梁靚陳奎蓉程鋒田威龍高九昱蘭干球梁晶

(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,南寧 530004)

內(nèi)分泌代謝性疾病包括糖尿病、肥胖癥、骨質(zhì)疏松癥和痛風(fēng)等以體內(nèi)碳水化合物、脂類物質(zhì)、蛋白質(zhì)代謝障礙為特征的生理紊亂性病癥[1],其中糖尿病已成為繼心血管疾病和腫瘤之后的第三大非傳染性疾病,嚴(yán)重威脅人類健康。近年來,我國更是成為世界上糖尿病第一大國[2],其它內(nèi)分泌代謝性疾病亦成為困擾人們正常生活的常發(fā)病[3-5]。雖然內(nèi)分泌代謝性疾病患病率呈逐年升高的趨勢(shì)[6],但由于對(duì)發(fā)病原因、致病機(jī)制以及治療靶點(diǎn)尚無確切闡明,使之成為人類健康的長期困擾,開展相關(guān)機(jī)制研究已成為人類醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。其中,構(gòu)建適宜的動(dòng)物模型,是對(duì)內(nèi)分泌代謝性疾病深入研究的重要基礎(chǔ)。

利用嚙齒類動(dòng)物模型開展疾病研究是目前比較成熟的手段[7],但因其與人類在遺傳背景、組織結(jié)構(gòu)、生理代謝及發(fā)病機(jī)制等方面還存在一定差距,因此,制備生理病理特征與人類更為相近的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型非常必要。非人靈長類動(dòng)物作為一種臨床前動(dòng)物模型,不僅在基因水平上和人類極為相似,而且在內(nèi)分泌代謝性疾病的研究中可以更加確定藥物對(duì)人類的安全性和有效性[8],但其局限是可供研究的動(dòng)物數(shù)量有限、研究費(fèi)用較高、實(shí)驗(yàn)技術(shù)與設(shè)備普及程度較低,還可能會(huì)面臨倫理問題[9]。近年來,國內(nèi)外學(xué)者開始應(yīng)用小型豬構(gòu)建內(nèi)分泌代謝性疾病模型,由于其在生理生化指標(biāo)、解剖結(jié)構(gòu)、飲食特點(diǎn)、藥物代謝和疾病發(fā)生發(fā)展等方面與人類十分相似,越來越多的研究人員開始對(duì)小型豬疾病模型展開更為全面深入的研究[10-13]。本文對(duì)應(yīng)用小型豬構(gòu)建內(nèi)分泌代謝性疾病動(dòng)物模型的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 建模小型豬品系及來源

小型豬品系繁育工作在歐美等發(fā)達(dá)國家先于我國開展,當(dāng)前包括日本、捷克、美國、德國和法國等地區(qū)的小型豬品系已廣泛用于科學(xué)研究,國內(nèi)小型豬品系也依據(jù)地域特點(diǎn)擁有各自優(yōu)勢(shì)[14]。同時(shí),各地區(qū)亦不斷開展新品系的繁育工作。

1.1 國外小型豬

發(fā)達(dá)國家地區(qū)通常采用異地異源豬種雜交的方法進(jìn)行品系繁育工作,因此小型豬血緣繁雜、遺傳基礎(chǔ)差異大[15]。目前,國外已報(bào)道的不同小型豬品系信息如表1 所示。以往的報(bào)告指出,國際上常用于科學(xué)研究的小型豬品系包括:美國明尼蘇達(dá)-霍麥爾(Minnesota-Hormel)品系,源自卡塔利娜島野豬(Catalina Island pig)、幾內(nèi)亞野豬(Guinea hops)、皮納森林野豬(Piney woods rooters)和關(guān)島豬(Rasnlansa pig)的雜交繁育[16],為首例小型豬品系,于1949年完成;美國皮特曼-摩爾(Pitman-Moor)品系,源自佛羅里達(dá)半島內(nèi)野豬的選育[17],由皮特曼-摩爾制藥公司完成;美國漢福德(Hanford)品系,源自皮特曼-摩爾品系小型豬和派洛斯豬(Palouse pig)雜交后代與拉布哥豬(Labco pig)的雜交繁育[18],由亨浮爾德研究所完成;美國艾塞克斯(Essex)品系,源自德克薩斯州內(nèi)豬種選育[19];美國尤卡坦(Yucatan)品系,源自尤卡坦半島內(nèi)野豬和美國中部野豬的雜交繁育[17];美國奧薩博(Ossabaw)品系,源自佐治亞州奧薩博島內(nèi)野豬的選育[16];美國內(nèi)布拉斯加(Nebraska)品系,源自皮特曼-摩爾品系小型豬和洪都拉斯境內(nèi)矮小豬的雜交繁育[17];德國哥廷根(Gottingen)品系,源自明尼蘇達(dá)-霍麥爾品系小型豬和越南小型野豬雜交后代與德國蘭德瑞斯(Landrace)品系改良豬的雜交繁育[17];法國科西嘉(Corsica)品系,源自科西嘉島內(nèi)半野生豬的選育[17],以及日本的阿咪尼(Oh mini)、克勞恩咪尼(Clawn mini)和會(huì)津(Huei-Jin)等[19]小型豬品系。

相關(guān)研究表明,奧薩博和尤卡坦等品系小型豬具有節(jié)儉型基因,易通過特定飲食誘發(fā)高血壓、肥胖、糖尿病和胰島素抵抗等疾病[15],同時(shí)具有繁殖性能高、性情溫順和便于操作等特點(diǎn),是主要應(yīng)用于內(nèi)分泌代謝性疾病建模的國外小型豬品系。

1.2 國內(nèi)小型豬

天然封閉群特性和高度近交育種等先天條件[20]是我國小型豬繁育的主要優(yōu)勢(shì),通過種源選育和近交繁殖可以保證豬群遺傳背景清晰和表觀性狀穩(wěn)定[21]。目前,國內(nèi)已報(bào)道的不同小型豬品系信息如表2 所示。國內(nèi)經(jīng)過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化培育的品系主要包括:王愛德等[22]對(duì)廣西巴馬地區(qū)固有香豬近交選育而獲得的廣西巴馬小型豬,貴州從江地區(qū)固有香豬經(jīng)過長期自然選擇和人為定向培育而獲得的貴州小型豬[23],陳明飛等[24]對(duì)川黔交界山區(qū)固有香豬引種和近交選育而獲得的中國農(nóng)大小型豬,海南地區(qū)固有香豬經(jīng)過種源和近交選育而獲得的五指山小型豬[25];西藏地區(qū)固有香豬經(jīng)過種源選育而獲得的西藏小型豬[26],潘偉榮等[27]對(duì)云南西雙版納地區(qū)固有香豬引種和近交選育而獲得的版納微型豬,以及甘南藏族自治州地區(qū)固有香豬經(jīng)過長期自然選擇和人為近交選育而獲得的甘肅蕨麻豬等品系[28]。國內(nèi)各品系小型豬通過實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)發(fā)病可表現(xiàn)出較為理想的疾病表征與生理藥理代謝特點(diǎn),對(duì)內(nèi)分泌代謝性疾病的建模研究具有重要意義。

2 建模方法

內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)以反饋調(diào)節(jié)為主要機(jī)制在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮生理調(diào)控作用,下丘腦-垂體-靶腺體軸和內(nèi)分泌腺-體液代謝物質(zhì)之間均存在反饋調(diào)節(jié)[29-31]。細(xì)菌和病毒感染等外在因素,以及先天遺傳和激素分泌異常等內(nèi)在因素[32-33]均可導(dǎo)致反饋調(diào)節(jié)過程紊亂,誘導(dǎo)疾病發(fā)生。通過人為干預(yù)機(jī)體正常反饋調(diào)節(jié)過程,可以構(gòu)建內(nèi)分泌代謝性疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。依據(jù)方法不同,一般分為自發(fā)型動(dòng)物模型、誘導(dǎo)型動(dòng)物模型、手術(shù)法動(dòng)物模型和基因工程動(dòng)物模型。

2.1 自發(fā)型動(dòng)物模型

在自然繁育過程中,基因組出現(xiàn)突變導(dǎo)致表型發(fā)生特定改變后,通過回交和測(cè)交等方法人為干預(yù),以選育出該表型穩(wěn)定遺傳的品系,是構(gòu)建自發(fā)型動(dòng)物模型的常用手段[34]。此種模型與人類疾病發(fā)生發(fā)展過程十分相似,被應(yīng)用于高血壓、糖尿病和肥胖癥[35]的研究中,尤其適用于多基因誘導(dǎo)致病機(jī)制探討和致病基因的篩選鑒定等方面[36]。適用于構(gòu)建自發(fā)型模型的主要有哥根廷小型豬和尤卡坦小型豬兩個(gè)品系[15],但由于飼養(yǎng)成本較高、實(shí)驗(yàn)條件苛刻,限制了此種方法的發(fā)展。

2.2 誘導(dǎo)型動(dòng)物模型

表1 國外小型豬品系信息Table 1 Information of overseas miniature swine strains

通過特定飲食飼喂或化學(xué)藥物注射,誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)病是構(gòu)建誘導(dǎo)型動(dòng)物模型的常用手段。此種模型對(duì)研究人類疾病終末器官損傷等方面具有重要意義。高脂高糖飲食誘導(dǎo)一般用于高血壓、糖尿病、肥胖癥和痛風(fēng)癥等疾病的研究,鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)或四氧嘧啶(alloxan,ALX)注射誘導(dǎo)一般用于糖尿病和高血壓等疾病的研究。相磊等[37]應(yīng)用高脂高糖飲食誘導(dǎo)成功構(gòu)建小型豬糖尿病模型后發(fā)現(xiàn),飲食誘導(dǎo)可引起小型豬脂肪堆積,內(nèi)臟脂肪堆積尤為明顯,血液生化指標(biāo)呈高脂血癥并伴有腎功能損傷。Renner 等[38]應(yīng)用高脂高糖飲食誘導(dǎo)成功構(gòu)建小型豬糖尿病模型后發(fā)現(xiàn),血清中GLP-1 濃度顯著下降,并且與血糖濃度呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05),吳延軍等[39]通過高脂高糖飼料聯(lián)合低劑量STZ 誘導(dǎo)成功構(gòu)建小型豬糖尿病模型,全部實(shí)驗(yàn)小型豬均發(fā)生二型糖尿病癥狀,包括胰島素抵抗和葡萄糖耐受損傷。戎亦驪等[40]應(yīng)用高脂高鹽飲食誘導(dǎo)成功構(gòu)建小型豬高血壓模型后發(fā)現(xiàn),飲食誘導(dǎo)8周可建立小型豬高血壓模型,其發(fā)病機(jī)制可能與影響腎功能進(jìn)而激活RAS系統(tǒng)和AVP-AQP-2 有關(guān)。陳民利等[41]采用維生素D3 和異丙腎上腺素復(fù)合高脂飲食的方法建立了小型豬慢性心肌缺血模型,并利用無創(chuàng)遙測(cè)技術(shù)對(duì)小型豬慢性心肌缺血模型的癥狀進(jìn)行檢測(cè)與評(píng)價(jià)。由于此種建模方法具有較好的可控性與操作性,被研究者廣泛應(yīng)用。

表2 國內(nèi)小型豬品系信息Table 2 Information of miniature swine strains in China

2.3 手術(shù)法動(dòng)物模型

經(jīng)由外科手術(shù)切除或改造動(dòng)物內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)器官可以導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂,是構(gòu)建手術(shù)法動(dòng)物模型的常用手段。此種模型對(duì)于研究人類疾病器質(zhì)性損傷引發(fā)的代謝異常及代謝代償過程十分重要。全部或部分胰腺切除一般用于糖尿病和肥胖癥等疾病的研究,腎手術(shù)法一般用于腎源性高血壓的研究。Jung 等[42]通過胰腺切除構(gòu)建小鼠糖尿病模型,發(fā)現(xiàn)胰腺部分切除手術(shù)能夠一定程度上誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生糖尿病,并且誘導(dǎo)胰島β 細(xì)胞的再生。趙鵬[43]通過對(duì)大鼠進(jìn)行“兩腎一夾”手術(shù)成功構(gòu)建高血壓模型,發(fā)現(xiàn)建模后12周,高血壓大鼠心肌損傷和纖維化程度明顯,而賴氨大黃酸可以緩解高血壓大鼠心肌損傷和纖維化程度。由于應(yīng)用小型豬構(gòu)建手術(shù)法模型成本相對(duì)較高,此類研究結(jié)果報(bào)道相對(duì)較少。

2.4 基因工程動(dòng)物模型

通過轉(zhuǎn)基因、基因打靶和基因編輯等基因重組技術(shù),人為地修飾、改變或干預(yù)生物固有DNA 組成,從而獲得穩(wěn)定遺傳的動(dòng)物品系,是構(gòu)建基因工程動(dòng)物模型的常用手段。此種模型對(duì)于研究人類疾病發(fā)病過程的分子機(jī)制、了解可能的致病基因和預(yù)防疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。單基因敲除、多基因敲除或線粒體突變常用于糖尿病和肥胖癥等疾病的研究,DNA 靶向修飾技術(shù)常用于高血壓的研究。Klymiuk 等[44]指出,應(yīng)用基因敲除技術(shù)構(gòu)建杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)和囊腫性纖維化(CF)模型豬,對(duì)該疾病的靶向治療和安全性評(píng)價(jià)具有重要意義。劉玉敏[45]通過CRISPR 技術(shù)對(duì)西藏小型豬靶向基因進(jìn)行編輯,發(fā)現(xiàn)GHR 雜合敲除西藏小型豬可以進(jìn)行交配繁殖,以獲得GHR 純合敲除個(gè)體。袁益琳[46]應(yīng)用CRISPR/Cas9 系統(tǒng),結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)一步成功構(gòu)建ApoE 純合敲除豬模型,為通過小型豬建模了解動(dòng)脈粥樣硬化早期病理機(jī)制打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

3 內(nèi)分泌代謝性疾病動(dòng)物模型研究趨勢(shì)

構(gòu)建適宜的內(nèi)分泌代謝性疾病動(dòng)物模型對(duì)于發(fā)現(xiàn)、驗(yàn)證和優(yōu)化治療方法,以及確保其安全用于人類是必不可少的過程。當(dāng)前階段用于構(gòu)建相關(guān)疾病模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要有嚙齒類、小型豬、大型動(dòng)物類、非人靈長類等,每一種動(dòng)物模型均有其優(yōu)勢(shì)和局限。了解各種動(dòng)物模型的優(yōu)缺點(diǎn),對(duì)疾病的機(jī)理探索、靶向治療和前期預(yù)防具有重要意義。

小型豬具有體積小、方便操作、易于飼養(yǎng)管理等優(yōu)勢(shì),其解剖學(xué)、生理機(jī)能和代謝特點(diǎn)亦與人類較為相似。雖然豬比非人靈長類動(dòng)物在遺傳上與人類相距更遠(yuǎn),但其繁殖周期更快、單胎產(chǎn)仔數(shù)更高,在多世代的動(dòng)物模型研究中更具優(yōu)勢(shì)。相對(duì)于嚙齒類動(dòng)物,豬在進(jìn)化上與人類更為接近,其基因組序列與人類具有更高的同源性,在消化吸收、營養(yǎng)代謝和內(nèi)分泌代謝等方面也與人類較為一致。因此,在研究內(nèi)分泌代謝性疾病方面,利用小型豬制作疾病模型,具有其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不可替代的優(yōu)越性。不同品系小型豬以其各自特點(diǎn)適用于不同研究目的的建模實(shí)驗(yàn)中。尤卡坦品系、哥廷根品系、阿咪尼品系和培品托品系的小型豬性情溫順,十分適合需要反復(fù)操作和密切接觸的長期研究當(dāng)中;漢福德品系和哥廷根品系的小型豬被毛為純白色,皮膚素沉積均勻,十分適合需要觀察體表變化的研究;奧薩博(Ossabaw)小型豬是代謝綜合征和2 型糖尿病的易感模型。由于疾病控制和產(chǎn)權(quán)保護(hù)等因素,國際間小型豬關(guān)聯(lián)研究很難開展。目前,我國小型豬建模亦取得重要成果,Li 等[47]通過連續(xù)6周高脂高蔗糖飲食飼喂,成功構(gòu)建巴馬小型豬代謝綜合征病理模型,并發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組小型豬出現(xiàn)高脂血癥、脂質(zhì)沉積、高胰島素,以及由炎癥因子等引發(fā)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡增多,說明長期飲食誘導(dǎo)可引起巴馬小型豬代謝綜合征和慢性腎組織損傷。陳民利[48]在報(bào)告中指出,五指山小型豬和西藏小型豬在高脂飼養(yǎng)條件下均易產(chǎn)生動(dòng)脈粥樣硬化(AS),并伴隨肥胖、高血脂、高血壓、炎癥和胰島素抵抗等多種與人類相似的臨床癥狀;但是,二者在AS 發(fā)病的病癥特點(diǎn)和易感基因方面存在諸多差異,五指山小型豬適合于外周胰島素抵抗的代謝性疾病模型研究,而西藏小型豬更適用于中心型胰島素抵抗的心血管疾病模型研究。王郭琦等[49]的研究表明,腺嘌呤和地塞米松聯(lián)用可以成功構(gòu)建貴州小型豬腎陽虛模型,建模后小型豬表現(xiàn)出畏寒喜暖、生殖減退、精神萎靡和消瘦等典型腎陽虛癥狀。魏杰等[50]在報(bào)告中指出,中國農(nóng)大小型豬具有基因純、健康敏感和抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn),在代謝性疾病動(dòng)物模型中具有重要作用。Gregory 等[51]的研究表明,通過部分結(jié)扎版納微型豬胰腺可以構(gòu)建慢性胰腺炎模型,其嚴(yán)重程度與結(jié)扎后飼喂時(shí)間呈正相關(guān)(P＜0.05)。石興勇等[14]在報(bào)告中指出,我國目前各具特色的實(shí)驗(yàn)用小型豬品系需要增加投入,利用先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)例如基因編輯和動(dòng)物克隆技術(shù),加速小型豬的定向化培育進(jìn)程。由此可見,各品系小型豬以其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì),對(duì)不同建模方法呈現(xiàn)出極具特征的病理特點(diǎn)和外在病變表象,逐漸成為人類內(nèi)分泌代謝性疾病相關(guān)研究的理想動(dòng)物模型。

4 總結(jié)與展望

構(gòu)建動(dòng)物模型是研究人類內(nèi)分泌代謝性疾病的關(guān)鍵手段,對(duì)降低該類疾病的發(fā)病率、保護(hù)人類健康具有重要意義。發(fā)達(dá)國家地區(qū)較早應(yīng)用小型豬構(gòu)建動(dòng)物模型,我國應(yīng)加強(qiáng)相關(guān)研究進(jìn)度,并充分發(fā)揮本土小型豬優(yōu)勢(shì)。通過多種方式均可以構(gòu)建內(nèi)分泌代謝性疾病動(dòng)物模型,應(yīng)依據(jù)研究方向選擇適合的建模方法,對(duì)疾病的致病途徑、代謝特點(diǎn)、遺傳易感性和治療手段等方面分別闡明。綜上所述,應(yīng)用小型豬建立內(nèi)分泌代謝性疾病動(dòng)物模型對(duì)發(fā)病機(jī)制等相關(guān)問題的深入研究至關(guān)重要。隨著建模技術(shù)和研究手段的不斷發(fā)展,未來應(yīng)加強(qiáng)在基因水平上的研究,用以全面了解相關(guān)疾病的遺傳基礎(chǔ)和可能的發(fā)病機(jī)制。