段曉燕 都義日 翁兆平 王相成 王春梅 王 濤 李劍波

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 呼和浩特010050）

脫氧核糖核酸（DeoxyriboNucleic Acid，DNA）作為遺傳信息的載體，在所有生命系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。然而，在納米領域中，通過納米技術創(chuàng)造出人工的、多樣的DNA多面體結構在納米技術、自組裝材料、分子電子技術和生物醫(yī)學等領域同樣發(fā)揮著重要作用［1-5］。

利用DNA分子內(nèi)和分子間Watson-Crick堿基配對構建出可預測、可編輯的納米結構，設計出具有不同維度、形狀和尺寸的復雜結構，如DNA二十面體結構［6］、DNA立方體結構［7］、DNA三角雙錐結構［8］、DNA四面體結構［9］等。DNA多面體結構表現(xiàn)出優(yōu)異體內(nèi)特性，包括毒性小、免疫原性低和優(yōu)異生物穩(wěn)定性［10］等。尤其在藥物遞送系統(tǒng)中，DNA多面體結構具有更加廣闊前景，具有較長藥物體內(nèi)半衰期、生物利用度高和在特定組織中積累等特性，減少劑量依賴性和副作用。因為DNA多面體結構在分子探針、藥物載帶等方面存在著巨大潛力，引起了國內(nèi)外研究人員的關注［11-15］。

在前期研究中［16］，采用二氯亞錫還原法對單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA，A20）進行99mTc標記，得到標記ssDNA（99mTc-ssDNA）；再將99mTcssDNA（A20）與含有T20手臂鏈的DNA三角雙錐結構（DNA Bipyramid Nanostructures，DBNs）混合雜交，得到99mTc-DBNs。通過一系列的體內(nèi)外實驗，探索了99mTc-DBNs在昆明鼠體內(nèi)的分布和代謝情況。研究結果顯示DNA三角雙錐結構具備發(fā)展成為

SPECT（Single-Photon Emission Computed Tomography）分子探針的潛力。锝-99m屬于單光子核素，采用SPECT設備進行信號采集；而PET設備采集正電子核素所產(chǎn)生的兩個背向光子，分辨率更高，圖像更為清楚。所以在本研究中，基于前期99mTc（金屬放射性核素）標記DNA單鏈的研究成果，我們選用發(fā)射正電子的放射性金屬核素取代99mTc進行DNA單鏈的標記研究，而64Cu成為最佳的候選PET核素之一。在制備基于DNA多面體結構的PET分子探針時，擬采用與制備99mTc-DBNs相似的標記方法，即首先將64Cu標記ssDNA，得到64Cu-ssDNA；再將64Cu-ssDNA與含有手臂鏈的DNA多面體結構混合雜交，從而制備出64Cu標記的DNA多面體結構，所以64Cu標記ssDNA的制備就成為制備基于DNA多面體結構的PET分子探針的關鍵一步。

本文在前期研究基礎和以上實驗設想上，將探索64Cu標記ssDNA的最佳標記條件；同時通過體內(nèi)分布實驗，研究64Cu標記ssDNA在昆明鼠體內(nèi)的分布代謝情況，為后續(xù)64Cu標記DNA多面體結構PET分子探針的制備及分子探針在實驗動物體內(nèi)的生物性質(zhì)研究提供有價值的實驗依據(jù)和實驗對照信息。

1 方法與材料

1.1 材料

DNA寡聚核苷酸單鏈（ssDNA）于Takara生物醫(yī) 學 技 術 公 司（北 京）；p-SCN-Bn-NOTA于Macrocyclics公司（Plano，TX，USA）；昆明鼠（雌性，4～6周，18～20 g）于內(nèi)蒙古大學實驗動物中心；其他化學試劑于國藥集團化學試劑有限公司（上海）。

1.2 單鏈DNA的放射性標記

在對單鏈DNA（ssDNA）進行64Cu標記之前，需要先將ssDNA與螯合劑p-SCN-Bn-NOTA進行偶聯(lián)［17］。首先對ssDNA的5’端進行氨基修飾（Takara生物醫(yī)學技術公司提供）；然后將一定量的氨基修飾ssDNA溶解于磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）中，制成0.1 mmol·L-1ssDNA溶液；量取0.5 mg p-SCN-Bn-NOTA粉末溶解在DMSO中，加入ssDNA溶液中，碳酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)混合液pH至8.5～9.0。反應混合液在室溫下持續(xù)振蕩2 h。反應 結 束 后，利 用NAP-5脫鹽柱（GE Healthcare，F(xiàn)airfield，CT，USA）對反應混合液進行純化，1xPBS作為洗脫緩沖液，得到純化的偶聯(lián)NOTA的ssDNA（NOTA-ssDNA）。NOTA-ssDNA的濃度由UV-VIS光譜儀（Agilent Cary 60，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）測量，其中DNA的濃度確定后，用于后續(xù)標記實驗。

將64Cu溶液（溶于0.1 mol·L-1HCl）與100μL醋酸鈉溶液（0.05 mol·L-1，pH 5.5）混勻，加入500μL NOTA-ssDNA溶液后，在37°C下反應1 h。在反應期間，利用放射性高效液相色譜（Radio-HPLC）檢測放射性標記反應的程度。反應結束后，將混合溶液通過NAP-5脫鹽柱純化，乙二胺四乙酸鈉溶液（0.05 mol·L-1）用作流動相，得到純化的目標產(chǎn)物64Cu標記ssDNA（64Cu-ssDNA），用于后續(xù)的生物學評價實驗。

1.3 體外穩(wěn)定性實驗

將純化后64Cu-ssDNA（100μL）分別與PBS溶液（200μL）和小鼠血清（Mouse serum，200μL）孵育一定時間，利用薄層色譜（Thin Layer Chromatography，TLC）在不同時間點（0.5 h、1.0 h、2.0 h、4.0 h、6.0 h）檢測64Cu-ssDNA的放化純度，計算64Cu-ssDNA的體外穩(wěn)定性。

1.4 體內(nèi)分布實驗

將3.7×106Bq64Cu-ssDNA通過小鼠尾靜脈注射到昆明鼠體內(nèi)，在注射后30 min和180 min后，將昆明鼠（n=3/每組）麻醉后處死，收集感興趣器官或者組織進行稱重，并用γ計數(shù)器（PerkinElmer）測量64Cu-ssDNA的攝取量。每個器官或組織中的示蹤劑攝取量表示為每克組織注射劑量的百分比（%ID·g-1）。

動物實驗的研究方案已經(jīng)得到內(nèi)蒙古醫(yī)科大學醫(yī)學倫理委員會批準。動物實驗按照“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”進行［18］。

2 結果與討論

2.2 單鏈DNA的放射性標記及體外穩(wěn)定性

ssDNA的放射性標記按照圖1所示進行。首先將氨基修飾ssDNA與雙功能螯合劑p-SCN-Bn-NOTA進行偶聯(lián)，得到NOTA-ssDNA溶液；再將NOTA-ssDNA溶 液 與64Cu溶 液 混 勻，反 應1 h后Radio-HPLC（Dionex UltiMate 3000）檢測，放化標記率為（66.4±2.85）%（n=3），如圖2所示。64Cu-ssDNA保留時間為9～10 min，而游離銅保留時間在15～16 min；利用NAP-5脫鹽柱對反應溶液進行純化，得到64Cu-ssDNA溶液，放化純度大于95%。

圖1 ssDNA放射性標記示意圖Fig.1 Schematic diagram of ssDNA radiolabeling

將純化后64Cu-ssDNA分別與PBS溶液（v/v=1/2）和小鼠血清（v/v=1/2）孵育一定時間，利用TLC檢測64Cu-ssDNA的放化純度，結果如圖3所示，64CussDNA在PBS和小鼠血清中至少能穩(wěn)定存在6 h，且在小鼠血清中孵育4 h后，64Cu-ssDNA的放化純度大于90%。

圖2 64Cu-ssDNA的放射性HPLC分析Fig.2 Radio-HPLC analysis of 64Cu-ssDNA

圖3 64Cu-ssDNA在PBS溶液和小鼠血清中的穩(wěn)定性研究Fig.3 Stability of 64Cu-ssDNA in PBS and mouse serum

2.3 體內(nèi)分布實驗

將純化后64Cu-ssDNA（3.7×106Bq）溶液通過尾靜脈注射到昆明鼠體內(nèi)，在注射后30 min和180 min，將該時間點昆明鼠（n=3）麻醉后處死，取感興趣組織或者器官，研究各組織或器官64Cu-ssDNA的攝取量，數(shù)值用%ID·g-1進行表示。實驗結果如圖4所示。注射64Cu-ssDNA 30 min后，心臟中放射性攝取量為（3.53±0.30）%ID·g-1，在180 min后，心臟中的攝取量為（2.33±0.36）%ID·g-1，64Cu-ssDNA進入血管后，隨著血液循環(huán)運送到各個臟器或器官。注射64Cu-ssDNA 30 min和180 min后，肌肉和腦組織放射性攝取量低，攝取量值均低于1%ID·g-1；注射后30 min，肝臟和脾臟有一定量的放射性攝取，攝取 量 分 別 是（6.99±0.77）% ID·g-1和（3.11±0.42）%ID·g-1，注射后180 min，肝臟和脾臟中的攝取量有些降低，攝取量分別是（5.66±0.89）%ID·g-1和（1.49±0.33）%ID·g-1。胃腸道的放射性攝取量從注射后30 min的（3.64±0.30）%ID·g-1到180 min后的（21.37±4.50）%ID·g-1，說明一部分64Cu-ssDNA通過昆明鼠的胃腸道代謝。注射64Cu-ssDNA 30 min后，腎臟中出現(xiàn)高放射性攝取量（（12.87±1.56）%ID·g-1），說明64Cu-ssDNA通過尾靜脈進入昆明鼠體內(nèi)后，經(jīng)過腎臟過濾進入膀胱，此時間點膀胱中的放射性攝取量達到了（38.36±4.65）%ID·g-1；180 min后，腎臟中的攝取量較30 min時的攝取量降低，而膀胱中的放射性攝取量進一步增大，達到了（63.84±5.86）%ID·g-1，結果說明64Cu-ssDNA進入昆明鼠體內(nèi)后，主要通過泌尿系統(tǒng)代謝排出體外。

圖4 64Cu-ssDNA在昆明鼠體內(nèi)的分布研究（n=3）Fig.4 Biodistribution of 64Cu-ssDNA in Kunming mice(n=3)

3 結語

本研究成功對ssDNA進行了銅-64標記，得到了目標產(chǎn)物64Cu-ssDNA（純化后放化純度＞95%），為后期基于DNA多面體結構的PET分子探針的制備解決了關鍵的一步；同時本文也對64Cu-ssDNA在昆明鼠體內(nèi)的分布代謝情況進行了研究，了解64CussDNA進入昆明鼠體內(nèi)后，主要通過泌尿系統(tǒng)代謝排出體外，為后續(xù)研究64Cu標記DNA多面體結構的體內(nèi)分布代謝提供一定的實驗依據(jù)和實驗對照。