周葉,楊樹宇,陳俊杰,劉長忠,王自良,姜金慶

（河南科技學(xué)院動物科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

隨著全球經(jīng)濟(jì)、工業(yè)化進(jìn)程的高速發(fā)展,超自然負(fù)荷的廢棄物造成了顯著的重金屬污染.據(jù)我國生態(tài)環(huán)境部和環(huán)境保護(hù)部調(diào)查顯示,截至2017年末,水體的重金屬污染物達(dá)182.54 t,10%的耕種土地約1 000萬公頃已受污染[1-8],其中重金屬鎘難降解易遷移,在特殊的生物地球化學(xué)循環(huán)中不斷轉(zhuǎn)化,造成了“鎘大米”糧食污染事件,誘發(fā)人類“痛痛病”、免疫系統(tǒng)障礙等鎘引起的急慢性中毒性疾病,嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全[9-11].因此,如何有效防治重金屬的動態(tài)性污染,保障食品、生存環(huán)境安全等至關(guān)重要.而重金屬離子的準(zhǔn)確檢測是實現(xiàn)防控的前提,這就要求檢測技術(shù)要不斷向靈敏、快速等方向發(fā)展.

重金屬離子檢測通?；谠与娀瘜W(xué)特性、光學(xué)反應(yīng)原理,如原子吸收光譜法（AAS）,電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP）、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜質(zhì)譜儀法（ICP-MS）、原子熒光光譜法（AFS）,陽極溶出伏安法（ASV）等電化學(xué)傳感器技術(shù)[12-17].根據(jù)樣品的特點選擇這些方法可實現(xiàn)重金屬離子的高靈敏性檢測,但因其操作條件苛刻、價格昂貴,常?，F(xiàn)場檢測應(yīng)用受限.

而基于特異性抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)檢測技術(shù),如酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、膠體金標(biāo)記免疫層析測定法（GICA）等,以其可修飾、快速、操作簡便、靈敏度高的優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于毒素、藥物、重金屬等環(huán)境污染和危險物的檢測[18-20].近年來,抗鎘、汞、鉛等重金屬離子的人工抗原和抗體的制備方法不斷發(fā)展,但獲得高效特異性單抗所需時間長、難度大,限制了該技術(shù)的應(yīng)用.本研究將合成重金屬離子人工免疫抗原與異源性包被抗原,采用快速免疫法,設(shè)置不同免疫方案,篩選出穩(wěn)定高效特異性強(qiáng)的小鼠多抗血清,進(jìn)行多抗的效價、敏感性、特異性分析.為鎘離子免疫學(xué)快速檢測方法的建立和檢測產(chǎn)品的開發(fā)打下基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

二氯化鎘（CdCl2）,Alfa Aesar產(chǎn)品；異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸（ITCBE）、乙二胺四乙酸（EDTA）,DOJINDO產(chǎn)品；牛血清白蛋白（BSA）,Pierce產(chǎn)品；雞卵清蛋白（OVA）,Solarbio產(chǎn)品；弗氏完全佐劑（FCA）、弗氏不完全佐劑（FIA）,均為Sigma產(chǎn)品；HRP-山羊抗小鼠IgG,中杉金橋產(chǎn)品；SPF級Balb/C小鼠,鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心供.

DU800紫外分光光度計,美國貝克曼公司；Optima2100DV型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP）,美國PE公司；MK3多功能全自動酶標(biāo)儀,美國Thermo公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 人工抗原的制備與鑒定 參考張海棠等[21]的方法,將ITCBE上多齒配體端與Cd2+離子螯合,活性基團(tuán)端與載體蛋白成肽,具體操作為：稱取5 mg ITCBE溶于DMSO制備金屬螯合劑溶液,稱取等物質(zhì)的量CdCl2,溶于HEPES緩沖液形成Cd2+溶液,調(diào)節(jié)pH值至7.0,兩液混合反應(yīng)制備Cd-ITCBE半抗原；稱取一定量BSA溶于HEPES制備載體蛋白溶液,將上述半抗原加入到蛋白中,室溫穩(wěn)定反應(yīng)24 h,制備Cd-ITCBE-BSA.Cd-EDTA-OVA制備方法同上,Cd-EDTA標(biāo)準(zhǔn)阻斷液制備方法同Cd-ITCBE半抗原.

配制BSA、OVA標(biāo)準(zhǔn)液,采用Bradford法,檢測上述人工抗原的蛋白濃度,然后以PBS將其稀釋至質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL,用紫外分光光度儀檢測樣品在200～800 nm下的吸收曲線,對比各曲線波動走勢,分析人工抗原的偶聯(lián)特性.將樣品作適度稀釋,用ICP-MS檢測儀上機(jī)檢測Cd-ITCBE-BSA、Cd-ITCBE-OVA中Cd2+的含量.

1.2.2 小鼠免疫 將Cd-ITCBE-BSA與佐劑按照1∶1充分乳化,采用快速免疫法免疫三組Balb/C小鼠[22],每組 5 只,編號 H1～H5,M1～M5,L1～L5.首次免疫選用 FCA 乳化,免疫蛋白量分別為 60 μg/只、30 μg/只、10 μg/只.背部皮下接種,加強(qiáng)免疫時用FIA乳化,間隔時間均為3周.第4次免疫10 d后斷尾采血,采用質(zhì)量濃度為2 μg/mL的Cd-ITCBE-OVA包板,初步鑒定抗血清效價與敏感性.

1.2.3 小鼠多克隆抗體的制備 將五只免疫小鼠斷頭取全血,37℃自然凝血析出血清,之后進(jìn)行1500 r/min離心取上清,小劑量分裝后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%疊氮鈉防止細(xì)菌污染,于-20℃長期存放.

1.2.4 多克隆抗體特性鑒定 效價測定：將純化后的多抗腹水稀釋,采用棋盤滴定法確定包被原最佳包被濃度,間接ELISA測定抗體效價,確定P/N≥2.1的抗體稀釋倍數(shù)即為效價,確定吸光值OD450接近1.0的抗體稀釋倍數(shù)為最佳反應(yīng)濃度.抗體亞類鑒定采用間接ELISA法,具體操作依照產(chǎn)品說明書.

敏感性檢測：在最佳優(yōu)化試驗條件下,采用間接競爭ELISA法,首先將不同濃度的Cd-EDTA標(biāo)準(zhǔn)阻斷液與抗體在一次性離心管中混合反應(yīng),然后移液至Cd-ITCBE-OVA包被的酶標(biāo)板上,37℃反應(yīng)10 min后洗板三次.根據(jù)酶標(biāo)二抗的定性定量顯色結(jié)果,繪制吸光值與標(biāo)準(zhǔn)阻斷液濃度常用對數(shù)值的曲線,回歸分析計算抗體的IC50值.

特異性檢測：用 Hg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cr3+、Mo6+、Fe3+、Co2+離子分別與 EDTA 螯合制備半抗原,采用icELISA法測定不同離子的IC50值,計算交叉反應(yīng)率CR=IC50（Cd-EDTA）/IC50（其他）.

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原的鑒定

Bradford法檢測出Cd-ITCBE-BSA與Cd-EDTA-OVA的蛋白質(zhì)量濃度分別為8mg/mL和6.45 mg/mL.紫外掃描圖如圖1所示.

圖1 Cd2+人工抗原紫外掃描圖Fig.1 UV scanning of Cd2+artificial antigen

由圖1可知,合成的Cd-ITCBE-BSA最大特征吸收波長較BSA發(fā)生藍(lán)移,說明載體蛋白上原有基團(tuán)發(fā)生變化,人工抗原偶聯(lián)成功.

通過ICP-MS法檢測Cd-ITCBE-BSA與Cd-EDTA-OVA中的鎘元素含量如表1.

表1 鎘含量ICP-MS檢測結(jié)果Tab.1 Detection results of cadmium content by ICP-MS

2.2 小鼠免疫

間接ELISA測定生長狀態(tài)良好的四組免疫小鼠血清效價,三組小鼠抗Cd2+血清效價均達(dá)到了10-3～10-4,Cd-ITCBE-BSA有效刺激小鼠產(chǎn)生了抗體.每隔3 d測定一次抗血清效價,共測檢測3次,結(jié)果表明中、低劑量免疫組小鼠抗血清效價數(shù)據(jù)變動較小.對抗血清進(jìn)行icELISA試驗鑒定其對Cd-EDTA的敏感性,半抗原與高、中劑量組小鼠血清反應(yīng)均呈現(xiàn)明顯的線性阻斷,其中M-3號小鼠敏感性最強(qiáng),經(jīng)計算其抗血清IC50質(zhì)量濃度為370.82 μg/L；低劑量組小鼠血清icELISA檢測結(jié)果線性關(guān)系不明顯.因此,選擇中劑量免疫組小鼠進(jìn)行下面的研究.

2.3 小鼠多克隆抗體的制備與鑒定

2.3.1 多克隆抗體血清的分離 收集小鼠全血于離心管中,傾斜放置,自然析出淡黃色上清,每只小鼠平均可收集0.5 mL,將抗體血清小劑量分裝保存.

2.3.2 多克隆抗體效價測定 間接ELISA檢測小鼠多克隆抗體,抗體效價在1.28×10-4～5.12×10-4.結(jié)果見表2.M1、M2、M3號小鼠抗體效價相對較高.

表2 Cd-ITCBE-BSA免疫小鼠多抗血清效價Tab.2 Titer of polyclonal antibody in mice immunized with Cd-ITCBE-BSA

2.3.3 多克隆抗體敏感性分析 采用icELISA法,對M1、M2、M3號小鼠抗體進(jìn)行敏感性檢測,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示.

圖2 間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of indirect competitive ELISA

抗體的 IC50質(zhì)量濃度在 368.70～639.06 μg/L,最低檢測限 IC20質(zhì)量濃度在 25.53～38.09 μg/L,其中 M3號小鼠抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程為y=0.1123x-0.1638（R2=0.9912）,計算IC50質(zhì)量濃度為368.70 μg/L,檢測限質(zhì)量濃度為25.53 μg/L.根據(jù)GB 2762-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》谷物、果蔬、肉蛋、水產(chǎn)動物中的鎘限量質(zhì)量濃度為50～500 μg/L,該多抗能夠滿足對重金屬鎘的定量殘留檢測.

2.3.4 多克隆抗體特異性分析 經(jīng)檢測分析,M3 小鼠抗體與 Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cr3+、Mo6+、Fe3+、Co2+離子半抗原螯合物交叉反應(yīng)率較低,檢測結(jié)果如表3所示.

表3 多抗血清與其他金屬螯合物的交叉反應(yīng)Tab.3 The cross reaction between polyantibody serum and other metal chelates

由表3可以看出，抗鎘離子多抗僅與Hg-EDTA有明顯的反應(yīng),經(jīng)計算交叉反應(yīng)率最高為72.58%.

3 結(jié)論與討論

3.1 雙功能螯合劑的選擇

重金屬離子相比其他小分子抗原,不具有可利用基團(tuán),不能直接與載體蛋白偶聯(lián)刺激動物體產(chǎn)生免疫反應(yīng),需要借助雙功能螯合劑,因此所產(chǎn)生的多抗不僅能夠識別離子螯合劑半抗原、還能識別螯合劑連接橋、以及載體上部分抗原表位,產(chǎn)生橋抗、載體抗體干擾試驗.在制備免疫原與包被原的過程中,為提高檢測靈敏度,應(yīng)考慮到橋抗、載體抗體的影響,選用不同螯合劑.張云顯[23]等以DTPA與EDTA分別作為免疫原與包被原制備的偶聯(lián)劑,實現(xiàn)了多抗的制備與鑒定.試驗采用經(jīng)典雙功能螯合劑ITCBE合成免疫原,其既能有效結(jié)合金屬離子又能與載體蛋白偶聯(lián)發(fā)揮免疫效應(yīng),具有操作簡單、反應(yīng)體系溫和、產(chǎn)物穩(wěn)定的特點.包被抗原則以EDTA作為偶聯(lián)橋,在保留抗體識別Cd-EDTA位點的同時避免了抗原上其他抗原決定簇的干擾,以異源性檢測的方式提高了檢測的靈敏度和可信度.

3.2 重金屬離子抗體的制備

實現(xiàn)免疫檢測的前提是制備靈敏、特異的抗體.1985年,Reardan等[24]成功制備了金屬In3+螯合物的抗體,為重金屬離子免疫學(xué)檢測開拓了方向,目前關(guān)于Hg2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+等重金屬離子螯合物特異性抗體的制備也有報道[25-28],但重金屬離子免疫學(xué)檢測技術(shù)的應(yīng)用并不普遍.抗重金屬離子單克隆抗體、單鏈抗體、納米抗體等制備周期長、難度大、成本高,無法為實際檢測提供穩(wěn)定試劑支撐.因此,制備高效價的多克隆特異性抗體對此意義重大.唐佳佳等[23]將抗鎘細(xì)胞株B8,接種于Cd-ITCBE-BSA免疫的Balb/C小鼠,獲得了效價達(dá)到1∶640 00的腹水多抗,吳峰等[30]將NS1瘤細(xì)胞以腹腔注射的方式,刺激汞、鎘人工抗原免疫的小鼠,成功制備出腹水多抗,但這些方法亦需要細(xì)胞儲備.試驗在成功制備人工抗原的基礎(chǔ)上,篩選出了不同免疫方案下,高效價、敏感高、穩(wěn)定性好的小鼠多抗血清.該抗體的制備周期短,穩(wěn)定性高,實用性強(qiáng),可接種大鼠、兔子等試驗動物,獲得足量抗體,能為鎘離子ELISA檢測試劑盒、膠體金試紙條的開發(fā)提供抗體支持.

3.3 抗體特異性分析

重金屬離子作為帶電離子,本身不能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫原性,當(dāng)同價重金屬離子與相同螯合劑成鍵,重金屬離子的抗原特征可能暴露不明顯,如Jones等[31]研究證明Hg-EDTA和Cd-EDTA三維結(jié)構(gòu)高度相似,抗原特性差異不明顯.這就造成了抗體識別原子半徑相似所帶電荷相同的重金屬離子時出現(xiàn)交叉反應(yīng),是重金屬免疫學(xué)檢測的一個干擾,需要我們在檢測方法上進(jìn)行優(yōu)化,如進(jìn)行鎘離子的特異性富集,或干擾離子的沉淀去除,提高檢測結(jié)果的可靠性.此外,Peiwu Li[32]研究表明免疫原劑量對抗體特異性譜具有影響,免疫劑量大更有利于形成廣譜的特異性抗體,尤其是采用通用半抗原.本研究根據(jù)目前文獻(xiàn)研究,設(shè)置了中、高、低劑量免疫方案,旨在挑選出特異性最佳的多抗血清,為后續(xù)研究提供可靠抗體支持.