郭 浩，趙 科，郭小彬，楊宏昕

(內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院藥學處，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017)

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)為肺癌常見類型之一，發(fā)病率約為80%，主要臨床特點為惡性腫瘤細胞增殖緩慢、轉(zhuǎn)移擴散較晚[1]。手術是治療NSCLC的首選方法，但大多數(shù)NSCLC患者發(fā)現(xiàn)時已錯過手術機會，NSCLC雖然對放化療敏感，但放化療后NSCLC的緩解率僅約15%～35%[2]。近年來，靶向治療成為腫瘤研究的熱點，其中抗血管生成治療廣受關注，并被美國《科學》雜志評為“世界十大科技突破”[3]。作為新型表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制劑，吉非替尼被廣泛應用于治療EGFR外顯子19缺失或外顯子21點(L858R)缺失的患者，包括肺癌、卵巢癌[4]、乳腺癌[5]和結(jié)腸癌等[6]；約80%攜帶EGFR突變陽性的NSCLC患者經(jīng)吉非替尼治療后無進展生存期顯著延長[7]。隨著化療次數(shù)的增加，機體會對化療藥逐漸產(chǎn)生耐藥性，降低臨床療效。因此，如何克服耐藥性，提高肺癌患者化療后的緩解率，是目前亟需解決的主要問題。查閱中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫等發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)針對吉非替尼耐藥的NSCLC患者臨床治療的相關研究較少，本研究針對這一現(xiàn)狀探討了舒尼替尼用于對吉非替尼耐藥的NSCLC的作用，以期為臨床治療NSCLC提供更可靠的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來源

隨機選取2017年1月至2019年1月于內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院就診的NSCLC患者75例；其中男性43例，女性32例；平均年齡(58.62±15.69)歲；鱗癌27例，腺癌48例；腫瘤≥3 cm的患者19例，腫瘤<3 cm的患者56例；TNM分期Ⅰ—Ⅱ期的患者15例，Ⅲ—Ⅳ期的患者60例。所有患者年齡、性別等臨床資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。納入標準：(1)所有患者均經(jīng)臨床與病理檢查證實為對吉非替尼耐藥的NSCLC患者；(2)所有患者均同意將手術切除的惡性腫瘤組織用于本研究，并簽署知情同意書；(3)所有患者的臨床資料完整[8-9]。排除標準：(1)具有嚴重心臟、肝臟等重要臟器衰竭者；(2)具有嚴重認知功能障礙，不能配合檢查者；(3)具有乙型肝炎等傳染性疾病者。本研究已取得倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：經(jīng)患者知情并同意后，對其腫瘤組織進行切除，提取惡性腫瘤細胞后進行原代培養(yǎng)。通過膠原酶與分散酶消化30 min后，以1 000 r/min離心8 min，去上清液，用0.25%胰蛋白酶消化10 min后，以1 000 r/min離心10 min，用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。提取細胞總RNA并測定其純度以及濃度。

1.2.2 吉非替尼和舒尼替尼以及吉非替尼聯(lián)合舒尼替尼對細胞增殖率的影響：取對數(shù)生長期細胞以每孔150 μl接種于96孔板，細胞貼壁后，分別加入吉非替尼(0、1.5、3、6、12和24 μmol/L)、舒尼替尼(0、1.5、3、6、12和24 μmol/L)以及舒尼替尼(1.5 μmol/L) 聯(lián)合不同濃度的吉非替尼(0、1.5、3、6、12和24 μmol/L)進行藥物干預，對照組僅含有二甲基亞砜(DMSO)的溶劑；繼續(xù)培養(yǎng)72 h后加入四甲基偶氮唑藍(MTT)(5 g/L)10 μl，37 ℃培養(yǎng)4 h后低速離心10 min吸棄上清液，再加入DMSO 150 μl，充分振蕩使沉淀充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長570 nm處測定吸光度(OD)，實驗重復3次。細胞生長抑制率(%)=(實驗組平均OD-空白組平均OD)/(對照組平均OD-空白組平均OD)×100%，空白組為含有0 μmol/L舒尼替尼。采用直線回歸方法計算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)，實驗重復3次。

1.2.3 Western blot法檢測：(1)細胞總蛋白提取及定量。將不同處理后的細胞用胰酶消化后，以6 000 r/min低溫離心5 min收集細胞，預冷磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌，重懸，再離心，重復3次后棄上清，加入含有1%蛋白酶抑制劑細胞裂解液，吹勻后冰上放置15 min，以14 000 r/min低溫離心15 min，上清為總蛋白提取液，通過考馬斯亮藍法測定其濃度。(2)SDS-PAGE凝膠電泳。取蛋白提取物約50 μg，加入蛋白上樣緩沖液，超純水補足不足體積，總反應體系30 μl，煮沸5 min后進行電泳。設置恒壓80 V(8 V/cm)，當染料前沿進入分離膠30 min后，提高電壓至100～120 V(15 V/cm)，繼續(xù)電泳直至溴酚藍到達分離膠底部上方約1 cm，然后關閉電源。(3)將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至常規(guī)PVDF膜，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉液封閉過夜。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)(1∶1 000)、血小板衍生生長因子(PDGF)(1∶1 000)、多藥耐藥(MDR)(1∶800)以及核因子κB(NF-κB)(1∶800)抗體4 ℃孵育過夜，1∶2 000稀釋的HRP標記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，用TBST洗3次，ECL顯色液顯色。目的條帶用Image-Pro Plus分析軟件進行灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參照校正。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測舒尼替尼對吉非替尼耐藥細胞的增殖抑制作用

1.5 μmol/L的舒尼替尼對吉非替尼耐藥細胞的增殖抑制率為(16.78±1.21)%，細胞毒性較低，因此，后續(xù)選擇1.5 μmol/L的舒尼替尼進行實驗，見圖1。

圖1 舒尼替尼對吉非替尼耐藥細胞增殖抑制作用

1.5 μmol/L的舒尼替尼對吉非替尼耐藥細胞的IC50為(30.57±1.86) μmol/L，顯著低于0 μmol/L舒尼替尼對吉非替尼耐藥細胞的IC50[(45.62±1.79) μmol/L]，提示舒尼替尼可顯著增加耐藥細胞對吉非替尼的敏感性，降低吉非替尼抑制耐藥細胞增殖的IC50，見圖2。

圖2 舒尼替尼影響耐藥細胞對吉非替尼的敏感性

2.2 Western blot法蛋白測定

Western blot法檢測結(jié)果顯示，1.5 μmol/L舒尼替尼處理后的MDR、NF-κB、VEGF以及PDGF蛋白表達水平均有所降低，見圖3。通過對灰度值的分析發(fā)現(xiàn)，上述4種蛋白中PDGF表達量降低44.38%，影響最為顯著，其次為MDR(降低32.51%)；NF-κB蛋白表達量受舒尼替尼的影響最小，見表1。

圖3 舒尼替尼對吉非替尼耐藥細胞中MDR、NF-κB、VEGF及PDGF蛋白表達影響

表1 1.5 μmol/L舒尼替尼對吉非替尼耐藥細胞中MDR、NF-κB、VEGF及PDGF蛋白表達的灰度值

3 討論

吉非替尼耐藥包括原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥，其耐藥機制主要與EGFR的二次突變、c-Met擴增、代償信號建立與調(diào)節(jié)因子表達改變和腫瘤微環(huán)境改變等相關[10]；其中，發(fā)生原發(fā)性耐藥的原因包括K-ras突變和PTEN功能喪失[11]。有研究結(jié)果表明，NSCLC發(fā)生K-ras突變常提示對于吉非替尼天然耐藥，此外還可提示腫瘤預后不佳[12]。對于K-ras突變誘發(fā)的腫瘤對吉非替尼天然耐藥的原因，可能與該突變導致的Erk或Akt活化有關[13]。舒尼替尼為一種新型小分子多靶點酪氨酸激酶抑制劑，能夠抑制多種酪氨酸激酶，理論上講，同時阻斷VEGF、PDGF及其他多種酪氨酸激酶活性比單獨阻斷1種酪氨酸蛋白激酶活性的抗腫瘤效果更強[14]。舒尼替尼在腎細胞癌和胃腸間質(zhì)瘤的治療中已顯示出確切的抗腫瘤效應。魏長江等[15]對比了舒尼替尼與帕尼單抗治療晚期NSCLC的臨床療效，發(fā)現(xiàn)舒尼替尼組患者的治療有效率、病情控制率、生活質(zhì)量、無進展生存期和總體生存期均優(yōu)于帕尼單抗組，但舒尼替尼易引發(fā)較為嚴重的不良反應。2007年，美國臨床腫瘤學會年會上發(fā)布了一項關于舒尼替尼聯(lián)合吉非替尼治療31例轉(zhuǎn)移性腎細胞癌患者的Ⅱ期臨床研究的初步結(jié)果，提示舒尼替尼聯(lián)合吉非替尼治療轉(zhuǎn)移性腎細胞癌具有較好的耐受性和臨床有效性[16]。

探討舒尼替尼用于對吉非替尼耐藥的NSCLC的臨床療效研究較少。郁莉等[17]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，舒尼替尼可顯著增加耐藥細胞對吉非替尼的敏感性，降低吉非替尼的IC50。本研究在上述研究的基礎上進一步發(fā)現(xiàn)，舒尼替尼對吉非替尼耐藥細胞株中PDGF蛋白表達水平的影響最為顯著，其次為MDR、VEGF。眾所周知，新血管的形成在腫瘤生長中發(fā)揮了關鍵作用，一些促血管形成因子可以促進腫瘤血管的形成。在生理或病理血管形成過程中，VEGF具有重要的作用[18]。PDGF在其受體介導下發(fā)揮著強有絲分裂原的作用，還可以調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的合成及分解，是較為重要的血管形成因子。研究結(jié)果證實，NSCLC組織分泌了大量的PDGF-B、PDGFR-α，兩者的陽性表達高達85%及以上，與正常的癌旁組織相比差異有統(tǒng)計學意義，說明PDGF信息傳導通路組成部分有可能參與了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展[19]。本研究結(jié)果表明，舒尼替尼可能主要通過下調(diào)吉非替尼耐藥細胞株中PDGF蛋白表達，從而增強細胞對吉非替尼的敏感性，但PDGF信號通路與肺癌細胞對吉非替尼耐藥機制的關聯(lián)性需要進一步研究。

本研究結(jié)果進一步證實了舒尼替尼與吉非替尼具有協(xié)同作用，舒尼替尼可顯著增加吉非替尼耐藥細胞的敏感性。其機制可能與舒尼替尼可以降低吉非替尼耐藥細胞中PDGF、MDR以及VEGF蛋白表達相關，但需要進一步研究進行驗證。本研究主要針對舒尼替尼對吉非替尼原發(fā)性耐藥細胞進行研究，但在臨床中大多數(shù)NSCLC患者屬于繼發(fā)性耐藥，因此，對于舒尼替尼逆轉(zhuǎn)NSCLC繼發(fā)性吉非替尼耐藥的研究更具有臨床價值。