李環(huán)亭，劉 黎，喬海清，王 婷，李建兵*，王曉濱，何培迎

（1.青島市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，山東青島 266101；2.國家海洋精細(xì)化工及其生物制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，山東青島 266101；3.青島市黃島區(qū)檢驗(yàn)檢測中心，山東青島 266555；4.江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司，江蘇新沂221400）

農(nóng)藥是人類生活中不可或缺的重要物資。近年來，隨著人們環(huán)保意識的增強(qiáng)和對食品安全與健康的日益重視，農(nóng)藥生產(chǎn)不斷發(fā)展和進(jìn)步，農(nóng)藥在人類社會經(jīng)濟(jì)活動中發(fā)揮著越來越重要的作用[1]，農(nóng)藥質(zhì)量也成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2018年農(nóng)藥監(jiān)督抽查結(jié)果表明，有效成分不符合要求是農(nóng)藥質(zhì)量不合格的主要問題之一，有效成分實(shí)際含量高于標(biāo)簽標(biāo)示值[2]。農(nóng)藥有效成分含量的增加不僅會造成農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)，危害人體健康，也會對生態(tài)環(huán)境造成一定的威脅，因此農(nóng)藥有效成分含量是監(jiān)管的重點(diǎn)。

根據(jù)農(nóng)藥的物理化學(xué)及生物特性，農(nóng)藥產(chǎn)品的檢測方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、光譜法等[3]。目前吡蟲啉有效成分含量測定的國家標(biāo)準(zhǔn)方法主要有GB 28126—2011《吡蟲啉原藥》、GB 28142—2011《吡蟲啉可濕性粉劑》、GB 28143—2011《吡蟲啉乳油》、GB 28141—2011《吡蟲啉可溶液劑》、GB 28132—2011《吡蟲啉微乳劑》，均采用單點(diǎn)校正法定量高效液相色譜法測定。單點(diǎn)校正法是通過已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品與坐標(biāo)原點(diǎn)做直線，對未知濃度待測組分進(jìn)行測定，當(dāng)待測組分的線性方程與坐標(biāo)原點(diǎn)有較大差別時(shí)，單點(diǎn)校正法會出現(xiàn)較大的誤差，而且單點(diǎn)校正法對標(biāo)樣稱取、溶液配制、標(biāo)樣是否均勻的偶然誤差無法分析，因此單點(diǎn)校正法對其給出的結(jié)果無法放進(jìn)行判斷[4]。標(biāo)準(zhǔn)曲線法通過配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，定量時(shí)可以直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出含量，適合于大量樣品分析，但如果用純?nèi)軇┡渲脴?biāo)準(zhǔn)溶液來定量分析目標(biāo)物，由于基質(zhì)效應(yīng)會造成檢測結(jié)果與實(shí)際值之間會有偏差[5]，標(biāo)準(zhǔn)曲線法無法消除基質(zhì)效應(yīng)影響。標(biāo)準(zhǔn)加入法可以避免基質(zhì)干擾，但操作比較復(fù)雜，對樣品需求量較大[6]。

本文選取吡蟲啉農(nóng)藥產(chǎn)品為研究對象，采用HPLC測定，采用單點(diǎn)校正法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法3種方法定量，比較了不同定量方法對測定結(jié)果的影響。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Agilent1200高效液相色譜儀（配紫外檢測器），安捷倫科技有限公司；ML204T/02電子天平，瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)。

試劑：甲醇（色譜純），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：吡蟲啉，德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 液相色譜條件

Thermo Hypersil Gold C18柱（250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm），流動相甲醇∶水=40∶60，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL，紫外檢測器，檢測波長260 nm。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

1.3.1 單標(biāo)儲備液

稱取0.1 g（精確至0.0001 g）吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度線，配制成1 mg/mL的單標(biāo)儲備液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)使用液

準(zhǔn)確移取5.0 mL 1.3.1標(biāo)準(zhǔn)儲備液于50 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度線，配制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)工作液

取1.3.1單標(biāo)儲備液和1.3.2標(biāo)準(zhǔn)使用液用甲醇逐級稀釋成0.02～0.8 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

共選取7個(gè)不同廠家吡蟲啉農(nóng)藥產(chǎn)品，包括10%可濕性粉劑4個(gè)，25%可濕性粉劑1個(gè)，5%乳油1個(gè)，10%乳油1個(gè)。

1.4.1 單點(diǎn)校正法前處理

分別稱取2.0 g（標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%）、1.0 g（標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%）和0.4 g（標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%）樣品于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度線，然后準(zhǔn)確移取5.0 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，稀釋10倍，過濾待測。取1.3.2標(biāo)準(zhǔn)使用液，按照標(biāo)樣溶液、樣品溶液、樣品溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測定。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線法前處理

分別稱取1.0、2.0、3.0 g（標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%）；0.5、1.0、2.0 g（標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%）；0.2、0.4、0.6g（標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%）樣品于50 mL容量瓶中，然后準(zhǔn)確移取5.0 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，稀釋10倍，過濾待測。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)加入法前處理

分別稱取1.0、2.0 g（標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%）；0.5、1.0 g（標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%）；0.2、0.4 g（標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%）各3組樣品于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解定容至刻度線。準(zhǔn)確移取5.0 mL于50 mL容量瓶中，第2和3組樣品再分別準(zhǔn)確加入0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液（1.3.2）2.5、5.0 mL，用甲醇定容至刻度線，過濾待測。

2 結(jié)果和討論

2.1 方法重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差

標(biāo)準(zhǔn)曲線法配制0.02～0.8 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，線性回歸方程為y=46466.76x＋296.01，線性相關(guān)系數(shù)R2大于0.99。結(jié)果表明，在所測定濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。取10%吡蟲啉乳油樣品連續(xù)測定10次，結(jié)果見表1。單點(diǎn)校正法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.092、0.087和0.307，表明3種方法都適用于吡蟲啉含量測定。

表1 單點(diǎn)校正法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差

對表1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（F檢驗(yàn)），F(xiàn)值為35.1，顯著大于臨界值（F(2,27)=3.35），表明3種定量方法間存在顯著差異。采用F檢驗(yàn)對上述3種方法的檢測重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)加入法與單點(diǎn)校正法（p<0.001）和標(biāo)準(zhǔn)曲線法（p<0.001）有顯著差異，單點(diǎn)校正法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法兩者間無顯著差異（p=0.440＞0.05）。對任意2種不同定量方法測試結(jié)果的一致性采用t檢驗(yàn)方法進(jìn)行比較。有顯著差異的2種定量方法，采用異方差假設(shè)的t檢驗(yàn)方式；無顯著差異的定量方法，采用等方差假設(shè)的t檢驗(yàn)方式。檢驗(yàn)結(jié)果表明，單點(diǎn)校正法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法、標(biāo)準(zhǔn)加入法檢測結(jié)果間存在顯著差異（顯著性水平α=0.05），標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法之間無顯著差異（顯著性水平α=0.05）。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中的其他成分對待測組分的影響。本文通過單點(diǎn)校正法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法標(biāo)準(zhǔn)曲線來考察7種吡蟲啉產(chǎn)品的基質(zhì)效應(yīng)，并對可濕性粉劑和乳油2種劑型不同的產(chǎn)品進(jìn)行分析。采用t檢驗(yàn)分析不同劑型的3種定量方法斜率的一致性，標(biāo)準(zhǔn)加入法、單點(diǎn)校正法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法斜率比較的t值根據(jù)式（1）計(jì)算。結(jié)果表明，可濕性粉劑標(biāo)準(zhǔn)加入法、單點(diǎn)校正法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法斜率統(tǒng)計(jì)量t值分別為4.36（＞t（25）0.05臨界值=2.06）、13.49（＞t（16）0.05臨界值=2.12）；乳油標(biāo)準(zhǔn)加入法、單點(diǎn)校正法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法斜率統(tǒng)計(jì)量t值分別為1.01（＜t（17）0.05臨界值=2.11）、17.18（＞t（15）0.05臨界值=2.13）。標(biāo)準(zhǔn)加入法與單點(diǎn)校正法的斜率利用F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)進(jìn)行分析（表2和表3）。結(jié)果表明，可濕性粉劑和乳油的p值均小于0.01。

式中：t為標(biāo)準(zhǔn)加入法或單點(diǎn)校正法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法斜率的統(tǒng)計(jì)量；為標(biāo)準(zhǔn)加入法或單點(diǎn)校正法斜率平均值；μ為標(biāo)準(zhǔn)曲線法斜率；σX為標(biāo)準(zhǔn)加入法或單點(diǎn)校正法斜率標(biāo)準(zhǔn)差；n為標(biāo)準(zhǔn)加入法或單點(diǎn)校正法斜率測定次數(shù)。

表2 標(biāo)準(zhǔn)加入法和單點(diǎn)校正法斜率F 檢驗(yàn)

統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，對于可濕性粉劑，標(biāo)準(zhǔn)加入法的斜率與標(biāo)準(zhǔn)曲線法、單點(diǎn)校正法的斜率有顯著差異（置信水平α=0.05），說明可濕性粉劑的基質(zhì)效應(yīng)對定量結(jié)果的影響不可忽略，標(biāo)準(zhǔn)加入法定量可濕性粉劑的檢測結(jié)果更可靠；對于乳油，單點(diǎn)校正法與其他兩種方法的斜率有顯著性差異（置信水平α=0.05），這可能是由于單點(diǎn)校正法在測量過程中根據(jù)產(chǎn)品標(biāo)簽確定稱樣量，但樣品標(biāo)稱含量與實(shí)際含量是有差別的，實(shí)際測量過程中待測組分與標(biāo)準(zhǔn)樣品的響應(yīng)值不可能完全一致，采用單點(diǎn)校正法會產(chǎn)生較大誤差[4]。標(biāo)準(zhǔn)加入法的斜率與標(biāo)準(zhǔn)曲線法的斜率沒有顯著差異（置信水平α=0.05），說明本文檢測的乳油基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果的影響不顯著，但標(biāo)準(zhǔn)加入法操作過程較為復(fù)雜，樣品需要量大，在處理大量樣品或者對農(nóng)藥產(chǎn)品進(jìn)行監(jiān)督抽查時(shí)，會影響檢測效率，同時(shí)需要大量的標(biāo)準(zhǔn)品，可采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量更快速準(zhǔn)確。

2.3 3種定量方法測定結(jié)果t檢驗(yàn)

為了研究3種定量分析方法在檢測不同產(chǎn)品時(shí)的差異，本文對7個(gè)不同廠家的產(chǎn)品分別用單點(diǎn)校正法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行了檢測，檢測結(jié)果采用成對二樣本平均值的t檢驗(yàn)兩兩進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果表明，在顯著性水平α=0.05時(shí)，可濕性粉劑產(chǎn)品3種方法定量結(jié)果都有顯著性差異（p＜0.05）（表4）；乳油產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法定量結(jié)果沒有顯著差異（p=0.95＞0.05），但單點(diǎn)校正法與另外2種方法測試結(jié)果都存在顯著差異（p＜0.01）（表5）；這可能是單點(diǎn)校正法會受到標(biāo)樣稱取、配置等操作引起的偶然誤差，部分產(chǎn)品還會受到組成、待測成分等因素導(dǎo)致相應(yīng)信號與其量的線性關(guān)系與標(biāo)物響應(yīng)與標(biāo)物量的線性關(guān)系偏離；標(biāo)準(zhǔn)曲線法受環(huán)境影響較大，其截距偏離較大時(shí)會與單點(diǎn)校正法有顯著差異，標(biāo)準(zhǔn)加入法解決了樣品組分、基質(zhì)等因素的影響[4]。

表4 吡蟲啉可濕性粉劑3 種定量方法測定結(jié)果t 檢驗(yàn)

表5 吡蟲啉乳油3 種定量方法測定結(jié)果t 檢驗(yàn)

3 結(jié) 論

本文利用HPLC法對不同劑型不同含量的吡蟲啉農(nóng)藥產(chǎn)品進(jìn)行測定，通過單點(diǎn)校正法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行定量分析，對3種方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差、基質(zhì)效應(yīng)和測定結(jié)果進(jìn)行了F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。結(jié)果表明，對吡蟲啉可濕性粉劑產(chǎn)品，標(biāo)準(zhǔn)加入法曲線斜率與單點(diǎn)校正法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法具有顯著性差異，為消除基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，建議選擇標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行定量分析；對吡蟲啉乳油產(chǎn)品，由于單點(diǎn)校正法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法的標(biāo)準(zhǔn)偏差具有顯著性差異，單點(diǎn)校正法只有在標(biāo)準(zhǔn)曲線截距較小時(shí)才可使用，應(yīng)用受限，且標(biāo)準(zhǔn)加入法操作較為復(fù)雜，因此選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析，以節(jié)省時(shí)間，同時(shí)滿足各類檢測要求。不同定量分析方法對農(nóng)藥制劑產(chǎn)品有害成分的檢測有影響，相關(guān)農(nóng)藥產(chǎn)品的國家、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)在制定過程中需要考慮不同定量分析方法對測定的影響，以確保農(nóng)藥有效成分檢測的準(zhǔn)確性。