殷潔烽 徐統(tǒng)球 張 喆 孫元水

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，其發(fā)生與幽門螺桿菌感染和長(zhǎng)期攝入腌制食品有關(guān)[1]。早期胃癌的治療方法主要有內(nèi)鏡手術(shù)、腹腔鏡手術(shù)、開放手術(shù)和綜合治療。對(duì)于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌患者，日本JGCA 指南推薦實(shí)施根治性手術(shù)[2]。然而我國(guó)早期胃癌發(fā)現(xiàn)率低，常錯(cuò)過最佳手術(shù)時(shí)機(jī)，而僅能使用卡培他濱+順鉑/奧沙利鉑等藥物行姑息性治療[3]。化療藥物不僅價(jià)格昂貴，還可能導(dǎo)致惡心、嘔吐、食欲減退或骨髓增生抑制等不良反應(yīng)。腺病毒早期區(qū)4 第4編碼蛋白（adenovirus early region 4 open reading frame 4 protein，E4orf4 protein）是一種新型的細(xì)胞毒因子，不僅參與腺病毒的基因剪切和表達(dá)等過程，而且能特異性殺傷癌細(xì)胞[4]。Brestovitsky 等[5]以pcDNAE4orf4 的表達(dá)載體誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞后，死亡率達(dá)到80%～90%。為研究E4orf4 對(duì)正常細(xì)胞的影響，Robert 等[6]以E4orf4 處理人來源腫瘤細(xì)胞和原代細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)E4orf4 僅對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用，而對(duì)正常細(xì)胞作用影響很小。E4orf4 蛋白穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)是E4orf4 發(fā)揮殺傷作用的前提，但是部分E4orf4 無法穿透細(xì)胞膜。轉(zhuǎn)導(dǎo)肽能通過內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而且無細(xì)胞毒性[7]。本研究通過基因工程技術(shù)構(gòu)建pET28-his-TAT-E4orf4 原核表達(dá)載體，研究TATE4orf4 融合蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.2 試 劑 胰蛋白酶（批號(hào)90305）和RIMP 1640培養(yǎng)基（批號(hào)42401042）購(gòu)自Invitrogen 公司；胎牛血清（批號(hào)10091148）購(gòu)自復(fù)蒙公司。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）（批號(hào)sc-7272）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（Caspase-9）（批號(hào)sc-73548）、酪氨酸激酶Src（Sarcoma，Src）（批號(hào)sc-166860）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（Extracellular Regulated Protein Kinases，ERK）（批號(hào)sc-271269）、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（Phospho-Extracellular Regulated Protein Kinases，p-ERK）（批號(hào)sc-7383）、蛋白激酶B（Protein Kinase，BPKB 或AKT）（批號(hào)sc-5298）、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（cell division cycle 55p，CDC55p）（批號(hào)sc-1906）、酵母核苷二磷酸酶1（yeast nucleoside diphosphatase 1，YND 1）（批號(hào)sc-53506）和蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）（批號(hào)：sc-13601）鼠單克隆抗體購(gòu)置Santa Cruz 公司，β-actin 鼠單克隆抗體（批號(hào)A01010）和HRP 標(biāo)記的二抗（批號(hào)14-19-06）購(gòu)自北京中杉金橋。蛋白提取試劑盒（批號(hào)BB-3101）及ECL 發(fā)光試劑盒（批號(hào)P10100）購(gòu)自江蘇凱吉生物公司；BCA 試劑盒（批號(hào)P0011）、Annexin VFITC 和PI 試劑盒（批號(hào)C1067M）購(gòu)自碧云天公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌AGS 細(xì)胞株用含有10%的胎牛血清、1×104U/L 的青霉素和100mg/mL 的鏈霉素的RIMP 1640 培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的CO2孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度為90%，用0.25%的胰酶消化，進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 構(gòu)建融合細(xì)胞穿膜肽的E4orf4 原核表達(dá)載體及鑒定 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）重組法克隆E4orf4 表達(dá)基因，將TAT 編碼序列與之融合，構(gòu)建融合分子TAT-E4orf4，同樣以E4orf4 分子作對(duì)照。在兩分子兩端均加入6 個(gè)組氨酸（His）標(biāo)簽。利酶切鏈接法將融合分子克隆到原核表達(dá)載體pTAT-HA，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，菌落PCR 篩選，酶切電泳和DNA 測(cè)序驗(yàn)證。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到BL21-DE3 菌株，菌落PCR 鑒定，IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，改變培養(yǎng)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化表達(dá)條件，免疫印跡鑒定目的蛋白，篩選高表達(dá)蛋白菌株。先用His-tag 親和系統(tǒng)純化，再用離子交換層析進(jìn)一步純化復(fù)性。

2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 按2.1 進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待胃癌AGS 細(xì)胞90%融合后，胰酶消化、離心，取100μL 胃癌AGS 細(xì)胞以濃度為1×104細(xì)胞/mL 接種在96 孔板中培養(yǎng)24h，設(shè)置四組，每組設(shè)五個(gè)重復(fù)孔。前三組分別加入含相等濃度的pET28、pET28-his-E4orf4 和pET28-his-TAT-E4orf4 蛋白純化液，剩余一組加入等體積的RIMP 1640 培養(yǎng)基，設(shè)置為空白對(duì)照組。置于CO2孵箱孵育8h，每孔均加入20μL 的0.5%MTT 溶液，孵育4h 后終止培養(yǎng)，加入150μL 的 DMSO 后搖床上避光孵育15min。待結(jié)晶物溶解后，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD 值。細(xì)胞活性值=（實(shí)驗(yàn)組平均吸光值－調(diào)零孔平均吸光值）/（對(duì)照組平均吸光值－調(diào)零孔平均吸光值）。

2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 如上設(shè)置分組，將胃癌AGS 細(xì)胞消化后離心，細(xì)胞懸液密度稀釋到2×104個(gè)/mL。將Transwell 小室置于6 孔板中，AGS 細(xì)胞懸液接種于Transwell 上室，下室加入不含血清的RMIP 1640培養(yǎng)基，并加入等濃度的pET28、pET28-his-E4orf4和pET28-his-TAT-E4orf4，空白對(duì)照組加入等體積的不含血清的培養(yǎng)基。孵育24h，經(jīng)洗滌、固定、染色后，倒置顯微鏡下觀察胃癌AGS 細(xì)胞遷移的數(shù)量。隨機(jī)選取5 條直徑，在每一條直徑上選取5 個(gè)視野拍照，采用Picpic 軟件計(jì)數(shù)，比較穿過Transwell 小室的細(xì)胞平均數(shù)目。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 如上處理胃癌AGS 細(xì)胞后，收集各組細(xì)胞，經(jīng)PBS 洗滌后重懸，加入Annexin V-FITC 避光孵育。1000r/min 離心5min，棄上清，重懸細(xì)胞后，加入PI 染色液，混勻后于4℃避光孵育，再次洗滌后，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.6 Western blot 檢測(cè)Caspases、Src 和CDC55p 信號(hào)通路蛋白表達(dá) 如上處理四組胃癌細(xì)胞24h，先后以PBS 液洗滌、RIPA 裂解、離心后收集總蛋白，經(jīng)BCA 法定量、變性、SDS 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉和洗滌后，4℃過夜孵育一抗（1：1000），TBST 洗滌后，室溫孵育二抗2h（1：200）。最后TBST 洗滌，加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液（ECL，enhanced chemiluminescence）液，置于凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)目的蛋白表達(dá)變化。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，上述所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次以上。采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 pET28-TAT-E4orf4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá) 經(jīng)Xho I/Eco R 雙酶切原核表達(dá)載體后，經(jīng)瓊脂糖電泳上的預(yù)期范圍內(nèi)出現(xiàn)一條的片段（見圖1A）。通過對(duì)溫度、pH、IPTG 濃度進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)SDS-PAGE 電泳分析重組蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，1號(hào)、3 號(hào)、5 號(hào)和9 號(hào)菌株重組蛋白表達(dá)水平明顯高于其他菌株（見圖1B）。對(duì)上述菌株進(jìn)一步培養(yǎng)，收集菌液，用His-tag 親和系統(tǒng)純化，再用離子交換層析進(jìn)一步純化復(fù)性，收集重組融合蛋白進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

3.2 TAT-E4orf4 融合蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響 采用MTT 法檢測(cè)不同刺激后胃癌AGS 細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果顯示，相對(duì)于空白對(duì)照組（1.01±0.12），pET28 刺激后，胃癌AGS 細(xì)胞的增殖活性值為（1.03±0.26）；而pET28-his-E4orf4 刺激后胃癌細(xì)胞增殖活性降低至（0.69±0.44），與pET28 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。融合細(xì)胞穿膜肽后（pET28-his-E4orf4 刺激），細(xì)胞增殖活性進(jìn)一步下降，達(dá)到（0.41±0.06），與前兩組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 pET28-TAT-E4orf4 表達(dá)載體的鑒定及誘導(dǎo)

3.3 TAT-E4orf4 融合蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞遷移的影響 Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組的穿過Transwell 小室的細(xì)胞數(shù)目為（796.48±114.35）個(gè)，pET28 刺激后，穿過小室的細(xì)胞數(shù)目為（803.71±127.39）個(gè)，二者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)pET28-his-E4orf4 刺激后，AGS 細(xì)胞減少至（287.06±78.51）個(gè)，與前兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而pET28-his-TAT-E4orf4 刺激，穿過小室的細(xì)胞數(shù)目?jī)H為（163.21±36.77）個(gè)，與pET28-his-E4orf4 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 TAT-E4orf4 融合蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞遷移的影響（標(biāo)尺=200μm）

3.4 TAT-E4orf4 融合蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AGS 細(xì)胞凋亡率的變化趨勢(shì)與MTT 結(jié)果相一致?？瞻讓?duì)照組胃癌AGS 細(xì)胞的凋亡率為6.28%，pET28 刺激后胃癌AGS 細(xì)胞的凋亡率無明顯增加。而pET28-his-E4orf4 刺激后，胃癌AGS 細(xì)胞上升至20.50%。而pET28-his-E4orf4 刺激后，凋亡率進(jìn)一步增加，達(dá)到33.40%。見圖3。

3.5 TAT-E4orf4 融合蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞Caspase-3 和Caspase-9 表達(dá)的影響 采用Western blot 檢測(cè)Caspase-3 和Caspase-9 的表達(dá)變化。經(jīng)PET28、PET28-his-E4orf4 和PET28-his-TAT-E4orf4 刺激胃癌AGS 細(xì)胞后，Caspase-3 表達(dá)水平無明顯變化，與Blank 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與Caspase-3 變化趨勢(shì)相似，四組胃癌AGS 細(xì)胞的Caspase-9 的表達(dá)水平差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

圖3 TAT-E4orf4 融合蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響

圖4 TAT-E4orf4 融合蛋白對(duì)Caspase-3 和Caspase-9 表達(dá)的影響

3.6 CPP-E4orf4 對(duì)胃癌細(xì)胞Src 信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 PET28 刺激胃癌AGS 細(xì)胞后，Src 表達(dá)水平無明顯變化，而pET28-his-E4orf4 刺激后Src 表達(dá)水平明顯下降，與空白對(duì)照組和PET28 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而融合細(xì)胞穿膜肽后，胃癌AGS 細(xì)胞的Src 表達(dá)水平進(jìn)一步下降，與pET28-his-E4orf4 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Src 變化趨勢(shì)相反，pET28-his-E4orf4 和pET28-his-TATE4orf4 刺激胃癌AGS 細(xì)胞后ERK、p-ERK 和AKT表達(dá)水平均下降，而后者的下降趨勢(shì)更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

4 討論

胃癌細(xì)胞增殖和凋亡間的平衡紊亂是胃癌發(fā)生發(fā)展的重要分子機(jī)制[8]。胃癌細(xì)胞凋亡主要通過細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外兩大途徑，前者是由死亡信號(hào)誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C，與Caspase-9 形成凋亡復(fù)合體，使Caspase-9 酶原活化并釋放，進(jìn)而激活Caspase-3及其下游信號(hào)蛋白，而后者又包含F(xiàn)as/Fas 配體、Caspase 家庭蛋白以及Src 介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路等途徑[9-10]。

圖5 細(xì)胞穿膜肽對(duì)Src-ERK-AKT 信號(hào)軸的影響

研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織促凋亡蛋白Caspase-3 表達(dá)含量明顯低于癌旁組織[11]。有不少研究者試圖通過生物治療、放射治療、細(xì)胞毒類藥物和中醫(yī)中藥等多種方法來誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖。Kim 等[12]報(bào)道低劑量的順鉑可激活Fas 受體，使Caspase-3 表達(dá)增加，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。Nishimura 等[13]利用腺病毒構(gòu)建Caspase-8 表達(dá)載體，導(dǎo)入胃癌細(xì)胞株，其凋亡率顯著增加。亦有研究證實(shí)Src 介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路在抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展及影響細(xì)胞凋亡等生物學(xué)行為方面具有重要影響，靶向沉默Src 相關(guān)信號(hào)通路可調(diào)控胃癌細(xì)胞侵襲和遷移[14]。

近年發(fā)現(xiàn)部分溶瘤病毒編碼的某些特殊蛋白具有很好的抗腫瘤作用，如雞貧血病毒編碼的凋亡素、自主細(xì)小病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白1 和腺病毒編碼的E4orf4。其中，以E4orf4 研究最為深入。E4orf4 是由人腺病毒基因早期第4 轉(zhuǎn)錄區(qū)第4 開放讀碼框編碼產(chǎn)生，含114 個(gè)氨基酸殘基。E4orf4 蛋白與PP2A 或Src等分子伴侶作用，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[15]。E4orf4 與PP2A的B55 亞基的結(jié)合，能激活mTOR 信號(hào)通路，調(diào)控蛋白翻譯。此外，Src 家族激酶可使E4orf4 發(fā)生磷酸化，繼而在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上聚集，導(dǎo)致雙核肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白網(wǎng)絡(luò)的組裝重塑，細(xì)胞膜起泡，最終引起細(xì)胞死亡[15]。Zhou 等[16]構(gòu)建EGF-E4orf4 表達(dá)載體，刺激胃癌BCG-823 細(xì)胞株后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BCG-823 細(xì)胞的增殖能力顯著下降，對(duì)轉(zhuǎn)移瘤小鼠的抑制率達(dá)到49%。另有文獻(xiàn)報(bào)道，E4orf4 蛋白與分子伴侶Src相互作用可抑制Src-ERK-AKT 信號(hào)通路的激活，降低下游促凋亡蛋白（the proapoptotic BH3-onlyprotein，BAD）的磷酸化，增強(qiáng)BAD 與早期凋亡蛋白（Bcl-2 和Bcl-xl）相互作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。

上述研究證實(shí)，E4orf4 對(duì)胃癌細(xì)胞具有很好的殺傷作用，而E4orf4 穿過細(xì)胞膜是其發(fā)揮作用的前提。目前常用其他試劑來增強(qiáng)細(xì)胞通透性，破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。TAT 轉(zhuǎn)導(dǎo)肽是來源于HIV 轉(zhuǎn)錄活化蛋白tat 的11 肽，通過內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。將TAT 與目的蛋白制成的融合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)效率幾乎可達(dá)到100%，而且無明顯細(xì)胞毒性。基于上述研究現(xiàn)狀，本研究將細(xì)胞穿膜肽與E4orf4 融合，構(gòu)建pET28-his-TAT-E4orf4原核表達(dá)載體，分析TAT-E4orf4 融合蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，增加細(xì)胞穿膜肽后E4orf4 能顯著抑制胃癌AGS 細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)AGS 細(xì)胞凋亡。Western blot 結(jié)果發(fā)現(xiàn)E4orf4 對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷作用及對(duì)凋亡的影響與Caspase 信號(hào)通路無關(guān)，但E4orf4 能活化Src-ERKAKT 信號(hào)通路，介導(dǎo)AGS 細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤的效應(yīng)。