武強(qiáng)強(qiáng)，張鳳潔，董浩歡，盧 平，樊 婕，李雪垠，王愛萍，董 琦*

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) a. 農(nóng)學(xué)院，太谷 030801；b. 生命科學(xué)學(xué)院，太谷 030801）

小麥?zhǔn)且环N在我國(guó)被廣泛種植的谷類作物，其代表種普通小麥（Triticum aestivumL.）是禾本科植物。小麥的常見種在中國(guó)還包括提莫非維小麥、一粒小麥、圓錐小麥。小麥?zhǔn)钱愒戳扼w植物（2n=6x=42），有A、B、D 3個(gè)基因組，它的基因組龐大（高達(dá)17 Gb）且含有大量重復(fù)序列。目前小麥的全基因組測(cè)序已經(jīng)完成［1-3］。小麥的種植面積約占世界總耕作面積的17%，提供了全世界約20%的糧食消耗［4］。小麥面粉富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、礦物質(zhì)和維生素A等人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［5］。小麥作為世界上糧食消費(fèi)最大的產(chǎn)品之一，對(duì)保證全世界人類和動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)健康有十分重要的作用。因此，對(duì)小麥的基礎(chǔ)研究一直是植物科學(xué)家們關(guān)注的重點(diǎn)。

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）也稱為反式作用因子，是指能夠與真核基因啟動(dòng)子區(qū)域中的順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合，并對(duì)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄有調(diào)控作用的一種DNA結(jié)合蛋白［6］。轉(zhuǎn)錄因子具有特定DNA序列的結(jié)合活性，能保證靶基因在特定時(shí)間和空間以特定強(qiáng)度表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子作為植物中重要的調(diào)控蛋白質(zhì)，可以調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，幾乎參與到植物所有的生長(zhǎng)發(fā)育過程［7］。

2004年，Haecher等［8］在對(duì)擬南芥基因組進(jìn)行全面研究分析后，發(fā)現(xiàn)了15個(gè)與WUS（WUSCHEL）結(jié)構(gòu)相似的編碼蛋白質(zhì)的基因，并將它們命名為WOX基因。WUSCHEL-related homeobox（WOX）轉(zhuǎn)錄因子家族是植物特有的一類基因轉(zhuǎn)錄因子。WOX基因家族的功能涉及植物胚胎發(fā)育、干細(xì)胞維持和器官形成等關(guān)鍵過程，這些功能的發(fā)揮與它們可以促進(jìn)細(xì)胞分裂或阻止未成熟細(xì)胞的提前分化密不可分［9-10］。小麥WOX轉(zhuǎn)錄因子都包含一個(gè)非常保守的由65個(gè)氨基酸殘基組成的DNA結(jié)合同源異型結(jié)構(gòu)域（homeodomain，HD），此結(jié)構(gòu)域在WOX轉(zhuǎn)錄因子的功能中起著關(guān)鍵作用［11］。隨著大量植物基因組測(cè)序的相繼完成，擬南芥、楊樹、水稻、高粱、玉米和茄子中的WOX基因已全部鑒定完成［12-14］，但小麥中WOX基因全基因組的鑒定與分析還不全面。鑒定和分析WOX轉(zhuǎn)錄因子基因家族是進(jìn)一步研究WOX基因功能的重要基礎(chǔ)。

本研究運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)手段對(duì)普通小麥的WOX基因進(jìn)行了全基因組鑒定、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建、序列分析，為進(jìn)一步探討WOX基因調(diào)控小麥生長(zhǎng)發(fā)育的分子作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 小麥WOX基因鑒定及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

從PlantTFDB V4.0數(shù)據(jù)庫(kù)（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）下載小麥全部WOX基因家族成員［15］。利用Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)（V12，https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）檢索小麥WOX基因的序列信息。利用在線工具ExPASy-Compute pI/Mw（https://web.expasy.org/compute_pi/，https://web.expasy.org/protparam）對(duì)小麥WOX基因編碼的蛋白質(zhì)序列的等電點(diǎn)和分子量進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析［16］。

1.2 小麥WOX基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及基因結(jié)構(gòu)分析

利用Clustal X2軟件對(duì)小麥WOX基因家族成員的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多重序列比對(duì)［17］。利用MEGA 5.0軟件和鄰接法（neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（bootstrap replications設(shè)置為1 000）［18］。利用GSDS 2.0 在線分析軟件（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析小麥WOX基因的結(jié)構(gòu)［19］。

1.3 小麥WOX基因的蛋白質(zhì)基序檢索和順式作用元件分析

從Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)下載所有小麥WOX基因家族成員的蛋白質(zhì)序列，以小麥WOX基因上游1.5 kb序列作為啟動(dòng)子序列。利用序列保守基序識(shí)別工具M(jìn)EME（Multiple Em for Motif Elicitation，Version 5.0.3，http://meme-suite.org/tools/meme）鑒定小麥WOX基 因 的 蛋 白 質(zhì) 基 序［20］。以 PlantCARE 在線分析軟件（Plant Cis-Acting Regulatory Elements，http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）鑒定小麥WOX基因上游1.5 kb啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的順式作用元件［21］。

1.4 小麥WOX基因組織特異性與環(huán)境誘導(dǎo)表達(dá)分析

將小麥WOX基因序列提交到WheatExp數(shù)據(jù)庫(kù)（https://wheat.pw.usda.gov/WheatExp/），下載小麥WOX基因在不同組織和不同逆境條件下的基因表達(dá)量數(shù)據(jù)［22］。利用TBtools工具中HeatMap繪制基因表達(dá)熱圖［23］。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥WOX基因鑒定及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

基于PlantTFDB V4.0數(shù)據(jù)庫(kù)，小麥基因組共有20個(gè)WOX轉(zhuǎn)錄因子家族基因。根據(jù)它們?cè)谛←溔旧w上的定位情況，把它們分別依次命名為TaWOX1～TaWOX20。利用 ExPASy軟件（http://expasy.org）對(duì)所有預(yù)測(cè)的小麥WOX家族成員氨基酸序列進(jìn)行分子量和等電點(diǎn)的分析，這20個(gè)WOX基因的基本信息如表1所示。它們分布在1A～5A、1B、2B、4B、1D～5D染色體上，長(zhǎng)度在199～3 694 bp，Ta-WOX20的編碼序列（coding sequence，CDS）最長(zhǎng)，其蛋白質(zhì)有322個(gè)氨基酸殘基，TaWOX9的CDS序列最短，其蛋白質(zhì)有66個(gè)氨基酸殘基。

表1 小麥WOX基因基本信息及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)Tab. 1 Basic information of WOX genes and physicochemical properties of proteins in wheat

2.2 小麥WOX轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和基因結(jié)構(gòu)

小麥WOX轉(zhuǎn)錄因子家族成員系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。小麥WOX蛋白質(zhì)在系統(tǒng)發(fā)育樹中都是成對(duì)出現(xiàn)的，如TaWOX4/TaWOX3等。小麥的20個(gè)WOX蛋白質(zhì)可以劃分為3個(gè)亞族，不同亞族的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同一亞族的親緣關(guān)系較近，由此推測(cè)小麥WOX轉(zhuǎn)錄因子基因家族在其漫長(zhǎng)的演化過程中可能發(fā)生了一些適應(yīng)性變異?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示，所有的基因都含有外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，有些基因呈現(xiàn)出斷裂基因的特征，如TaWOX5、TaWOX6、TaWOX8均含有3個(gè)外顯子，所有的基因中以Ta-WOX9最為特殊，其結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單，僅含有1個(gè)外顯子。

2.3 小麥WOX轉(zhuǎn)錄因子家族保守基序分析

蛋白質(zhì)保守基序分析顯示，小麥20個(gè)WOX蛋白質(zhì)中共有10個(gè)保守基序，分別將其命名為 Motif 1～Motif 10（圖2）。TaWOX9僅含有Motif 1 1個(gè)基序，而TaWOX2序列不包含任一基序。其中Motif 1存在于除TaWOX2、TaWOX15的剩余18個(gè)WOX基因中，Motif 2存在于除TaWOX9、TaWOX2的剩余18個(gè)WOX基因中，說明Motif 1、Motif 2在所有的WOX基因的蛋白質(zhì)基序中最為保守，Motif 1、Mo-tif 2是小麥WOX轉(zhuǎn)錄因子的核心基序。Motif 5存在于小麥13個(gè)WOX蛋白質(zhì)序列中，Motif 9存在于小麥的11個(gè)WOX蛋白質(zhì)序列中，這說明Motif 5和Motif 9也是相對(duì)較為保守的基序。蛋白質(zhì)基序Motif 1、2、5、9的保守性很可能與小麥WOX基因功能密切相關(guān)。TaWOX10、TaWOX12、TaWOX11、Ta-WOX13的蛋白質(zhì)基序較類似，這與圖1中它們的親緣關(guān)系較近的結(jié)論相一致。

圖1 小麥WOX轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和基因結(jié)構(gòu)Fig. 1 Evolutionary relationship and gene structure WOX transcription factors in wheat

圖2 小麥WOX轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)基序Fig. 2 Protein motifs of wheat WOX transcription factors

2.4 小麥WOX基因順式作用調(diào)控元件分析

WOX 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、器官形成和干細(xì)胞維持等具有重要調(diào)控作用。為了探究小麥的WOX 轉(zhuǎn)錄因子與植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系，我們分析了小麥WOX基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的順式作用調(diào)控元件。結(jié)果顯示，小麥16個(gè)WOX基因啟動(dòng)子中的順式作用調(diào)控元件主要包括：脫落酸響應(yīng)順式作用元件（abscisic acid responsiveness cis-acting element，ABRE）、茉莉酸甲酯響應(yīng)順式作用元件（MeJA-responsiveness cis-acting element，CGTCA-motif）、種子特異調(diào)控響應(yīng)順式作用元件（seed specific regulation cis-acting element，RY-element）、分生組織相關(guān)響應(yīng)順式作用元件（meristem expression cis-acting element，CAT-box）等（表2）。RY-element主要參與種子的發(fā)育過程，CAT-box則主要參與分生組織的形成過程（表3）。TaWOX1、TaWOX3、TaWOX4、TaWOX5基因上游1.5 kb區(qū)域內(nèi)都包含了RY-element和CAT-box 2種順式作用元件，說明這幾個(gè)基因作為小麥WOX轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，與小麥分生組織的形成相關(guān)，也很可能與小麥種子或胚乳的發(fā)育密切相關(guān)。而TaWOX15、TaWOX16基因上游1.5 kb區(qū)域內(nèi)都包含了GT1-motif和Sp1 2種順式作用元件，說明這2個(gè)基因與小麥的光合作用相關(guān)。

2.5 小麥WOX基因在不同組織以及不同環(huán)境誘導(dǎo)條件下的表達(dá)分析

為了探索小麥WOX基因的功能，我們對(duì)小麥WOX基因在小麥各個(gè)組織部位以及不同環(huán)境條件下的表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示：TaWOX1、TaWOX2、TaWOX3、TaWOX4、TaWOX6、TaWOX8、TaWOX10、TaWOX12、TaWOX19在小麥穗部的表達(dá)量較高，推測(cè)這9個(gè)WOX基因可能參與小麥穗部的發(fā)育過程；TaWOX5、TaWOX6、TaWOX8、TaWOX10、TaWOX13在小麥莖中的表達(dá)量較高，而在其他小麥組織中的含量相對(duì)較低，說明這5個(gè)基因參與小麥莖稈的生長(zhǎng)發(fā)育過程；TaWOX15、TaWOX18、Ta-WOX20在小麥胚乳中的表達(dá)量異常高，而在其他組織的表達(dá)量幾乎為零，因此這3個(gè)基因與小麥胚乳的發(fā)育密切相關(guān)；TaWOX2、TaWOX14在小麥籽粒的表達(dá)量較高，其中TaWOX14在其余組織中表達(dá)量低，說明TaWOX2、TaWOX14這2個(gè)基因與小麥籽粒的形成關(guān)系密切。但是在干旱脅迫處理下，20個(gè)小麥WOX基因表達(dá)量均不顯著，幾乎為零，說明小麥WOX基因與干旱脅迫下小麥發(fā)育不相關(guān)。圖3所示為小麥在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的情況以及WOX基因在不同環(huán)境誘導(dǎo)下的基因表達(dá)模式。

表2 小麥WOX基因啟動(dòng)子順式作用調(diào)控元件Tab. 2 WOX promoter cis-acting regulatory elements in wheat

表3 小麥WOX基因啟動(dòng)子順式作用調(diào)控元件核心序列及功能Tab. 3 Core sequence and functions of WOX promoter cis-acting regulatory elements in wheat

3 討論

小麥?zhǔn)鞘澜缟现饕募Z食作物之一，小麥生產(chǎn)對(duì)保證我國(guó)糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和戰(zhàn)略意義［24］。改良小麥的品質(zhì)，提高小麥的單產(chǎn)量已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。全基因組分析目前已成為研究某些物種基因家族最基礎(chǔ)的工具，而轉(zhuǎn)錄因子因其種類繁多和復(fù)雜的作用機(jī)制，一直是植物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一［25］。前人研究結(jié)果表明，植物特有的WOX轉(zhuǎn)錄因子家族具有多種生物學(xué)功能，其家族成員在植物的地上部分、地下部分的發(fā)育過程中都發(fā)揮著十分重要的作用［1］。

本研究結(jié)果顯示，小麥共有26個(gè)WOX基因，被Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)收錄且有序列信息的有20個(gè)，20個(gè)家族成員幾乎都含有65個(gè)氨基酸殘基組成的保守的同源異型結(jié)構(gòu)域，同源異型結(jié)構(gòu)域可以識(shí)別特異序列的靶基因并發(fā)揮調(diào)控作用［1］。小麥的20個(gè)WOX基因可分為3個(gè)亞族，不同亞族內(nèi)的WOX基因彼此之間的親緣關(guān)系較近，并且每個(gè)亞族內(nèi)的各個(gè)成員之間，在基因結(jié)構(gòu)或蛋白質(zhì)基序上都具有較強(qiáng)的相似性。本研究中的順式作用調(diào)控元件分析的結(jié)果顯示，在TaWOX3、TaWOX4、Ta-WOX5、TaWOX6基因的啟動(dòng)子中，均包含CAT-box和RY-element這2種順式作用元件，據(jù)此推測(cè)，這幾個(gè)小麥WOX基因作為WOX轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，與小麥分生組織的形成有關(guān)，也可能與小麥種子或胚乳的發(fā)育有重要的聯(lián)系，其具體功能有待后續(xù)進(jìn)一步研究驗(yàn)證。關(guān)于小麥WOX基因在植物各部位的表達(dá)數(shù)據(jù)，其中TaWOX8、TaWOX5、TaWOX6、Ta-WOX10在穗部和莖稈表達(dá)量較高，可能調(diào)控了小麥穗部和莖稈的發(fā)育過程；TaWOX18、TaWOX20、TaWOX15在小麥胚乳中的表達(dá)量異常高，而在別的部位的表達(dá)量幾乎為零，暗示這3個(gè)基因可能與小麥胚乳的形成發(fā)育密切相關(guān)。小麥產(chǎn)量取決于穗數(shù)、穗粒數(shù)和粒重3種因素，穗的發(fā)育與穗粒數(shù)密切相關(guān)。不同類型分生組織的時(shí)空調(diào)控對(duì)花序的發(fā)育和結(jié)構(gòu)特征非常重要，如小穗分生組織的延遲分化作用會(huì)引起分枝的重復(fù)發(fā)生，可以形成大型穗，進(jìn)而增加穗粒數(shù)。下一步將對(duì)WOX轉(zhuǎn)錄因子基因家族中TaWOX3、TaWOX4、TaWOX5、Ta-WOX6、TaWOX8、TaWOX10、TaWOX15、TaWOX18、TaWOX20基因進(jìn)行克隆與功能研究，驗(yàn)證WOX基因是否可以通過調(diào)控小麥穗部、胚乳的發(fā)育來改良小麥的農(nóng)藝性狀，進(jìn)而促進(jìn)小麥增產(chǎn)。

圖3 小麥WOX基因在不同組織和不同環(huán)境誘導(dǎo)條件的基因表達(dá)模式Fig. 3 Gene expression patterns of wheat WOX genes in different tissues and conditions

總之，本研究借助于生物信息學(xué)中的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與分析，利用生物工具的繪圖功能，鑒定并分析了小麥的WOX轉(zhuǎn)錄因子基因家族，為后續(xù)小麥植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)WOX基因的克隆和功能研究奠定了理論基礎(chǔ)。