基因組DNA-DNA雜交進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬，將有效模式種的基因組兩兩比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，P.psychrotoleransDSM 15758T(DSM 15758T=C36T)和P.oryzihabitansNBRC 102199T存在于同一個(gè)基因群(genospecies)中，2個(gè)菌株全基因組平均核苷酸一致性(average nucleotide identity，ANI)高達(dá)98.5%，意味著這兩種菌親緣關(guān)系密切。鑒于P.oryzihabitans發(fā)表時(shí)間早于P.psychrotolerans，本文提出P.psychrotolerans作為P.oryzihabitans的次定同物異名(junior synonym)。以上結(jié)果與本例分離株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中所揭示的P.psychrotoleransC36T與P.oryzihabitansNBRC 102199T(LMG 7040T)的親緣關(guān)系結(jié)果一致。本例分離株構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)僅基于16S rRNA序列，難免有局限性。而ANI分析基于所有直系同源蛋白編碼基因比較，克服了DNA-DNA雜交的繁復(fù)性和16S rRNA序列分析的保守性，成為目前原核生物分類(lèi)的金標(biāo)準(zhǔn)[20]，以ANI值的95%～96%作為分類(lèi)閾值，被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌種屬的重新分類(lèi)以及未知菌的鑒定。

3.3 耐藥性

本例分離株TS383的AST結(jié)果顯示對(duì)大部分抗菌藥敏感，包括頭孢他啶、頭孢吡肟、慶大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、美羅培南；而對(duì)氨曲南、氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢呋辛耐藥。這與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似。需要注意的是，國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)對(duì)3代頭孢菌素耐藥的棲稻假單胞菌分離株，其中頭孢曲松和頭孢他啶耐藥率分別達(dá)50%和37.5%[2, 6]，因此治療期間應(yīng)根據(jù)AST結(jié)果及時(shí)調(diào)整用藥方案。有報(bào)道指出，棲稻假單胞菌并非人體正常菌群[5]，根據(jù)本例患者的個(gè)人信息、入院時(shí)的感染指征、血培養(yǎng)分離得到純菌落以及AST結(jié)果，推斷該患者社區(qū)感染棲稻假單胞菌的可能性大。目前，棲稻假單胞菌感染的病例報(bào)道中甚少出現(xiàn)多器官功能衰竭患者，本例患者臨床給予泰能聯(lián)合莫西沙星治療，但預(yù)后極差，可見(jiàn)感染早期使用抗菌藥物的必要性。本報(bào)道結(jié)果提示，微生物檢驗(yàn)人員應(yīng)關(guān)注棲稻假單胞菌的案例報(bào)道和相關(guān)研究，以獲取更多資料為臨床診治提供依據(jù)。