梁天宇，李若瑜，劉偉

北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科，國家皮膚與免疫疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心，北京市皮膚病分子診斷重點實驗室，北京 100034

侵襲性真菌病(invasive fungal disease, IFD)是一類由真菌感染引起的死亡率較高的感染性疾病，多見于骨髓移植受者、實體器官移植受者、艾滋病患者等免疫功能受損的患者，其臨床預(yù)后有賴于早期診斷和有效的抗真菌藥物治療[1-2]。目前臨床上用于治療IFD的抗真菌藥物有唑類、棘白菌素類、多烯類和氟胞嘧啶。其中，多烯類抗真菌藥兩性霉素B(amphotericin B, AMB)自20世紀(jì)50年代問世以來，盡管存在嚴(yán)重的腎毒性，但因其抗菌譜廣、耐藥性低，被廣泛用于治療曲霉、隱球菌、假絲酵母(念珠菌)、毛霉、球孢子菌等引起的侵襲性真菌感染(invasive fungal infections, IFIs)[3-4]。為克服其毒副作用，對AMB進行結(jié)構(gòu)改造并發(fā)展出了脂質(zhì)劑型的AMB[5-7]，目前已應(yīng)用于臨床實踐。

病原性土曲霉對AMB天然耐藥[8]，新近還有耐AMB的構(gòu)巢曲霉和黃曲霉引起感染的報道[9-11]。既往認(rèn)為，AMB通過直接作用于真菌細胞膜上的麥角固醇而引起膜通透性增加，最終發(fā)揮抗真菌作用，但詳細的作用機制仍然不清楚。最近有學(xué)者在土曲霉對AMB耐藥性方面進行了系列研究[12-17]，提出了土曲霉對AMB耐藥的新機制，還對AMB在土曲霉中的作用機制提出新觀點[13]。這些研究雖然是針對土曲霉的，但對于認(rèn)識AMB在臨床上其他病原性曲霉中的作用機制和耐藥機制也具有重要的借鑒意義。本文針對這方面的研究進展進行綜述。

1 AMB的殺菌作用機制

以往認(rèn)為，AMB通過特異性結(jié)合真菌細胞膜上重要的脂質(zhì)組分麥角固醇而嵌入細胞膜中，形成跨膜離子通道(離子通道模型)，進而導(dǎo)致細胞膜通透性增加、鉀離子外流發(fā)揮其殺菌活性[18-21]；進一步研究認(rèn)為，AMB主要通過在細胞膜表面直接結(jié)合麥角固醇(表面吸附模型)，或通過聚合形成巨大的膜外聚合物(固醇海綿模型)、從膜磷脂雙分子層中吸附并綁定麥角固醇而發(fā)揮殺真菌作用，而跨膜離子通道的作用較小[22-23]；與此同時，AMB形成的膜外聚合物也結(jié)合人體細胞膜上的膽固醇，這是導(dǎo)致其毒性作用的主要原因[24]。最近研究揭示，AMB通過影響土曲霉線粒體呼吸鏈功能，導(dǎo)致細胞內(nèi)源性活性氧(reactive oxygen species, ROS)增加，引起細胞內(nèi)氧化損傷，從而發(fā)揮其抗真菌作用[25]。

1.1 真菌線粒體呼吸鏈結(jié)構(gòu)

真菌細胞中線粒體內(nèi)膜包含5個呼吸鏈膜蛋白復(fù)合體[26-27](見圖1)。

圖1 真菌線粒體電子傳遞鏈模式圖(UQ：泛醌；UQH2：還原性泛醌)

復(fù)合體Ⅰ：還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide，NADH)-泛醌還原酶，由至少35個亞基構(gòu)成，其中7個主要亞基為線粒體基因編碼，其余附屬亞基為核基因編碼。這些亞基在線粒體內(nèi)膜上共同參與組裝構(gòu)成復(fù)合體Ⅰ并維持其穩(wěn)定，調(diào)控其活性。復(fù)合體Ⅰ催化NADH的電子傳遞給泛醌，并將質(zhì)子由線粒體基質(zhì)轉(zhuǎn)移至線粒體膜間隙中。

復(fù)合體Ⅱ：又稱琥珀酸-泛醌還原酶，由4個亞基構(gòu)成，均由核基因編碼，可氧化琥珀酸生成延胡索酸，并將電子傳遞給泛醌，但并不伴隨質(zhì)子轉(zhuǎn)移。

復(fù)合體Ⅲ：泛醌-細胞色素C還原酶，由10個亞基組成，其中1個為線粒體編碼，其余由核基因編碼，其作用是將泛醌攜帶的電子傳遞給細胞色素C。

復(fù)合體Ⅳ：細胞色素C氧化酶，由12個亞基組成，其中4個亞基為線粒體基因編碼，其余為核基因編碼，其作用是催化氧分子生成水。

復(fù)合體V：即三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate，ATP)合成酶，由F0、F1子復(fù)合體構(gòu)成，其作用是利用復(fù)合體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ產(chǎn)生的跨膜質(zhì)子梯度來合成ATP。

1.2 真菌呼吸鏈上的電子傳遞

來自NADH的電子經(jīng)由復(fù)合體Ⅰ傳遞給泛醌，來自琥珀酸的電子經(jīng)由復(fù)合體Ⅱ傳遞給泛醌，泛醌接受復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ的電子生成還原性泛醌，并繼續(xù)將電子傳遞給復(fù)合體Ⅲ，復(fù)合體Ⅲ上的電子經(jīng)由細胞色素C傳遞給復(fù)合體Ⅳ，進一步將電子傳遞給氧分子，催化氧分子生成水。復(fù)合體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ在傳遞電子的同時，可將質(zhì)子從線粒體基質(zhì)泵入膜間隙中，在線粒體內(nèi)膜兩側(cè)產(chǎn)生質(zhì)子電化學(xué)梯度，復(fù)合體V利用這一質(zhì)子電化學(xué)梯度催化二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)和無機磷酸生成ATP[28]。同時，復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ也是產(chǎn)生ROS的主要部位[29-30]。

除上述經(jīng)典呼吸鏈上的復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ外，土曲霉線粒體氧化磷酸化系統(tǒng)中還存在一類替代氧化酶(alternative oxidase, AOX)，包括AOX1和 AOX2，由核基因編碼。AOX位于線粒體內(nèi)膜，可繞過復(fù)合物Ⅲ和Ⅳ而接受復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ傳遞給泛醌的電子，從而將氧還原為水，但較少生成ROS；這一替代氧化過程并不伴隨質(zhì)子的跨膜轉(zhuǎn)移，因此較少產(chǎn)生ATP[27]。

真菌在高能量需求或指數(shù)生長期時，由經(jīng)典復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ途徑進行電子傳遞，可產(chǎn)生大量ATP滿足生長需要；而在低能量需求或穩(wěn)定生長階段，則由AOX替代途徑進行電子傳遞，生成水和極少量ATP，ROS生成也少[35-36]。

1.3 AMB對真菌線粒體呼吸鏈的作用

經(jīng)AMB作用的敏感土曲霉(susceptibleAspergillusterreus, ATS)產(chǎn)生大量內(nèi)源性ROS，菌落生長受到明顯抑制[12]，這種情況在對AMB敏感的煙曲霉[37]和念珠菌[38]中亦可見到；抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)為非特異性巰基供體，可清除ROS，發(fā)揮抗氧化作用[39]；聯(lián)合使用NAC和AMB可降低內(nèi)源性ROS累積水平，并使AMB對ATS的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)升高，提示AMB通過引起ATS產(chǎn)生內(nèi)源性ROS而發(fā)揮抗真菌作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，AMB作用的ATS中，分別以ndufs1(復(fù)合體Ⅰ亞基)、sdhc(復(fù)合體Ⅱ亞基)、cytc1(復(fù)合體Ⅲ亞基)、cox15(復(fù)合體Ⅳ亞基)基因的轉(zhuǎn)錄水平代表的復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ表達水平均明顯增加，表明AMB可以促進復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ的表達，增強線粒體呼吸鏈的功能。利用抑制劑萎銹靈(復(fù)合體Ⅱ抑制劑)、抗霉素A(復(fù)合體Ⅲ抑制劑)、氰化鉀(復(fù)合體Ⅳ抑制劑)分別抑制復(fù)合體Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ時，并未影響ATS對AMB的敏感性，但利用魚藤酮(復(fù)合體Ⅰ抑制劑)抑制復(fù)合體Ⅰ后可使AMB的MIC升高[12]，AMB引起的內(nèi)源性ROS的產(chǎn)生明顯降低。

綜上所述，AMB可增強線粒體復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的功能，并通過增強復(fù)合體Ⅰ的功能促進內(nèi)源性ROS產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗真菌作用。

2 病原真菌對AMB的耐藥機制

2.1 麥角固醇合成途徑中基因的作用

已報道白念珠菌、光滑念珠菌、新型隱球菌、土曲霉、黃曲霉、煙曲霉等對AMB可產(chǎn)生耐藥性[3]。在酵母菌中，麥角固醇合成途徑中的一系列基因的缺失或突變(包括erg1、erg2、erg3、erg4、erg6和erg11等)[40]可影響細胞膜上固醇類的生物合成，進而導(dǎo)致細胞膜上麥角固醇含量減少，由于缺乏可替代的中間產(chǎn)物供AMB靶向結(jié)合，從而導(dǎo)致對AMB耐藥[3]。譬如，Vincent等[41]通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)，臨床分離的耐AMB的白念珠菌存在erg2或erg6突變，熱帶念珠菌存在erg3和erg11雙突變，通過分別構(gòu)建上述基因定向敲除菌株，證明上述erg基因突變可導(dǎo)致對AMB耐藥。

但是，Blum等[13-14]發(fā)現(xiàn)臨床分離的ATS、AMB天然耐藥株(resistantAspergillusterreus, ATR)及對AMB敏感的煙曲霉(susceptibleAspergillusfumigatus, AFS)菌株細胞膜麥角固醇的含量并無差異，提示土曲霉對AMB耐藥的機制與麥角固醇含量無關(guān)，與上述酵母菌中的情況不同。

2.2 熱休克蛋白的作用

熱休克蛋白90(heat shock protein 90, Hsp90)是廣泛存在于真核細胞中的進化上高度保守的分子伴侶蛋白，由N端結(jié)構(gòu)域(amino-terminal domain, NTD)、中間結(jié)構(gòu)域(middle domain, MD)、C端結(jié)構(gòu)域(carboxy-terminal domain, CTD)及MEEVD(Met-Glu-Glu-Val-Asp)基序組成，其中：NTD負(fù)責(zé)結(jié)合ATP；MD負(fù)責(zé)結(jié)合客戶蛋白(client proteins)并幫助后者正確折疊，形成成熟、穩(wěn)定的構(gòu)象；CTD負(fù)責(zé)形成Hsp90二聚體；而MEEVD基序則主要結(jié)合共伴侶分子(co-chaperones)，后者可以輔助客戶蛋白的正確折疊。在釀酒酵母中，Hsp90可以與約10%的蛋白相互作用[42-43]，通過調(diào)節(jié)其客戶蛋白如轉(zhuǎn)錄因子、激酶及其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的折疊、轉(zhuǎn)運、成熟和降解，從而廣泛參與細胞內(nèi)信號通路的調(diào)節(jié)以及適應(yīng)性表型的產(chǎn)生和維持[43]。

Hsp90可通過MD結(jié)構(gòu)域直接與其客戶蛋白鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin)的催化亞單位相互作用，幫助后者維持構(gòu)象穩(wěn)定。鈣調(diào)磷酸酶是一種Ca2+-鈣調(diào)蛋白(calmodulin, CaM)調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，在菌絲生長、刺激適應(yīng)、菌核和附著孢發(fā)育及胞壁完整性的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[44-45]。在大多數(shù)絲狀真菌中[46-48]，鈣調(diào)磷酸酶是由一個催化亞基CnA和一個調(diào)節(jié)亞基CnB構(gòu)成的異二聚體，CnA亞基包含催化結(jié)構(gòu)域(catalytic domain)、 CnB結(jié)合域(CnB binding domain)、 CaM結(jié)合域(CaM binding domain)和自身抑制域(auto-inhibitory domain, AID)共4個結(jié)構(gòu)域；CnB亞基是一種Ca2+結(jié)合蛋白，結(jié)合Ca2+后可形成緊密構(gòu)象，引起CnA亞基中AID及催化結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化和活性位點暴露，幫助其發(fā)揮催化功能。

Cowen等[49]證明Hsp90通過快速選擇機制，在多種真菌耐藥突變及表型的產(chǎn)生和維持過程中發(fā)揮重要作用，但不同種的真菌影響的藥物種類不同：抑制Hsp90或calcineurin可明顯降低由臨床分離的白念珠菌對氟康唑和伏立康唑的耐藥性，但其對卡泊芬凈的敏感性無明顯影響；相反，抑制Hsp90或calcineurin可明顯降低土壤中分離的土曲霉菌株對卡泊芬凈的耐藥性，但并未影響其對氟康唑的耐藥性。在體外，Hsp90抑制劑格爾德霉素(geldanamycin)或其衍生物17-dimethylaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-DMAG)與AMB具有協(xié)同作用，可顯著降低 AMB 對 ATR 的MIC；AMB與鈣調(diào)磷酸酶抑制劑環(huán)孢素A聯(lián)用也具有相似的作用；與AFS相比，ATR和ATS具有更高的Hsp90基礎(chǔ)表達水平，這一點可能使土曲霉對AMB引起的細胞膜應(yīng)激和環(huán)境變化具有更強的適應(yīng)性[15]，說明Hsp90或鈣調(diào)磷酸酶活性增強促進了土曲霉對AMB所致應(yīng)激的適應(yīng)性。

熱休克蛋白70(heat shock protein 70, Hsp70)家族是另一類與Hsp90共同組成細胞內(nèi)監(jiān)視網(wǎng)絡(luò)的分子伴侶，除古生菌外在所有物種中高度保守，其家族成員N端均含有高度保守的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(NBD)及位于C端的序列多變的底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域[16]。相比于Hsp90，Hsp70的靶蛋白更加龐雜，且可以與未折疊、錯誤折疊及相互聚集的底物蛋白相互作用，幫助其正確折疊并維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[50]。當(dāng)體外暴露于AMB的ATR中，Hsp70家族成員ssa和ssb的量在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平均顯著升高；利用抑制劑pifithrin-μ抑制Hsp70后，AMB對ATR的MIC明顯降低(從≥32 μg/mL降至 ≤1 μg/mL)；聯(lián)合使用AMB和pifithrin-μ治療感染ATR的大蠟螟，可改善療效，提高生存率[16]，也證實了這種協(xié)同作用。 Hsp70活性增強，可促進AMB的耐藥性；而抑制Hsp70活性可作為治療ATR引起侵襲性曲霉病的潛在研究方向。

2.3 線粒體氧化磷酸化系統(tǒng)的作用

比較ATS和ATR時發(fā)現(xiàn)：未暴露于AMB時，ATS的基礎(chǔ)耗氧速率是ATR的3.3倍，其線粒體拷貝數(shù)更高(高約23%)，生長速度更快[12]，毒力更強[51-52]，這與敏感菌株生長快、毒力強的描述是一致的[41]；暴露于AMB時，ATS的線粒體拷貝數(shù)進一步增加，內(nèi)源性ROS大量產(chǎn)生，而ATR的線粒體拷貝數(shù)進一步減少，內(nèi)源性ROS產(chǎn)生水平更低[12]。由于線粒體拷貝數(shù)的多寡與線粒體呼吸鏈活性高低一致，因此當(dāng)ATR中線粒體拷貝數(shù)減少時，其耗氧速率降低，相應(yīng)地內(nèi)源性ROS生成減少，從而導(dǎo)致耐藥性增強。

進一步研究發(fā)現(xiàn)[12]，暴露于AMB的ATS線粒體復(fù)合體Ⅰ表達水平顯著升高，aox表達水平輕度升高，ROS的生成增多；暴露于AMB的ATR的線粒體復(fù)合體Ⅰ表達水平僅輕度升高，而AOX表達水平顯著升高，ROS的生成相對減少。如前所述，復(fù)合體Ⅰ活性的降低可減少ATS中ROS的生成，AOX高表達也可能參與抑制ROS生成[35-36]；進一步利用水楊羥肟酸(salicylhydroxamic acid, SHAM)抑制ATR中AOX的活性，則內(nèi)源性ROS水平明顯增加、AMB的MIC明顯下降[12]，再次提示AOX的高表達可導(dǎo)致ATR中ROS生成減少，產(chǎn)生耐藥性，因此AOX可作為抗真菌藥物的潛在靶點。

總之，AMB通過增強呼吸鏈經(jīng)典途徑中線粒體復(fù)合體Ⅰ的功能而促進真菌細胞產(chǎn)生內(nèi)源性ROS，最終發(fā)揮抗真菌作用。暴露于AMB的ATR中，呼吸鏈經(jīng)典途徑中線粒體復(fù)合體Ⅰ表達水平僅輕度升高，不及ATS中顯著；而替代途徑AOX功能顯著增強，內(nèi)源性ROS生成相對減少，最終產(chǎn)生耐藥性。

2.4 ROS清除系統(tǒng)的作用

ROS是真核細胞呼吸鏈過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，及時清除ROS對于維持其正常的生命活動具有重要作用。真核細胞中存在多種ROS 清除系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)等。當(dāng)細胞內(nèi)源性ROS生成增多引起氧化應(yīng)激時，可誘導(dǎo)上述ROS清除酶的表達，減少細胞內(nèi)的氧化損傷[26]。

研究表明，未暴露于AMB時[52]，ATR中SOD的活性約為ATS中的2倍，而CAT 表達水平無明顯差異，說明ATR較ATS清除ROS的能力更強；暴露于AMB后，ATS中SOD和CAT的表達水平無明顯變化，但在ATR中均明顯增加，說明AMB可促使ATR增強對ROS的清除能力。利用抑制劑N,N-二甲基二硫代氨基甲酸(N-N-diethyldithiocarbamate, DDC)和3-氨基-1,2,4-三氮唑(3-amino-1,2,4-triazole, 3-AT)分別抑制SOD和CAT的活性，均可使ATR中內(nèi)源性ROS水平明顯增加，AMB的MIC降至敏感水平；且在ATS中，抑制SOD或CAT可使AMB的MIC進一步降低。總之，ATR中SOD和CAT活性增強，可快速清除內(nèi)源性ROS，是ATR對AMB耐藥的可能機制之一；且抑制真菌SOD和CAT活性，可作為潛在的抗真菌治療靶點。

3 結(jié)語

如圖2總結(jié)所示，AMB的抗真菌作用機制包括：①AMB直接結(jié)合真菌細胞膜麥角固醇和(或)形成細胞膜離子通道，破壞真菌細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，影響細胞內(nèi)外離子水平和滲透壓改變；②AMB增加土曲霉線粒體拷貝數(shù)，增強線粒體呼吸鏈經(jīng)典途徑中復(fù)合體Ⅰ的活性，產(chǎn)生大量內(nèi)源性ROS，從而引起真菌細胞的氧化損傷。

圖2 AMB抗真菌作用機制和耐藥機制(紅色箭頭代表作用機制，藍色箭頭代表耐藥機制)

病原真菌對AMB的耐藥機制包括：①酵母中麥角固醇合成途徑基因突變或缺失，導(dǎo)致細胞膜麥角固醇含量減少而使靶向結(jié)合物缺乏；②土曲霉中分子伴侶Hsp90、鈣調(diào)磷酸酶及Hsp70的活性升高，增強了其對AMB所致應(yīng)激的適應(yīng)性；③土曲霉線粒體拷貝數(shù)減少，耗氧速率降低，內(nèi)源性ROS生成減少；④土曲霉經(jīng)AMB作用后，呼吸鏈經(jīng)典途徑中線粒體復(fù)合體Ⅰ活性無顯著升高，同時替代途徑AOX功能顯著增強，內(nèi)源性ROS生成減少；⑤土曲霉ROS清除酶CAT、SOD活性增強所致的內(nèi)源性ROS清除增強。