王 艷，張秋蕾，王英華，俞向前，張 強，文德亮

（1.上海海關(guān)，上海 200135；2.青島海關(guān)，山東青島 226002；3.浦東新區(qū)動物疫病預防控制中心，上海 201299）

生物制品的生產(chǎn)通常以微生物或人/動物源的細胞、組織和體液等為起始原材料，其制備過程或制劑中可能添加人或動物來源的原材料或輔料。這些起始原料、原材料或輔料潛在的病毒污染是影響產(chǎn)品安全性的關(guān)鍵因素[1]。理論上，生物制品都存在病毒污染的潛在風險，應對產(chǎn)品病毒污染進行檢測[1]。

外源病毒污染會影響疫苗的使用效果，甚至引起生物安全問題[2]。吳華偉等[3]檢測發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)豬用活疫苗副流感病毒5 型污染率約為16.7%。牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）是疫苗生產(chǎn)中常見的外源性病原之一。美國菌種保藏中心（ATCC）于1994 年調(diào)查其細胞庫，發(fā)現(xiàn)有13 株細胞污染了BVDV[4]；日本也曾有報道[5]，在5 批麻風腮及風疹疫苗中檢出了BVDV核酸。豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科，目前呈世界性流行，2010 年，葛蘭素史克和默克兩大疫苗生產(chǎn)廠商所生產(chǎn)的輪狀病毒疫苗中均檢出PCV[6]。豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）屬于細小病毒科，能持續(xù)感染哺乳動物細胞系，會對以細胞為材料的生物制品生產(chǎn)產(chǎn)生潛在危害[7]。

目前，檢測這三種病原的方法主要有RTPCR、ELISA、熒光RT-PCR，但都是多以單一病原的檢測為主。與傳統(tǒng)PCR 方法相比，熒光定量PCR 檢測技術(shù)具有靈敏度高、快速簡便等優(yōu)點。本研究擬利用熒光定量PCR 技術(shù)探索可同時檢測獸用疫苗中BVDV、PCV2 和PPV 3 種外源性病毒的方法，以主要的生物安全因子為關(guān)鍵點，建立可以快速檢測相關(guān)生物安全因子的檢測體系，可以同時檢測出3 種外源污染因子，從而為獸用疫苗的生物安全保駕護航。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

熒光定量PCR 試劑，購自大連（Takara）寶生物公司；焦碳酸二乙酯（DEPC）、感受態(tài)細胞（DH5α）以及1×TE buffer，購自上海生工生物技術(shù)有限公司；ABI7500 Fast 熒光定量PCR 儀，購自美國ABI 公司；豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）質(zhì)粒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）質(zhì)粒、偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）質(zhì)粒、非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）質(zhì)粒，均由上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心保存。

1.2 方法

1.2.1 基因序列比對和合成 參考并下載GeneBank 中登錄的BVDV、PCV2 和PPV 的基因序列（登錄號分別為U18059.1、HZ797209.1、AY583318.1）信息，送上海生工生物工程有限公司完成相應保守區(qū)域基因合成，轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細胞后，擴繁菌液并提取質(zhì)粒，以制備相應標準品。制備的3 種標準品分別命名為pUC57-BVDV、pUC57-PCV2、pUC57-PPV，3 種標準品分別用1×TE buffer 配制成50 ng/μL 儲存液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物及探針設計與合成 針對BVDV 5'-UTR、PCV2Rep以及PPVNS1基因序列，應用DNAstar 軟件設計引物及相應探針（表1）。引物和探針分別由上海翰宇生物科技有限公司和Lifetech 公司合成。

表1 實時熒光PCR 引物與探針

1.2.3 三重熒光定量PCR 方法建立

1.2.3.1 反應條件優(yōu)化和標準曲線建立 在成功建立單一檢測體系的基礎上，通過改變引物與探針的濃度以達到最佳擴增效率，獲得良好擴增曲線，進而建立三重熒光定量PCR 檢測體系。對3種標準品分別進行梯度稀釋，使每種標準品濃度為101～105copies/μL，并作為模板進行熒光定量PCR檢測，每個濃度做3 個重復。以Ct 值為y軸，標準品的稀釋度為x軸，制作標準曲線。

1.2.3.2 特異性試驗 利用本試驗建立的三重熒光定量PCR 檢測方法，對BVDV、PCV2、PPV以及實驗室保存?zhèn)溆玫腃SFV、PRRSV、PRV、ASFV 等其他相關(guān)病原質(zhì)粒進行檢測，驗證該方法的特異性。

1.2.3.3 敏感性試驗 分別將已知濃度的3 種質(zhì)粒標準品進行梯度稀釋，使每種標準品濃度分別為101～106copies/uL，利用建立的三重熒光定量PCR方法進行檢測，利用檢測閾值判斷該方法的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒濃度測定

3 種標準品質(zhì)粒的濃度和純度見表2。

表2 3 種標準品的濃度和純度

2.2 反應條件優(yōu)化及標準曲線建立

對三重熒光定量PCR 各條件進行優(yōu)化后，最終確定反應體系為：TaqMan Mixture（2×）12.5 μL，BVDV、PCV2、PPV 上下游引物各0.5 μL，BVDV、PCV2、PPV 探針各0.4 μL，模板各2.0 μL，用滅菌ddH2O 補足至25.0 μL。體系中所用引物和探針的濃度均配成10 pmol/mL。反應條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火并延伸32 s，擴增40 個循環(huán)；在退火階段收集熒光信號。

以建立的三重熒光定量PCR 方法對3 種標準品分別檢測，以質(zhì)粒標準品濃度的對數(shù)為x軸、Ct值為y軸，繪制標準曲線。結(jié)果（圖1）顯示，3種重組質(zhì)粒標準品在濃度為10～105copies/μL 時都能檢測出熒光信號，擴增曲線圓滑平整，且標準曲線均具有良好的線性關(guān)系，R2值均在0.99 以上。

圖1 3 種標準品的熒光PCR 標準曲線

2.3 特異性試驗

利用所建立的三重熒光定量PCR 體系對BVDV 等7 種病原質(zhì)粒進行檢測。結(jié)果（圖2）顯示，僅BVDV、PCV2、PPV 3 種病原質(zhì)粒標準品出現(xiàn)相應擴增曲線，而其他病原質(zhì)粒（CSFV、PRRSV、PRV、ASFV）均未出現(xiàn)擴增曲線，判為陰性，說明該檢測方法具有良好的特異性。

圖2 三重熒光定量PCR 特異性試驗結(jié)果

2.4 敏感性試驗

分別對已知濃度的3 種質(zhì)粒標準品進行檢測，利用檢測閾值判斷該方法的敏感性。結(jié)果（圖3）顯示，3 種標準品質(zhì)粒在10 copies/μL 時仍能檢測到熒光信號，表明建立的BVDV、PCV2 和PPV三重熒光定量PCR 方法具有較高的敏感性。

3 討論

圖3 三重熒光定量PCR 檢測敏感性試驗結(jié)果

雖然我國2015 年版獸藥典未收錄分子生物學檢測方法，但是PCR 方法已經(jīng)在國際貿(mào)易中廣泛使用。分子生物學方法可同時確定外源病毒的多種病原種類，并根據(jù)檢測結(jié)果，在生產(chǎn)過程中可以采取有效措施進行預防。朱曉瑋等[8]曾對2012—2017 年豬瘟疫苗生產(chǎn)過程中所涉及的原輔料、半成品和成品進行BVDV 檢測，發(fā)現(xiàn)114 批豬瘟疫苗中BVDV 陽性數(shù)為2 份，4 089 頭新生牛血清中BVDV 陽性數(shù)為115 份。近年來，多種針對BVDV、PCV 和PPV 的快速檢測方法已經(jīng)建立，但主要為單一病原檢測。錢興麗等[9]建立了人用疫苗中PCV PCR 檢測方法，其最低可檢出1.34×104copies/μL 病毒核酸；任亞初[10]利用SYBR Green I檢測方法建立了快速檢測BVDV 的實時熒光定量PCR 法，其檢測靈敏度可達4.87×101copies/μL；本試驗建立的方法對BVDV、PCV2 和PPV 3 種病原的最低檢測限均為10 copies/μL，說明該方法敏感性較好；除3 種病原外，該方法對CSFV、PRRSV、PRV、ASFV 等4 種其他相關(guān)病原均無非特異性擴增。利用本實驗建立的檢測方法對市售的豬流感H1N1 TJ 株等14 種獸用疫苗進行檢測，結(jié)果均為陰性，提示所檢測疫苗均無上述3 種外源病毒污染。此外，還需運用本方法對更多獸用疫苗開展檢測，以進一步驗證方法的可靠性。結(jié)果表明，建立的三重熒光定量PCR 檢測方法能夠?qū)VDV、PCV2、PPV 進行快速、及時、準確診斷，是控制并消滅這3 種外源性病原對生物制品感染的可靠方法，從而為生物制品外源病毒的檢測提供了技術(shù)儲備。