謝輝，祁芝珍，楊曉艷，袁靜，李翔，趙海紅

1. 青海省地方病預(yù)防控制所，青海 西寧 811602； 2. 首都兒科研究所，北京 100020

鼠疫是一種嚴(yán)重危害人類健康且極易造成大流行的自然疫源性疾病，具有發(fā)病急、病死率高的特點(diǎn)，是《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》[1]中規(guī)定的甲類傳染病。近年來(lái)，全球人間鼠疫疫情呈上升趨勢(shì)，在一些靜息了近30年的鼠疫疫源地又出現(xiàn)了流行[2]。2017年，非洲馬達(dá)加斯加肺鼠疫暴發(fā)，引起了世界性的恐慌。2019年，蒙古國(guó)發(fā)生了人間鼠疫疫情，同年我國(guó)內(nèi)蒙古2例鼠疫患者輸入至北京[3]。這些情況表明鼠疫疫情從靜息轉(zhuǎn)入活躍，從邊遠(yuǎn)地區(qū)向城市人口密集區(qū)逼近。

鼠疫由鼠疫耶爾森菌(Yersiniapestis)引起，該菌通過(guò)染疫媒介叮咬或接觸染疫動(dòng)物而傳播給人類。因此，為了有效控制動(dòng)物間疫情避免波及人間，加強(qiáng)鼠疫疫源地動(dòng)物間鼠疫的監(jiān)測(cè)是預(yù)警預(yù)測(cè)的重要手段。近年來(lái)，鼠疫的活躍疫源地大多位于貧困、偏僻地區(qū)，現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)條件簡(jiǎn)陋，因此研究一種快速、特異、簡(jiǎn)便，特別是適用于野外現(xiàn)場(chǎng)使用的診斷方法對(duì)于鼠疫防治工作具有重要意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)為恒溫核酸擴(kuò)增方法，其原理是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)[4]。有研究報(bào)道，3a作為鼠疫耶爾森菌特異的染色體序列，可以特異性擴(kuò)增鼠疫耶爾森菌3個(gè)生物型中的所有試驗(yàn)菌株[5]，因此可考慮將其用于鼠疫耶爾森菌的檢測(cè)。

我國(guó)有11個(gè)鼠疫自然疫源地[6]，不同疫源地的鼠疫耶爾森菌的宿主、生態(tài)地理環(huán)境及基因組有所不同。為考察LAMP是否能夠檢測(cè)我國(guó)不同疫源地鼠疫耶爾森菌的所有基因組型，本研究對(duì)基于3a靶序列設(shè)計(jì)特異性引物的LAMP 技術(shù)檢測(cè)鼠疫耶爾森菌的敏感性和特異性進(jìn)行觀察。選取我國(guó)各疫源地分離的野生鼠疫耶爾森菌65株，進(jìn)行LAMP檢測(cè)，同時(shí)將與鼠疫耶爾森菌近源的假結(jié)核耶爾森菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌及非近源的大腸埃希菌作為對(duì)照菌以評(píng)價(jià)其特異性，判斷其是否可用于基層現(xiàn)場(chǎng)鼠疫監(jiān)測(cè)，從而為早期發(fā)現(xiàn)動(dòng)物間鼠疫及防止疫情波及人間提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及儀器LAMP與聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)引物由北京擎科生物有限公司合成。Loopamp?朗報(bào)?DNA擴(kuò)增試劑盒(批號(hào)98004)、Loopamp熒光目視檢測(cè)試劑盒(批號(hào)98002)由北京成志科為生物科技有限公司提供；鼠疫膠體金免疫層析試紙(批號(hào)202001)由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供；TaqDNA聚合酶(批號(hào)：G326KA4962)、DNA Marker(批號(hào)：G320KA4962)由上海生工生物工程股份有限公司提供；中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)管(批號(hào)2018-1)由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。恒溫水浴箱ZC-22Q購(gòu)于杭州卓馳儀器有限公司，PCR擴(kuò)增儀購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司，多用電泳儀購(gòu)于北京六一儀器廠。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株測(cè)試菌株為65株鼠疫耶爾森菌株，分別從我國(guó)11個(gè)鼠疫自然疫源地不同宿主動(dòng)物中分離獲得；減毒菌株EV76由鼠疫耶爾森菌專業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供，特異性結(jié)果如表1所示。對(duì)照菌株為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌4種血清型、假結(jié)核耶爾森菌15種血清型及1株大腸埃希菌ATCC 9610，均由鼠疫耶爾森菌專業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供(見(jiàn)表1)。

表1 RHA、GICA、PCR和LAMP檢測(cè)鼠疫耶爾森菌的特異性

(續(xù)表1)

1.2 鼠疫耶爾森菌常規(guī)檢測(cè)方法

1.2.1 反向間接血凝試驗(yàn)(reverse indirect haemagglutination，RIHA)分別取65株野生鼠疫耶爾森菌純培養(yǎng)物制備菌懸液，按照鼠疫診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS297-2008)[7]中的方法進(jìn)行RIHA。

1.2.2 鼠疫膠體金免疫層析法(colloidal gold immunochromatography assay，RGICA)取上述菌懸液的上清液200 μL，加入膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)孔內(nèi)，15 min后觀察結(jié)果。陽(yáng)性結(jié)果為可見(jiàn)2條顯色帶，陰性結(jié)果為僅見(jiàn)1條顯色帶，同時(shí)做空白對(duì)照。

1.2.3 PCR取細(xì)菌培養(yǎng)物0.5 mL，12 000 r/min離心2 min， 用0.5 mL滅菌純水重懸沉淀物，100 ℃加熱10 min，12 000 r/min離心3 min，取上清液作為DNA模板，按照鼠疫診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS297-2008)[7]中的方法，采用PCR檢測(cè)鼠疫耶爾森菌并判定結(jié)果，以鼠疫耶爾森菌EV76為內(nèi)部對(duì)照。PCR體系含10×Buffer 3.0 μL、10 mmol/L dNTP 0.1 μL、5 U/μLTaqDNA聚合酶0.2 μL、10 μmol/L配對(duì)引物1.0 μL、模板 DNA(2 ng/μL)5.0 μL，最后用去離子水補(bǔ)足至30 μL。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性 40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸3 min。PCR引物序列如下：F1上游引物為5′-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3′；下游引物為5′-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3′。目的片段長(zhǎng)度為249 bp。

1.3 LAMP技術(shù)優(yōu)化及菌株檢測(cè)

根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)公布的鼠疫耶爾森菌3a基因序列(GenBank登錄號(hào)AF350075)，用PrimerExplorer version 4在線軟件設(shè)計(jì)LAMP引物，包括外引物F3、B3，內(nèi)引物FIP、BIP以及相應(yīng)的環(huán)引物(見(jiàn)表2)。各菌株DNA模板的制備同上。

表2 LAMP引物序列

LAMP反應(yīng)體系及反應(yīng)條件優(yōu)化如下：反應(yīng)體系包括2×Reaction Mix 12.5 μL、混合引物1 μL(引物F3、B3濃度均為5 pmol/L，引物BIP、FIP濃度均為40 pmol/L)、BstDNA聚合酶1 μL、DNA模板2 μL、熒光染料1 μL，用滅菌純水補(bǔ)至25 μL，恒溫水浴加熱。溫度按60 ℃、65 ℃、70 ℃遞增，反應(yīng)時(shí)間按30、60、90 min遞增，確定最佳反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間。

敏感性實(shí)驗(yàn)：根據(jù)比濁法測(cè)定EV76菌液密度。將菌液10倍倍比稀釋至1.0×104/L，取各密度菌液制備模板(方法同 1.2.3)用于LAMP檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后直接觀察顏色變化以進(jìn)行結(jié)果判定。

特異性實(shí)驗(yàn)：取65株鼠疫耶爾森菌菌株和對(duì)照菌株(小腸結(jié)腸炎耶爾森菌4種血清型、假結(jié)核耶爾森菌15種血清型及1株大腸埃希菌ATCC 9610)菌液制備模板(方法同 1.2.3)，使用LAMP技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后直接觀察顏色變化以進(jìn)行結(jié)果判定。

結(jié)果判定：以鈣黃綠素作為熒光指示劑，反應(yīng)結(jié)束后肉眼觀察反應(yīng)管內(nèi)顏色變化，進(jìn)行結(jié)果判定，綠色為陽(yáng)性結(jié)果，橘紅色為陰性結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)檢測(cè)法結(jié)果

經(jīng)常規(guī)檢測(cè)法(包括RIHA、RGICA和PCR)檢測(cè)，65株鼠疫耶爾森菌均為陽(yáng)性，而小腸結(jié)腸炎耶爾森菌4種血清型、假結(jié)核耶爾森菌15種血清型和1株大腸埃希菌ATCC 9610均為陰性。

2.2 LAMP技術(shù)優(yōu)化

利用EV76菌株摸索LAMP的反應(yīng)條件。根據(jù)引物Tm值確定優(yōu)化反應(yīng)的溫度按60、65、70 ℃遞增，反應(yīng)時(shí)間按30、60、90 min遞增，經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)證明65 ℃為最佳反應(yīng)溫度，最佳反應(yīng)時(shí)間為60 min。

2.3 LAMP技術(shù)的敏感性

將EV76菌株進(jìn)行梯度稀釋，采用LAMP技術(shù)檢測(cè)，每個(gè)反應(yīng)體系含菌量由高到低依次為2×104/mL、2×103/mL、2×102/mL和20/mL，另有一體系含細(xì)菌DNA 2 pg/mL。目視LAMP熒光檢測(cè)最低能檢出20個(gè)菌/L(見(jiàn)圖1)。

Amount of bacteria in each tube: 2×104/mL in tube 1, 2×103/mL in tube 2, 2×102/mL in tube 3, 20/mL in tube 4. There was 2 pg/mL of bacterial DNA in tube 5. Tube 6 was set as blank control and tube 7 as positive control.

2.4 LAMP技術(shù)的特異性

結(jié)果顯示，65株鼠疫耶爾森菌反應(yīng)管均呈綠色，為陽(yáng)性結(jié)果；其他菌株反應(yīng)管呈橘紅色，為陰性結(jié)果，表明LAMP檢測(cè)鼠疫耶爾森菌具有良好的特異性(見(jiàn)表1)。各疫源地鼠疫耶爾森菌代表株的檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。

In tubes 1-11, there were the representative strains of Y. pestis from 11 plague natural foci in China. In tubes 12 and 13, there were Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis strains. PTB17 was in tube 14 and E. coli ATCC 25922 was in tube 15. Tube 16 was set as blank control, and tube 17 as positive control.

3 討論

鼠疫監(jiān)測(cè)是我國(guó)鼠疫防治的主要措施，但目前基層應(yīng)用的鼠疫耶爾森菌傳統(tǒng)診斷方法存在繁瑣、費(fèi)時(shí)、使用精密儀器受條件限制等不足，導(dǎo)致漏檢，不能有效反映動(dòng)物鼠疫流行情況。因此，為提高動(dòng)物鼠疫監(jiān)測(cè)效力，探索建立一種操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、敏感性高的鼠疫耶爾森菌快速檢測(cè)方法是非常必要的。

LAMP是Notomi等[4]于2000年研發(fā)的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其工作原理是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。于學(xué)東等[5]曾評(píng)價(jià)3a作為鼠疫耶爾森菌特異的染色體序列，可以特異擴(kuò)增鼠疫耶爾森菌3個(gè)生物型中的所有實(shí)驗(yàn)菌株，為此本研究使用3a靶序列設(shè)計(jì)合成4條LAMP引物(包括環(huán)引物)，利用鏈置換DNA聚合酶于65 ℃保溫60 min，完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。鼠疫耶爾森菌為腸桿菌科耶爾森菌屬，與同屬的假結(jié)核耶爾森菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的DNA部分同源[8]，在形態(tài)、培養(yǎng)特性、抗原結(jié)構(gòu)等方面非常相似，鑒別較為困難，而且這3種菌都可感染人和動(dòng)物，往往在鼠疫自然疫源地發(fā)生或流行[9-10]。因此，本研究選取與鼠疫耶爾森菌近源的假結(jié)核耶爾森菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌及非近源的大腸埃希菌作為對(duì)照菌株來(lái)驗(yàn)證LAMP法的特異性。結(jié)果表明，65株鼠疫耶爾森菌的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，而相關(guān)的近源株和非近源株的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，提示LAMP法具有較高的特異性，能夠用于我國(guó)不同鼠疫疫源地野生菌株的檢測(cè)。

目前，鼠疫耶爾森菌的常規(guī)檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)、PCR法等，但它們非特異性較高，敏感性較低，在實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化方面也存在一些問(wèn)題[11]，而且耗時(shí)(需要3～5 d)，不適于快速診斷。普通PCR是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)鼠疫耶爾森菌的常規(guī)技術(shù)，其以鼠疫耶爾森菌的纖維蛋白溶酶原活性因子pla基因和FI抗原基因?yàn)槟康幕?，通過(guò)體外擴(kuò)增，結(jié)合DNA探針技術(shù)而建立。但有研究發(fā)現(xiàn)，鼠疫耶爾森菌的3個(gè)毒力質(zhì)粒在自然分離株中均有丟失現(xiàn)象，因此基于質(zhì)粒上抗原或DNA的檢測(cè)方法可能存在漏檢[12]，而且 PCR等分子生物學(xué)方法在診斷時(shí)需要特殊儀器，模板熱變性及長(zhǎng)時(shí)間溫度循環(huán)也不利于鼠疫監(jiān)測(cè)時(shí)大量樣本的篩查應(yīng)用[13]。RIHA和RGICA 是鼠疫診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS297-2008)[7]中規(guī)定的鼠疫診斷方法，本研究也表明LAMP與RIHA、RGICA、PCR等方法均可特異性檢出鼠疫耶爾森菌，符合率為100%。膠體金法因快速、結(jié)果易判而被廣泛應(yīng)用，但資料提示現(xiàn)用的檢測(cè)鼠疫抗原的膠體金免疫層析試紙條都是以FI單克隆抗體為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的，如遇現(xiàn)場(chǎng)材料缺失FI抗原則易漏檢[14]。研究表明，GICA檢測(cè)鼠疫耶爾森菌最低菌液濃度為6.0×104/mL，RIHA檢測(cè)最低菌液濃度為1.3×105/mL[15]，而本研究采用的LAMP敏感性很高，最低可測(cè)出20個(gè)菌/mL，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]。在其反應(yīng)體系中加入熒光染料，根據(jù)顏色可肉眼判定結(jié)果[17-18]，不需要精密儀器，無(wú)須對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳等后續(xù)處理，提取DNA加LAMP檢測(cè)全過(guò)程可于1 h內(nèi)完成。

綜上所述，LAMP技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)便、敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，克服了PCR技術(shù)的種種缺陷與不確定因素，適用于大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查，可用于鼠疫監(jiān)測(cè)工作和快速檢測(cè)，但其用于鼠疫耶爾森菌現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的效果還有待進(jìn)一步評(píng)估。