王 英 朱發(fā)偉 樓招歡

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是冠心病等心腦血管病的關(guān)鍵病理基礎(chǔ)，脂質(zhì)代謝異常是AS 發(fā)生發(fā)展的主要誘因[1]。膽固醇酯在巨噬細(xì)胞內(nèi)過度堆積形成泡沫細(xì)胞是AS 的典型病理特征[2]，減少脂質(zhì)在動脈管壁的沉積，能有效阻止AS 的發(fā)生發(fā)展。已知桑葉水提取物[3]、桑葉總黃酮[4]能有效減少脂肪積累，促進(jìn)膽固醇代謝，預(yù)防AS 的發(fā)生發(fā)展。課題組前期研究結(jié)果顯示，由新鮮桑葉經(jīng)特殊工藝制成的桑抹茶能有效降低高脂血癥模型大鼠血清膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）水平，提高血清高密度脂蛋白（HDL-C）水平，降低動脈硬化指數(shù)，上調(diào)高脂血癥模型大鼠胸主動脈肝X 受體α（LXRα）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）表達(dá)，改善血管病理改變[5]。提示桑抹茶可能通過促進(jìn)膽固醇從動脈壁細(xì)胞流出，減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，發(fā)揮防治AS 作用[6]。本文擬在此基礎(chǔ)上，通過佛波酯誘導(dǎo)的THP-1 泡沫細(xì)胞模型[7-8]，觀察桑抹茶對巨噬細(xì)胞膽固醇攝取及沉積的作用，探討桑抹茶抗AS 的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株 THP-1 細(xì)胞（批號SCSP-567，中國科學(xué)院細(xì)胞庫）。

1.2 藥 物 桑抹茶（批號20180809，杭州沃亞生物科技有限公司），桑抹茶加10BV 水超聲30min，離心，取上清，重復(fù)2 次；減壓濃縮，凍干，即得。

1.3 試 劑 佛波肉荳蔻醋酸（PMA，5mg/mL，批號50601ES02，上海翊圣生物科技有限公司）；人源氧化低密度脂蛋白（Human Ox-LDL，2mg/mL，批號20605ES05），人源紅色熒光標(biāo)記氧化型低密度脂蛋白（Human Dil-Ox-LDL，500μg，批號609ES76），均購自上海翊圣生物科技有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)基（批號GNM-31800S，杭州吉諾生物）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，批號ST1537，碧云天）；總膽固醇（T-CHO）檢測試劑盒（批號A111-1，南京建成）；油紅O 染料（批號WSIG0100803，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；PPARγ 抗體（批號YM3443，ImmunoWay）、腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ABCA1）抗體（批號bs-1627R，博奧森）。

1.4 儀 器 BA410 生物顯微鏡、Adavance 3.2 圖像分析系統(tǒng)（Motic 公司），Ti-S、EVOS FL 熒光倒置顯微鏡（尼康），Milli-Q Synthesis A10 純水儀（美國MILLIPORE 公司），Power Wave 340 酶標(biāo)儀（美國Bio-TeR）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 THP-1 源性泡沫細(xì)胞模型制備 THP-1 單核細(xì)胞生長于含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。每48～72h傳代1 次。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以1×105cell/mL 點(diǎn)96 孔板，每孔200μL 體積，實(shí)驗(yàn)前用160nmol/L 佛波酯孵育THP-1 單核細(xì)胞24h，使其誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞。待其貼壁生長融合至80%左右，換含0.3% BSA 的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，給予50μg/mL Ox-LDL 處理48h。

2.2 MTT 法檢測桑抹茶對THP-1 源性泡沫細(xì)胞增殖活力的影響 實(shí)驗(yàn)分為正常對照組：佛波酯誘導(dǎo)的THP-1 源性巨噬細(xì)胞，模型對照組：佛波酯+Ox-LDL 誘導(dǎo)的THP-1 源性泡沫細(xì)胞；藥物干預(yù)組：THP-1 源性泡沫細(xì)胞+不同濃度（10、20、40、80、160、320、640μg/mL）桑抹茶提取物；同時設(shè)RPMI 1640培養(yǎng)基為空白對照。藥物干預(yù)組培養(yǎng)液中加入不同濃度桑抹茶水提物干預(yù)24h，其余各組加入培養(yǎng)基干預(yù)24 后，加20μL MTT 孵育4h，加入DMSO 150μL震蕩10min，于570nm 處測定吸光度A570，以對照組調(diào)零，細(xì)胞存活率=（加藥組平均A 值/正常對照組平均A 值）×100%。

2.3 油紅O 染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積 將THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于放有蓋玻片的6 孔培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞后貼壁生長于培養(yǎng)板。換含0.3%BSA 的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3h，再予以高、中、低濃度的桑抹茶提取物（93、186、372μg/mL）處理24h 后加入Human Ox-LDL，使其終濃度為20μg/mL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h 后，用PBS 液沖洗3次，每次5min；4%多聚甲醛固定10min，油紅O 染色液染色10min，棄上清，60%異丙醇清洗1 次，再用PBS 洗滌3 次，顯微鏡觀察并拍照。采用Image J 1.46r（Wayne Rasband National Institutes of Health，USA）圖像分析系統(tǒng)對油紅O 染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

2.4 熒光顯微鏡下觀察THP-1 源性巨噬細(xì)胞內(nèi)吞Ox-LDL 的變化 取THP-1 細(xì)胞，分為THP-1 源性泡沫細(xì)胞組、THP-1 源性泡沫細(xì)胞+不同濃度桑抹茶提取物作用組（93、186、372μg/mL）；將THP-1 細(xì)胞培養(yǎng)于放有蓋玻片的6 孔培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞后貼壁生長于培養(yǎng)板。換含0.3%BSA的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3h，再予以不同濃度的桑抹茶提取物（93、186、372μg/mL）處理24h，然后加入Human Dil-Ox-LDL，使其終濃度為20μg/mL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，PBS 洗滌3 次，熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.5 Western blot 法檢測PPARγ、ABCA1 蛋白表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)分組及處理同“2.3”。收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 緩沖液洗滌3 次，按細(xì)胞膜蛋白抽提試劑盒提取膜蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。50μg 膜蛋白樣品與上樣緩沖液按比例混合后煮沸5min，SDS-PAGE 電泳，WB 濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2h，TBST 漂洗3 次后分別加入一抗和GAPDH，4℃孵育過夜，TBST 漂洗3 次，37℃二抗反應(yīng)2h，進(jìn)行ECL 顯色。以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算各處理組目的蛋白的相對表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，兩組間比較采用t-test，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 桑抹茶對THP-1 源性泡沫細(xì)胞增殖活力的影響 細(xì)胞增殖活力檢測結(jié)果顯示（見表1），在10～160μg/mL 范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，桑抹茶提取物對THP-1 源性巨噬細(xì)胞活性的抑制作用逐漸增強(qiáng)（P＜0.05），至200μg/mL 后相對平緩；桑抹茶提取物對THP-1 源性巨噬細(xì)胞抑制作用的IC50 為186.7μg/mL。

3.2 桑抹茶對THP-1 泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的影響圖1 結(jié)果顯示，與未經(jīng)Ox-LDL 處理的細(xì)胞相比，佛波酯+Ox-LDL 處理的THP-1 源性巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積（紅染）明顯，提示泡沫細(xì)胞形成；桑抹茶提取物呈濃度依賴性地降低THP-1 泡沫細(xì)胞脂質(zhì)沉積程度（P＜0.01），見表2。

表1 各組細(xì)胞活力比較（%）

表1 各組細(xì)胞活力比較（%）

注：Ox-LDL 為氧化低密度脂蛋白；與對照組比較，aP＜0.05；與Ox-LDL模型組比較，bP＜0.05

表2 各組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平比較（IOD/Area）

表2 各組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平比較（IOD/Area）

注：Ox-LDL 為氧化低密度脂蛋白；與對照組比較，aP＜0.01；與Ox-LDL模型組比較，bP＜0.01；與Ox-LDL+桑抹茶93μg/mL 組比較，cP＜0.05；n為實(shí)驗(yàn)次數(shù)

3.3 桑抹茶對THP-1 源性巨噬細(xì)胞內(nèi)吞Ox-LDL的影響 熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，給予桑抹茶提取物預(yù)處理，能濃度依賴地抑制THP-1 源性泡沫細(xì)胞對Ox-LDL 的攝取，減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，見圖2。

圖1 桑抹茶提取物對THP-1 源性巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的影響（油紅O 染色×200）

圖2 桑抹茶提取物對THP-1 源性巨噬細(xì)胞內(nèi)吞Ox-LDL 的變化（×200）

3.4 桑抹茶對THP-1 泡沫細(xì)胞PPARγ、ABCA1 蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot 結(jié)果顯示，與對照組比較，THP-1 泡沫細(xì)胞ABCA1 蛋白表達(dá)增加，PPARγ 蛋白表達(dá)水平顯著降低；與模型組比較，桑抹茶提取物能濃度依賴地增加THP-1 源性泡沫細(xì)胞ABCA1、PPARγ 蛋白表達(dá)水平（P＜0.01），見圖3，表3。

圖3 各組細(xì)胞ABCA1、PPARγ 蛋白表達(dá)

表3 各組細(xì)胞ABCA1、PPARγ 蛋白表達(dá)量比較（）

表3 各組細(xì)胞ABCA1、PPARγ 蛋白表達(dá)量比較（）

注：Ox-LDL 為氧化低密度脂蛋白；ABCA1 為腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1；PPARγ 為過氧化物酶體增殖物激活受體γ；n 為實(shí)驗(yàn)次數(shù)；與對照組比較，aP＜0.01；與Ox-LDL 模型組比較，bP＜0.01；與Ox-LDL+桑抹茶93μg/mL 組比較，cP＜0.01；與Ox-LDL+桑抹茶186μg/mL 組比較，dP＜0.01

4 討論

已知血脂代謝異常是動脈粥樣硬化的重要誘因。由異常升高的低密度脂蛋白（LDL）氧化修飾形成的氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）侵入并沉積于血管內(nèi)膜，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，觸發(fā)炎癥反應(yīng)；而由單核細(xì)胞黏附并活化的巨噬細(xì)胞通過清道夫受體CD36 和A 類1 型清道夫受體（SR-AI）吞噬Ox-LDL 形成泡沫細(xì)胞，促進(jìn)AS 發(fā)生發(fā)展[9-10]。穩(wěn)定的泡沫細(xì)胞模型對AS 發(fā)生發(fā)展及藥物干預(yù)作用機(jī)制研究至關(guān)重要。人源THP-1 和鼠源RAW264.7 巨噬細(xì)胞是Ox-LDL 誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞常用的兩種巨噬細(xì)胞[11]，其中Ox-LDL 誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞模型常應(yīng)用于細(xì)胞脂質(zhì)代謝異常[12]、凋亡[13]等的研究。本研究結(jié)果顯示，Ox-LDL 處理的THP-1 源性巨噬細(xì)胞內(nèi)紅色脂質(zhì)明顯增多，表明泡沫細(xì)胞形成；予以桑抹茶提取物干預(yù)，能有效減少Ox-LDL 的攝取，降低THP-1 泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。提示桑抹茶可能具有預(yù)防AS 發(fā)生的作用。

膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)（reverse cholesterol transport，RCT）是血脂代謝的中心環(huán)節(jié)[14]，外周組織ABCA1 和三磷酸腺苷結(jié)合腺聯(lián)（ABCG1）介導(dǎo)細(xì)胞膽固醇外流[15]，是RCT 的起始步驟。血管中的ABCA1 可經(jīng)PPARα/γ-LXRα-ABCA1 正向調(diào)控表達(dá)[16]；在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白載脂蛋白（ApoE）、ABCA1 等作用下，膽固醇可從細(xì)胞內(nèi)流向細(xì)胞膜并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外[17]，能有效減少膽固醇在血管壁的堆積，阻斷AS 的發(fā)生發(fā)展[18]。PPARγ 通過降低清道夫受體（SR-A）的表達(dá)、增強(qiáng)CLA/SR-BI、ABCA1 等的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，負(fù)調(diào)控泡沫細(xì)胞形成[19-20]。已知Ox-LDL 能誘導(dǎo)THP-1 巨噬細(xì)胞分泌白介素（IL）-10、IL-1β 等炎癥因子，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[11]；AS 早期，PPARγ 表達(dá)上調(diào)能抑制血管壁單核/巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，阻斷AS的進(jìn)展[21]。課題組前期在桑抹茶抗高脂血癥作用研究中發(fā)現(xiàn)，給予桑抹茶干預(yù)，能促進(jìn)高脂血癥模型大鼠胸主動脈血管LXRα、PPARγ 表達(dá)水平，改善血管病變[7]。本研究結(jié)果也證實(shí)，桑抹茶提取物能增加THP-1 源性巨噬細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCA1 及PPARγ 的表達(dá)，減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。提示桑抹茶可能可以通過抑制血管壁巨噬細(xì)胞膽固醇沉積，促進(jìn)膽固醇從細(xì)胞壁流出，改善Ox-LDL 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，阻斷AS 的發(fā)生發(fā)展。