陳建彤，盧露，金之怡，南燕，應磊，汪洋

1.溫州醫(yī)科大學 病理生理學教研室，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童急危重癥醫(yī)學科，浙江 溫州 325027；3.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 新生兒科， 浙江 溫州 325027

對乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）作為一種解熱鎮(zhèn)痛藥物自1955年使用以來一直占據(jù)主導地位[1]。治療劑量下的APAP具有很好的療效，但一旦攝入過量就會造成肝毒性。成人APAP的推薦劑量為650～1 000 mg/4～6 h，不超過4 g/d。兒童劑量為15 mg/（kg·6 h），最高60 mg/（kg·d）。毒性產(chǎn)生劑量為7.5～10 g/d（成人）、140 mg/kg（兒童）[2]。APAP是引起藥物性急性肝損傷最常見的藥物之一，并成為歐美等發(fā)達國家引起急性肝衰竭的最主要因素[3]。研究表明，線粒體氧化應激是APAP所致肝損傷（APAP-induced liver injury，AILI）的主要細胞事件。據(jù)此，N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl cysteine，NAC）被用作治療AILI早期的一種有效解毒劑。然而，狹窄的治療窗口以及不良反應限制了它的使用。目前，除了線粒體氧化應激外，還有許多其他的細胞過程參與了AILI的發(fā)病，包括I相/II相代謝、無菌性炎癥、內(nèi)質網(wǎng)應激、自噬、微循環(huán)功能障礙等。這些過程為更有效地治療AILI提供了新的靶點。筆者綜述了APAP肝毒性涉及的各種細胞事件以及針對這些事件可能的治療措施，有望為AILI或者相關急性肝損傷的治療提供新的思路。

1 以APAP肝臟代謝機制為靶點的治療

藥物在肝臟中代謝一般分為兩個階段。第一階段稱為I相反應，主要通過氧化、還原及水解反應，產(chǎn)生一系列包括氧自由基在內(nèi)的肝細胞毒性產(chǎn)物；第二階段稱為II相反應，主要通過結合反應來解毒。APAP的代謝主要發(fā)生在肝微粒體內(nèi)。大部分（約90%）APAP都進入了II相代謝途徑，在II相代謝過程中，UDP-葡萄糖醛基轉移酶和磺基轉移酶催化APAP生成無毒性的葡萄糖醛基化和硫酸化的代謝物，這些代謝物通過尿液被排出體外[4]。極少量的APAP（約2%）在沒有任何代謝的情況下隨尿液排出。APAP的另一部分（約10%）被肝細胞色素P450酶系統(tǒng)的 CYP2E1轉移到I相氧化，在此過程中形成了一種高度活性的毒性代謝物N-乙酰-對苯醌亞胺（N-acetylp-benzoquinoneimine，NAPQI）。APAP肝毒性從生成毒性代謝產(chǎn)物NAPQI開始，治療劑量下的NAPQI通過與肝臟中大量的谷胱甘肽（glutathione，GSH）結合喪失活性[5]。除此之外，NAPQI還可以直接修飾胞漿的腫瘤抑制因子kelch樣ECH相關蛋白1（kelchlike ECH associated protein 1，Keap1）的半胱氨酸巰基，使Nrf2脫泛素化與Keap1分離，激活Keap1-Nrf2通路，調(diào)控抗氧化酶來促進APAP的代謝失活[6]。一旦過量使用APAP，NAPQI大量蓄積，導致肝臟內(nèi)的GSH迅速消耗。此外，Keap1-Nrf2的生理性調(diào)控也將喪失，游離的活性NAPQI與蛋白質巰基發(fā)生反應，形成蛋白加合物。NAPQI蛋白加合物形成的主要靶點是線粒體，這將導致線粒體發(fā)生DNA損傷[7]。

APAP的藥物代謝研究發(fā)現(xiàn)，增加APAP的II相代謝酶活性可以減少由細胞色素P450代謝產(chǎn)生的NAPQI，這有利于減輕APAP的肝毒性。有研究表明，通過激活肝X受體（liver X receptors，LXR）可以顯著改善AILI，而這種改善作用主要是通過增強II相代謝酶活性來實現(xiàn)的[8]。除了增加II相代謝酶活性之外，還可以通過調(diào)節(jié)細胞色素P450酶的表達和活性來減輕APAP肝毒性。植物珠子草提取物能通過抑制CYP2E1的表達和活性來治療小鼠的APAP肝毒性[9]， 綠茶提取物也已被證明能抑制CYP1A2和CYP2E1的活性來保護小鼠免受APAP肝毒性[10]。相關研究還表明，一些核受體和轉錄因子能調(diào)控這些酶的表達，如孕烷X受體（pregnane X receptor，PXR）[11]。對PXR基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)其對APAP肝毒性的敏感性降低，這說明PXR主要是對CYP酶系統(tǒng)起到正向 調(diào)節(jié)作用[12]。此外，5-脂氧合酶（5-Lipoxygenase，5-LO）遺傳缺失的小鼠APAP肝毒性也明顯減輕，這主要與抑制其代謝酶CYP3A有關[13]。

雖然這些藥物具有一定的治療效果，但由于AILI患者往往在病程中已處于肝損傷階段，來不及進行早期醫(yī)學干預。因此，更有針對性的治療方法，相較代謝階段的預防性干預將更具臨床意義。

2 以線粒體氧化應激和功能障礙為靶點的治療

在APAP肝毒性的過程中，線粒體蛋白例如ATP合酶和谷胱甘肽過氧化物酶等都是毒性產(chǎn)物NAPQI結合的靶點。此外，NAPQI還能通過干擾線粒體電子傳遞鏈上的復合體I和II，導致電子泄露形成超氧自由基[14]。超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase，SOD2）通常會清除線粒體內(nèi)的超氧化物，研究表明在部分缺乏SOD2的小鼠中，其肝臟損傷顯著加重[15]。線粒體內(nèi)過高的超氧化物除了可以分解為H2O2之外，也可以與線粒體內(nèi)的NO反應產(chǎn)生高反應性過氧亞硝酸鹽[16]。雖然GSH可以有效清除這些過氧亞硝酸鹽，但當暴露于過量APAP環(huán)境中使GSH耗竭，就會導致線粒體酪氨酸硝基化。這些硝基化的線粒體蛋白造成了線粒體的DNA損傷以及線粒體通透性孔的開放，最終引起細胞壞死[17]。

目前，臨床上有關APAP肝毒性的治療措施主要是針對其線粒體氧化應激機制的。NAC作為一種抗氧化還原劑，是臨床上使用的唯一解毒劑。其治療原理是通過補充體內(nèi)的GSH來改善氧化應激，以達到緩解急性肝損傷的目的。但NAC治療窗口期狹窄，需要在APAP中毒后8 h內(nèi)使用才具有較好的治療效果，且還有惡心、嘔吐、過敏等不良反應[18]。因此，除NAC以外保護線粒體的其他化合物可能是更好的選擇。有報道稱線粒體靶向抗氧化劑在APAP治療后3 h也能預防AILI，這表明它是APAP中毒晚期患者的一種潛在的治療選擇[19]。另一種在APAP模型中被證明具有肝保護特性的現(xiàn)有藥物是亞甲基藍，這是一種臨床使用的解毒劑，可以通過線粒體膜滲透。該藥物可作為受損復合物II的電子載體，有效恢復ETC功能，維持線粒體生物能穩(wěn)態(tài)，從而保護小鼠免受AILI的侵害[20]。

3 以信號通路為靶點的治療

3.1 JNK通路 APAP誘導的線粒體氧化/硝基化應激的一個早期結果是胞漿中JNK的激活。大量的NAPQI積累耗竭了肝內(nèi)的GSH，導致線粒體向細胞質釋放更多的超氧化物，氧化線粒體內(nèi)的硫氧還蛋白，使凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1）與其脫離[21]，從而觸發(fā)ASK-1的自我激活[22-23]。除了氧化硫氧還蛋白，線粒體氧化應激還能激活糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）。磷酸化的GSK-3β又進一步激活了混合譜系酶3（mixed lineage kinase 3，MLK3）。激活的ASK1和MLK3活化了蛋白激酶4/7[24]，然后激活JNK繼而啟動了級聯(lián)效應[21]。通過轉位到線粒體，與線粒體膜上Sab蛋白結合[25]，繼而引起線粒體內(nèi)Src的失活，最終導致電子傳遞鏈功能障礙，ROS釋放增加。ROS繼續(xù)激活上游絲裂原活化蛋白激酶，然后磷酸化JNK，JNK的持續(xù)激活又可以擴增線粒體ROS，形成了一個自我維持的激活回路[26]。在活化的JNK向線粒體轉移的同時，也引起胞漿內(nèi)Bax的激活并轉位到線粒體，觸發(fā)了線粒體通透性轉變孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）的開啟，導致膜電位的缺失和ATP的耗竭[27]。MPTP的誘導最終會導致大量重要的線粒體蛋白釋放到胞漿中，例如凋亡誘導因子（apoptosis-inducing factor，AIF）和核酸內(nèi)切酶G。這兩種蛋白都移位到細胞核中，導致DNA斷裂，最終引起細胞壞死[28]。

SP600125是JNK一種經(jīng)典的ATP競爭抑制劑，已被報道在體內(nèi)和體外對AILI具有保護作用。此外，在AILI患者中延遲給藥5 h比NAC更有效[29]。另一種已被證明可以預防APAP肝毒性的JNK抑制劑是DJNKI1，它是一種抑制JNK與基質相互作用的肽。考慮到JNK在肝再生中的功能和其他可能的保護作用，直接或間接抑制JNK的策略也可能抑制JNK的潛在益處，這可能限制JNK抑制劑的治療應用[30]。最近，從樟腦草中分離到的萜烯化合物也被證明能通過抑制磷酸化JNK與線粒體蛋白Sab的相互作用來保護免受APAP肝毒性[31]。該藥在未來的臨床應用中可能非常有前景，因為它是干擾了JNK的自維持激活回路，而不是直接抑制JNK，因此不會抑制AILI中瞬態(tài)JNK激活可能產(chǎn)生的有益作用[32]。二甲雙胍也被證明能通過上調(diào)Gadd45基因表達抑制磷酸化JNK來保護和治療AILI[33]。但后續(xù)研究又發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍治療APAP肝毒性并不是抑制JNK激活或線粒體轉位，這說明可能存在別的信號通路或細胞事件參與了保護作用[34]。

3.2 Nrf2通路 在APAP肝毒性的過程中，毒性代謝產(chǎn)物NAPQI的直接修飾作用以及線粒體氧化應激共同激活Keap1-Nrf2信號通路。Nrf2的激活導致血紅素氧酶-1（heme oxygense-1，HO-1）等抗氧化酶的轉錄激活，催化GSH合成來促進APAP的代謝失活，從而抵御NAPQI所導致的肝臟毒性。

有研究表明，除了直接被NAPQI激活外，蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）也參與了Keap1-Nrf2通路的激活[35]。在缺乏PTP1B或M1毒蕈堿受體（M1 muscarinic receptors，M1R）的小鼠中，成纖維細胞生長因子21（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21）和M1R 能保護其免受APAP肝毒性。這種保護作用主要是通過增強肝臟中的Nrf2信號通路來實現(xiàn)的[36]，提示PTP1B和M1R可能是對抗AILI的新的治療靶點。除了FGF21和M1R，許多生物活性成分也可以通過進一步激活Keap1-Nrf2通路來保護APAP誘導的肝毒性，例如丹參酮IIA、香椿槲皮素、咖啡酸、鼠尾草酸 等[16]。雖然這些天然產(chǎn)物對APAP肝毒性的影響通過預處理法進行了檢測，但是由于APAP肝毒性的不可預測性，需要進一步研究來確定其臨床療效。

4 以無菌性炎癥為靶點的治療

APAP肝毒性導致肝細胞內(nèi)容物的大量釋放，包括核DNA片段、線粒體DNA和ATP等。這些細胞損傷相關分子（cell injury related molecules，CIRM）可以激活枯否細胞（Kupffer cell，KC），誘導其釋放促炎性細胞因子[37]，隨后將中性粒細胞和單核細胞招募到肝臟的損傷區(qū)域[38]。持續(xù)和放大的炎癥反應，最終導致氧化應激和過氧化亞硝酸鹽形成，促進肝損傷[37]。同時，激活的KC也能釋放細胞因子IL-4和抗炎因子IL-10通過清除細胞碎片和促進細胞再生來發(fā)揮保護作用。在APAP的肝毒性期間，通常會引起廣泛的無菌性炎癥。然而，它究竟是促進肝損傷的進展，還是作為細胞對毒性的防御仍然有很大爭議[39]。盡管如此，無菌性炎癥仍可能作為一種治療靶點來保護APAP的肝毒性。

有研究表明，TNF I型受體基因敲除小鼠能保護其免受APAP肝毒性，這可能與致炎細胞因子TNF-α和IL-1的產(chǎn)生減少有關[40]。苯乙醇也被證明能以toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）依賴方式減少IL-1和IL-18的釋放，由此來預防AILI[41]。然而，該藥物的線粒體毒性作用限制了其在臨床的使用[42]。脂氧素A4同樣也被證明能對APAP肝毒性起到一定的保護作用，其主要機制是通過抑制炎性調(diào)節(jié)因子核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的活化來減少促炎因子TNF的表達[43]。除了抑制促炎因子的釋放，阻止中性粒細胞的招募也是一種可行的治療手段。據(jù)報道，消退素能通過抑制中性粒細胞進入肝臟而減輕APAP的肝毒性[44]。炎癥除了可能促進AILI的進展外，還有助于清除死細胞和碎片，刺激肝臟的后期修復和再生，因此，對再生后期治療效果的研究也必不可少。研究表明，IL-6可以通過激活磷酸肌醇3激酶和Akt來促進再生和誘導保護性熱休克蛋白的表達[45]。據(jù)報道，野生型小鼠中IL-6及其家族成員IL-11、白血病抑制因子的肝臟mRNA表達呈時間依賴性增高，提示該細胞家族可能對肝臟具有保護作用。研究也證明IL-6在敲除小鼠中更容易加重AILI，而這種APAP肝毒性易感性的增加與APAP治療后肝熱休克蛋白25、32和40的表達缺乏有關。這些結果表明，IL-6和其他家族成員可能通過上調(diào)肝臟中幾種細胞保護熱休克蛋白的表達來保護肝臟免受損傷[46]。乳鐵蛋白是一種多功能蛋白，可以調(diào)節(jié)免疫細胞功能。研究已證明乳鐵蛋白可以通過調(diào)節(jié)炎癥反應來實現(xiàn)對APAP肝毒性的保護作用。與此同時，研究也發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白還可以通過激活KC抑制APAP誘導的肝竇內(nèi)皮細胞損傷，改善肝微循環(huán)功能障礙[47]。總而言之，由于炎癥在APAP肝毒性的確切作用尚不明晰，所以將其作為治療靶點也存在爭議。

5 以內(nèi)質網(wǎng)應激為靶點的治療

內(nèi)質網(wǎng)應激是另一種應激通路，可誘導JNK通過細胞凋亡介導細胞死亡[48]。內(nèi)質網(wǎng)應激可在各種肝損傷模型中觀察到，在APAP肝毒性中也發(fā)揮了一定的作用。在APAP肝毒性過程中，這種應激反應是由NAPQI與ER蛋白共價結合觸發(fā)[49]。大量積累的NAPQI耗竭內(nèi)質網(wǎng)中的GSH，也可能會引起氧化還原失衡，導致eIF2α側蛋白的磷酸化以及活化轉錄因子6（activating transcription factor，ATF6）和C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）的激活[50]。研究發(fā)現(xiàn)，CHOP在一定程度上能促進AILI的發(fā)生[51]。有報道稱，辛伐他汀能通過抑制CHOP的表達對小鼠AILI產(chǎn)生保護作用[52]。鹽酸奧扎格雷被證明能通過抑制CHOP的表達來減少肝細胞死亡[53]。

S-烯丙基-L-半胱氨酸（SAC）也被證明可以通過減少eIF2α磷酸化，抑制CHOP上調(diào)及其核易位，取消caspase 3的活化，最終保護肝細胞免于凋亡[54]。因此，抑制CHOP可能是治療APAP中毒患者的一種潛在治療策略。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，功能性鞘氨醇-1-磷酸（S1P）受體拮抗劑FTY720和鞘氨醇激酶-1（SPHK1）抑制劑PF543均能通過減少eIF2α的磷酸化以及激活轉錄因子4（ATF4）的水平以減輕APAP誘導的ER應激，并顯著改善AILI[55]。

6 以自噬為靶點的治療

自噬是細胞自身一種嚴格調(diào)控的過程，它通過去除不需要的胞質內(nèi)容物和受損細胞器來更新細 胞[56]。自噬開始于雙膜結構的吞噬體，隨著吞噬體的膨脹和閉合，吞噬體成為一個完整的自噬體，然后自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體[57]。受損線粒體和內(nèi)質網(wǎng)應激引起的ROS可誘導自噬。APAP肝毒性可以引起線粒體損傷、ATP消耗和肝細胞內(nèi)APAP蛋白加合物的積累，最終導致肝細胞壞死[58]。自噬有助于清除損傷的線粒體，并為ATP的產(chǎn)生提供能量，因此可以推測自噬可能是對抗APAP肝毒性的重要保護機制。有研究表明：脂聯(lián)素可以通過激活AMPK和ULK1介導的自噬來預防AILI[59]。雷帕霉素也被證明能通過誘導自噬來減輕AILI[60-61]。此外，小豆蔻素也被報道通過激活NFE2L2信號通路促進自噬，產(chǎn)生對AILI的保護作用[62]。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，水果和蔬菜等天然產(chǎn)品中提取的非瑟酮通過增加ATG5的表達促進自噬，從而抑制AILI[63]。這說明誘導自噬可能可以作為一種潛在的治療方法來減輕APAP肝毒性。然而，自噬在機體調(diào)節(jié)中除了是細胞應激下的一種生存機制外，在一定條件下還可以誘導自噬細胞死亡。高水平的自噬細胞可去除細胞內(nèi)過多的脂質，并損害正常的細胞器，導致膜通透性增加和線粒體損傷，最終導致自噬細胞死亡[64]。 因此，由于自噬的雙重作用，通過誘導自噬來作為減輕APAP肝毒性的潛在治療策略仍有待進一步確認。

7 以微循環(huán)功能障礙為靶點的治療

除了通過APAP的代謝激活直接導致肝細胞損傷外，肝臟微循環(huán)障礙也參與了AILI。肝壞死前的微血管充血提示APAP不僅對肝細胞有毒性，而且對肝竇狀內(nèi)皮細胞（liver sinusoidal endothelial cells，LSECs）也有毒性，而LSECs是APAP對肝臟損傷的早期靶點。研究已經(jīng)表明：APAP通過顯著降低小鼠分離的LSECs的GSH水平而具有毒性。APAP對LSECs的損傷也反映在處理后的細胞質中出現(xiàn)較大的縫隙[65]。這些結果充分證明了肝臟微循環(huán)障礙在APAP肝毒性中的重要作用。NO通過影響白細胞、血小板和內(nèi)皮細胞黏附分子的表達，在維持肝臟微血管的充足血液供應方面發(fā)揮著關鍵作用。NOS抑制劑加劇了肝臟微血管炎癥反應，包括白細胞-內(nèi)皮相互作用于內(nèi)毒素和缺血再灌注，提示NO對穩(wěn)定肝臟微循環(huán)具有保護作用。ITO等[66]的研究證明，NOS亞型衍生的NO能通過穩(wěn)定肝臟微循環(huán)發(fā)揮對APAP肝毒性的保護作用。GANEY等[67]研究發(fā)現(xiàn)，LSECs在APAP過量后比肝細胞更早出現(xiàn)損傷，而這些損傷的LSECs激活了凝血級聯(lián)反應使得血小板數(shù)目減少，隨后通過激活蛋白酶激活受體-1（protease activated receptor-1，PAR-1）信號通路造成凝血系統(tǒng)的紊亂并最終形成了AILI。研究表明，使用肝素的抗凝作用能在早期（6 h）緩解其肝毒性[67]，同為抗凝劑的達比加群酯也能降低早期APAP的肝毒性，但由于肝細胞的增殖減弱，其在APAP后24 h又顯著加重了肝損傷[68]。因此，抗凝治療還存在著一定的不確定性，需要后續(xù)深入研究。

8 總結與展望

隨著APAP在臨床上的廣泛使用，其肝毒性問題逐漸成為重大的公共衛(wèi)生問題。臨床上主要使用NAC來作為唯一解毒劑，通過緩解氧化應激發(fā)揮作用。但由于NAC使用的局限性，使得尋找新的有效治療藥物成為當務之急。AILI機制十分復雜，許多細胞內(nèi)外事件都參與了這一病理生理過程，包括代謝、線粒體氧化應激和功能障礙、無菌性炎癥、內(nèi)質網(wǎng)應激、自噬、微循環(huán)功能障礙等，這些事件調(diào)節(jié)AILI的各個方面，如啟動損傷，直接介導肝細胞死亡，限制細胞應激反應，幫助肝臟修復和再生。因此，除了氧化應激之外，其他過程也可能是AILI的潛在治療靶點。目前的研究發(fā)現(xiàn)，以代謝機制為靶點的治療能對APAP肝毒性起到早期的干預，但這些可能用作臨床解毒劑的化合物還需要在APAP后進行測試，而不單單只作為預處理。未來的臨床研究可能還需要更進一步探索這些藥物的后期治療效果和潛在的不良反應。針對內(nèi)質網(wǎng)應激和微循環(huán)障礙的治療也能在一定程度上保護APAP肝毒性，但后續(xù)的臨床研究需要進一步明確其保護機制。值得注意的是，無菌性炎癥和自噬在AILI的不同階段發(fā)揮不同的作用，使得它們在調(diào)節(jié)APAP肝毒性方面具有矛盾性，針對這些事件的治療策略可能最終無效?？偠灾磥砦覀冃枰M行更多的研究來進一步闡明這些時間依賴性事件在AILI中的確切作用，從而使得后期治療在臨床中成為可能。