焦亞冰，王容，時(shí)培建*

（南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037）

化石證據(jù)表明，早在4 億多年前孢子體和配子體中出現(xiàn)了氣孔。相較于莖和其他植物器官而言，氣孔在葉片上的分布最為密集。氣孔是由一對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞及其圍成的孔隙所構(gòu)成的，絕大多數(shù)陸生植物（苔蘚植物到被子植物）的孢子體組織中都有氣孔。氣孔是陸地植物水分蒸騰和光合CO交換的主要通道，控制著葉片內(nèi)部和大氣之間的氣體交換。植物通過(guò)控制氣孔密度和氣孔孔徑大小來(lái)調(diào)節(jié)氣體交換，以響應(yīng)不同外界環(huán)境的刺激。長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直認(rèn)為層級(jí)的葉脈和不透水的角質(zhì)層是影響植物在陸地成功定植的關(guān)鍵因素，而氣孔則往往被認(rèn)為是不重要的影響因素。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，氣孔功能的進(jìn)化是植物登陸、大型植物進(jìn)化的關(guān)鍵性創(chuàng)新?？烧{(diào)節(jié)的氣孔與內(nèi)部水分運(yùn)輸系統(tǒng)的結(jié)合是植物進(jìn)化的一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，使維管植物能夠順利入侵大多數(shù)的陸地環(huán)境。由此可見(jiàn)，氣孔在植物進(jìn)化過(guò)程中扮演著重要的角色。

空間點(diǎn)格局表示在給定空間范圍內(nèi)非重疊的點(diǎn)或事件（在平面上可近似認(rèn)為是點(diǎn)）的空間排布和空間關(guān)系。例如，森林中樹(shù)木的位置，星空中星星的位置，地震震中和疾病病例的發(fā)生地點(diǎn)。在空間點(diǎn)格局的分布中，通常劃分為3 種分布類(lèi)型：隨機(jī)分布、均勻分布和集群分布。目前，大多數(shù)空間點(diǎn)格局分析方法都集中在非重復(fù)點(diǎn)過(guò)程上，只有少數(shù)研究應(yīng)用重復(fù)空間點(diǎn)格局分析方法。在宏觀領(lǐng)域?qū)用?，由于研究尺度較大、空間異質(zhì)性很大、調(diào)查或者取樣成本也較高，鮮有多個(gè)同質(zhì)性重復(fù)的點(diǎn)格局；而本文在微觀領(lǐng)域?qū)用嫔鲜褂命c(diǎn)格局分析法，因其研究尺度較小，空間異質(zhì)性可以得到有效的回避，可以使分析結(jié)果具有更高的穩(wěn)健性。

深山含笑（Michelia maudiae）為木蘭科含笑屬植物，常綠喬木，是中國(guó)特有物種。木蘭科植物起源悠久，在中國(guó)境內(nèi)分布廣泛，是被子植物進(jìn)化線上幸存的起點(diǎn)，至今仍保留著許多古老的特征。其中含笑屬植物全世界約有50 余種，中國(guó)就有40 種。深山含笑生長(zhǎng)快、適應(yīng)性強(qiáng)；花開(kāi)素白、清香淡雅，樹(shù)形美觀，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和園林觀賞價(jià)值。深山含笑具有典型的分層網(wǎng)狀葉脈模式，網(wǎng)狀葉脈可能使得氣孔分布更為均勻，但鮮有研究，因此選擇深山含笑作為研究對(duì)象。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2020 年9 月4 日，在南京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)（118°80′E，32°08′N(xiāo)）選取一株進(jìn)入成熟期的深山含笑，沿著樹(shù)冠中層外圍東、南、西、北四個(gè)方向共采集60 片葉片，不區(qū)分新老葉。挑選植株上具有代表性的、新鮮完整的、健康無(wú)蟲(chóng)害的葉片裝入自封袋帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 氣孔切片取樣與氣孔中心坐標(biāo)提取

首先，采用離析法對(duì)葉片進(jìn)行處理，經(jīng)過(guò)固定—解離—染色—制片—鏡檢—拍照的過(guò)程獲取氣孔空間分布圖。氣孔切片取樣如圖1 所示，避開(kāi)主脈和二級(jí)脈。其次，使用PhotoshopCS6（Adobe 系統(tǒng)公司）將從生物顯微鏡（Leica DM2500，徠卡顯微系統(tǒng)上海有限公司，中國(guó)上海）拍攝的圖片進(jìn)行灰度圖轉(zhuǎn)換保存為JPG 格式，再使用版本4.0.4 的R軟件手工逐點(diǎn)確認(rèn)每個(gè)氣孔的中心位置，以獲得氣孔中心的平面坐標(biāo)。葉片氣孔切片位置的氣孔中心坐標(biāo)提取示意如圖2 所示。

圖1 深山含笑的3 個(gè)切片位置的示意

圖2 3 個(gè)位置對(duì)應(yīng)的氣孔中心坐標(biāo)提取的示意

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 k 函數(shù)與重復(fù)性空間點(diǎn)格局分析方法

K 函數(shù)是穩(wěn)定的各向同性點(diǎn)過(guò)程二階屬性的特征化表示，它在距離s 處的定義為：

λ·K（s）=E[N（s）]

其中，λ 是在完全空間隨機(jī)化假設(shè)下的強(qiáng)度，實(shí)際上等于單位面積上點(diǎn)（稱為事件）的平均數(shù)量；N（s）表示到研究區(qū)域內(nèi)任意一點(diǎn)距離≤s 的點(diǎn)的數(shù)量；E（·）表示期望；s 表示距離。

對(duì)于完全空間隨機(jī)化的點(diǎn)過(guò)程，K（s）=πs。理論上，當(dāng)K（s）＞πs時(shí)，事件傾向于聚集分布，即在距離s 事件之間相互吸引；當(dāng)K(s)＜πs時(shí)，事件傾向于均勻分布，即在距離s 事件之間相互排斥；當(dāng)K（s）=πs時(shí)，事件傾向于隨機(jī)分布，即在該尺度下，事件之間不存在空間相互作用。

假設(shè)這里有g(shù) 個(gè)處理組（葉片上不同位置的切片），使用i 表示第i 個(gè)組（i=1，2，3，…，g）。設(shè)想第i個(gè)組有r個(gè)重復(fù)（葉片的數(shù)量），使用j 表示第j個(gè)重復(fù)。n表示第i 組的第j 個(gè)重復(fù)對(duì)應(yīng)的點(diǎn)的數(shù)量，則

第i 個(gè)組總的點(diǎn)數(shù)量為：

引入D 統(tǒng)計(jì)量來(lái)檢驗(yàn)組間K 函數(shù)是否存在顯著性差異：

（3）計(jì)算組內(nèi)均值、組間均值和基于重排的殘差K 函數(shù)的D 統(tǒng)計(jì)量，記為D。

（4）重復(fù)步驟（2）和步驟（3）m-1 次，得到m-1個(gè)Dk*（k =1，2，3，…，m-1）統(tǒng)計(jì)量。將上述模擬得到的m–1 個(gè)統(tǒng)計(jì)量按照從大到小的順序排列得到統(tǒng)計(jì)量向量D*，p 值等于實(shí)際的D 值在D統(tǒng)計(jì)量向量在排列中的位置與m 的商。在本研究中，m 設(shè)為1 000。假設(shè)D 排在第q 位，則P=q/m。

為了穩(wěn)定化方差，一般使用交互類(lèi)型的L 函數(shù)代替K 函數(shù)，實(shí)際上我們?cè)谥貜?fù)性空間點(diǎn)格局分析中使用了L(s)-s 函數(shù)：

1.3.2 氣孔密度和平均最近鄰距離

氣孔密度是植物對(duì)環(huán)境適應(yīng)的指標(biāo)。氣孔密度=氣孔數(shù)量/研究區(qū)域面積，即單位面積上的氣孔數(shù)量。

對(duì)于區(qū)域A 中的n 個(gè)事件，令y為從第i 個(gè)事件到區(qū)域A 中其最近事件的距離。y被稱為最近鄰距離。n 個(gè)最近鄰距離包含對(duì)最近鄰事件對(duì)之間的重復(fù)測(cè)量。換句話說(shuō)，就是每個(gè)氣孔中心到與其最近鄰氣孔的中心之間的距離，然后計(jì)算所有這些最近鄰距離的平均值，即為平均最近鄰距離。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用線性混合模型和Pearson 積矩相關(guān)系數(shù)進(jìn)行分析與檢驗(yàn)，再使用版本4.0.4 的R 軟件對(duì)混合線性模型進(jìn)行擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 深山含笑表皮氣孔分布

圖3 展示了深山含笑上下表皮的顯微形態(tài)：上表皮無(wú)氣孔分布，僅有下表皮有氣孔分布。

圖3 深山含笑上下表皮形態(tài)（左為上表皮，右為下表皮）

2.2 氣孔空間分布特征

小尺度（＜75 μm）下，氣孔之間存在空間排斥，呈現(xiàn)均勻分布；在大尺度（≥75 μm）下，氣孔之間不存在空間相互作用，呈現(xiàn)隨機(jī)分布。深山含笑葉片最寬處的3 個(gè)位置之間的K 函數(shù)存在顯著差異（P =0.001），然而2 號(hào)位置和3 號(hào)位置之間的K 函數(shù)不存在顯著差異（P=0.052）。從葉緣到中脈的3 個(gè)位置，區(qū)分氣孔之間排斥關(guān)系和獨(dú)立關(guān)系的臨界值是不同的（圖4）。

圖4 3 個(gè)位置估計(jì)的組內(nèi)平均L(s)-s 函數(shù)

2.3 氣孔密度與平均最近鄰距離

1 號(hào)位置（靠近葉緣）和3 號(hào)位置（靠近中脈）的氣孔密度之間存在顯著差異，且3 號(hào)位置氣孔密度高于1 號(hào)位置，氣孔密度從葉緣到中脈逐漸增大（圖5A）。3 個(gè)位置的平均最近鄰距離之間存不在顯著差異（圖5B）。氣孔密度和平均最近鄰距離之間在對(duì)數(shù)- 對(duì)數(shù)軸上具有顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（圖5C）。

圖5 A:氣孔密度的箱線B:每個(gè)切片中氣孔之間的平均最近鄰距離C:氣孔密度和平均最近鄰距離在對(duì)數(shù)-對(duì)數(shù)軸上的線性擬合結(jié)果

3 結(jié)論與討論

3.1 氣孔下生的意義

植物氣孔的分布模式有三類(lèi)：氣孔上生（僅上表皮分布）、氣孔下生（僅下表皮分布）和氣孔兩生（上下表皮均有分布）。影響氣孔分布的因素有很多，其中有代表性的影響因素有葉片厚度、光照、生境和葉片著生角度等。自然界中的大多數(shù)物種（尤其是木本植物）都多屬于氣孔下生。本文的研究對(duì)象深山含笑是氣孔下生。

氣孔兩生的分布模式具有明顯的氣體交換優(yōu)勢(shì)，與氣孔上生或下生的葉片相比較，氣孔兩生的生產(chǎn)力更高。雖然氣孔兩生的分布模式于植物而言是益處良多，但是往往只有少數(shù)物種可以利用葉片兩側(cè)進(jìn)行氣體交換，這也意味著氣孔兩生的分布模式可能需要付出一些代價(jià)。其中一個(gè)代價(jià)就是病原體更容易通過(guò)上表皮的氣孔進(jìn)入。氣孔是葉片角質(zhì)層中的自然開(kāi)口，真菌、細(xì)菌或病毒可能會(huì)通過(guò)氣孔進(jìn)入葉片，不同物種對(duì)病原體的易感性可能會(huì)因氣孔分布而有所差異。此外，也有研究表明，氣孔兩生的分布模式會(huì)降低植物的水分利用效率，并且對(duì)于光合速率低的物種可能無(wú)益。

Parkhurst和Jones的模型都預(yù)測(cè)，當(dāng)邊界層阻力較高時(shí)，氣孔下生比氣孔兩生的分布模式更有利。自然界中的大多數(shù)植物都屬于氣孔下生，這種分布模式可能有助于防止葉片的水分散失。大多數(shù)草本植物屬于氣孔兩生，但許多木本植物則是氣孔下生。Peat 和Fitter的研究表明，木本植物氣孔下生的分布模式是植物的一種適應(yīng)性性狀，可能是因?yàn)槟颈局参锏臉?shù)冠通常比草本植物的樹(shù)冠更發(fā)達(dá)，植物樹(shù)冠保護(hù)的葉片邊界層可能比沒(méi)有保護(hù)的樹(shù)葉更大。在自然進(jìn)化中植物葉片上的氣孔選擇下生，一種可能的原因是，葉片上表面的氣孔似乎比下表皮的氣孔更容易被灰塵、雨水等堵塞。例如木蘭科植物北美木蘭屬荷花玉蘭（Magnolia grandiflora）的葉片下表面密被絨毛，可以有效阻擋灰塵、病原菌進(jìn)入氣孔。另一種可能的原因是，陽(yáng)光照射下的葉表面比面朝下的葉表面溫度更高。Buckley 等人通過(guò)對(duì)葉片能量平衡（0.2～0.3 ℃）的詳細(xì)建模，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)光照射（不透光）和陰面蒸發(fā)的葉片表面溫度存在顯著差異。氣孔下生的葉形態(tài)使最具光合活性的組織（柵欄葉肉）與外部環(huán)境的蒸發(fā)需求的形成了相對(duì)的隔離。因此，氣孔下生的分布模式適應(yīng)于大多數(shù)植物的原因可能與其對(duì)自然環(huán)境適應(yīng)和其功能的進(jìn)化有很大關(guān)系。

3.2 靠近中脈的氣孔密度和靠近葉緣的存在顯著差異的原因

通過(guò)對(duì)深山含笑葉片最寬處的3 個(gè)位置（葉緣、葉中、中脈）取樣，可以更好地了解生長(zhǎng)在南京地區(qū)的深山含笑的氣孔分布差異。這種取樣策略使我們能夠?qū)φ~上層級(jí)網(wǎng)狀脈模式下的氣孔空間分布有一個(gè)整體上的認(rèn)知，前人的研究中取樣多是在葉中，忽略了中脈附近和葉緣的氣孔分布。

深山含笑的氣孔密度從葉緣到中脈是逐漸變大，由此可以猜測(cè)這與光照強(qiáng)度有關(guān)。1928 年Salisbury在探討氣孔密度的成因及其生態(tài)學(xué)意義曾提出，氣孔數(shù)量隨著植物的“暴露”程度而增加。Kelly 和Beerling的研究表明，邊緣草本植物（光照多）通常比陰生草本植物（光照少）有更多的氣孔，并認(rèn)為生活型越高或暴露越多的植物就越容易受到干燥條件的影響，往往其氣孔密度也就越高。Gay和Hurd研究測(cè)定了生長(zhǎng)室內(nèi)高光和低光條件下生長(zhǎng)的番茄植株的氣孔密度：在低光下，上表皮氣孔數(shù)不到1 個(gè)/mm，而在高光下，氣孔數(shù)為30 個(gè)/mm；在下表皮，低光下氣孔數(shù)約為80 個(gè)/mm，高光下氣孔數(shù)約為100 個(gè)/mm。結(jié)果表明光照強(qiáng)度與氣孔密度呈正相關(guān)關(guān)系。楊傳友等人對(duì)金帥蘋(píng)果的葉片進(jìn)行多位置取樣，其中中脈附近的氣孔密度顯著大于葉緣附近的，這與本文結(jié)果是一致的。自然界中，多數(shù)植物為了防止中午過(guò)多的熱負(fù)荷和蒸騰，往往會(huì)選擇將葉片進(jìn)行一定程度的卷曲或特殊的葉角（如桉樹(shù)葉片垂直于地面）等方式，提高葉片的水分利用效率和增加碳收益。深山含笑的葉片在應(yīng)對(duì)高溫時(shí)，其葉片呈現(xiàn)出一定程度的內(nèi)合（沿著中脈），而其中脈附近的葉片往往受到更多的強(qiáng)光照射。因此，深山含笑葉片靠近中脈的氣孔密度會(huì)顯著高于靠近葉緣的。

深山含笑的氣孔下生和氣孔密度的差異，反映了植物對(duì)自然環(huán)境變化的適應(yīng)。氣孔密度與葉脈密度之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系，兩者協(xié)調(diào)發(fā)展共同應(yīng)對(duì)自然環(huán)境的壓力。葉脈主要分為主脈和次脈（側(cè)脈、細(xì)脈以及游離端細(xì)脈）。次脈占葉片脈絡(luò)總長(zhǎng)度的80%以上，是葉片水力傳導(dǎo)力和光合速率的關(guān)鍵決定因素。游離端細(xì)脈是次脈的重要組成部分，在葉片內(nèi)部，游離端細(xì)脈的數(shù)量隨著網(wǎng)眼大小的增加而增加，網(wǎng)眼輪廓長(zhǎng)度和氣孔數(shù)量具有顯著的正相關(guān)關(guān)系。因此，細(xì)脈的分布對(duì)氣孔的大小和密度起到一定的限制作用，從而使氣孔在網(wǎng)眼內(nèi)更加均勻分布來(lái)實(shí)現(xiàn)資源最優(yōu)化。在日后進(jìn)行氣孔相關(guān)研究時(shí)，不可只取葉片中部的材料作為代表，應(yīng)該多方位考慮取樣（如靠近主脈和靠近葉緣的位置）。

3.3 結(jié)論

深山含笑氣孔為下生型；氣孔與氣孔之間在75 μm 以下存在空間抑制，在75 μm 及以上則不存在空間相互作用；在葉片最寬處從葉緣到中脈氣孔密度顯著增加，而平均最近鄰距離顯著降低；基于重復(fù)性空間點(diǎn)格局分析，靠近中脈的和靠近葉緣的切片氣孔空間分布特征顯著不同于靠近中脈的切片氣孔空間分布特征。