李 瑩，史浩辰，劉 強(qiáng)，鄭曉英，鄭嘉雄，項(xiàng) 瑋，曲吉祥

(1.徐州工程學(xué)院環(huán)境工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018；2.淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河海大學(xué)，江蘇 南京 210098； 3.河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210098；4.陸軍工程大學(xué)，江蘇 徐州 221000)

膜生物反應(yīng)器(membrane bio-reactor,MBR)因具有低成本、處理效果顯著等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于污水處理中[1]。很多學(xué)者對MBR的運(yùn)行效果、反應(yīng)器內(nèi)部的微生物群落結(jié)構(gòu)及功能菌開展了研究[2-3]，發(fā)現(xiàn)整個系統(tǒng)中存在著豐富的亞硝化菌、硝化菌和反硝化菌，微生物類群在好氧段中與硝化過程中非常豐富，而在缺氧段與反硝化相關(guān)的微生物較多。

將懸浮填料與MBR有機(jī)結(jié)合的復(fù)合式膜生物反應(yīng)器(hybrid membrane bioreactors,HMBR)工藝，除了具有活性污泥和MBR的優(yōu)點(diǎn)外，還能提高各種污染物的去除效果[4]。關(guān)于HMBR的研究大多著眼于其污水處理效果[5-6]，而對于HMBR工藝反應(yīng)器內(nèi)不同作用單元(微濾膜、懸浮填料、活性污泥混合液)中微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)差異，以及從微生物功能角度解析污染物脫氮機(jī)理的研究較少[7]。因此本文以脫氮菌為分析對象，通過分析比較HMBR裝置內(nèi)不同位置所含活性污泥內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)，以期為脫氮機(jī)理的研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置

HMBR系統(tǒng)見圖1，該反應(yīng)器為有機(jī)玻璃材質(zhì)，有效容積為1.0 m3。反應(yīng)器中填料投加百分比為50%，反應(yīng)器中污泥取自某污水廠二沉池的回流污泥。該系統(tǒng)膜組件由PVDF材料制成，膜孔徑為0.2 μm，膜面積為1.0m2，膜通量為10.0 L/(m2·h-1)，采取間歇交替運(yùn)行的方式，每運(yùn)行4 min暫停2 min。試驗(yàn)過程中控制該反應(yīng)裝置內(nèi)部環(huán)境的pH值為7.5左右，DO控制在4.0 mg/L，溫度為20℃。根據(jù)之前的研究結(jié)論[8]，反應(yīng)器的最佳運(yùn)行工況水力停留時間(HRT)為10 h，污泥停留時間(SRT)為30 d。

圖1 復(fù)合式膜生物反應(yīng)器裝置構(gòu)造示意

1.2 試驗(yàn)用水

表1 原水水質(zhì)指標(biāo)

1.3 檢測項(xiàng)目及方法

1.3.1常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)測定方法

常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)測定方法見表2。

表2 常規(guī)檢測項(xiàng)目及其檢測方法

1.3.2高通量測序

將黏附在膜絲(C1)和懸浮填料(C2)表面的生物質(zhì)用塑料刀片小心地刮下，從反應(yīng)器底部剩余污泥排放口收集活性污泥樣本(C3)，穩(wěn)定運(yùn)行2個周期，運(yùn)行結(jié)束時共收集到6個樣本，即C1-1、C1-2、C2-1、C2-2、C3-1和C3-2。送檢前將所有樣本保存在-20℃冰箱的無菌離心管中，送檢時將所有樣本置于含有足夠干冰的保溫箱中運(yùn)送到微基生物科技(上海)有限公司(中國上海)，進(jìn)行DNA提取和高通量測序。

采用二次擴(kuò)增的方法提高目標(biāo)DNA的純度，PCR擴(kuò)增體系的參數(shù)見表3。第一次PCR擴(kuò)增條件為94°C下預(yù)變性2 min；94°C下變性30 s，56°C下退火30 s，72°C下延伸30 s，總共23個擴(kuò)增循環(huán)；最后72°C下延伸5 min，10°C保存。第二次PCR擴(kuò)增條件為94°C下預(yù)變性2 min；94°C下變性30 s，56°C下退火30 s，72°C下延伸30 s，總共8個擴(kuò)增循環(huán)；最后72°C下延伸5 min，10°C保存。根據(jù)試驗(yàn)需求，設(shè)計(jì)引物如下。

F內(nèi)側(cè)引物：5′-TTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-barcodeF1特異引物-3′；

F外側(cè)引物：5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-TCTTTCCCTACACGACGCTC-3′；

R內(nèi)側(cè)引物：5′-GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA- barcodeR1特異引物-3′；

在小組合作過程中，為了更大地發(fā)揮同學(xué)之間的合作效能，可采用下列競爭方法，如：表揚(yáng)激勵法、小組得分制、評選最佳組員等，可采用激勵性語言，并把小組合作成果具體量化，進(jìn)行評比、給予公布。

R外側(cè)引物：5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT- barcodeR2 -GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)處理效果分析

試驗(yàn)中HMBR系統(tǒng)處理后出水的理化指標(biāo)見表4。按照GB 8978—1996《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》、GB 18918—2002《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》，出水滿足污水綜合排放的二級標(biāo)準(zhǔn)。該工況下HMBR對于COD和NH3-N的平均去除率分別高達(dá)94.2%、98.0%，對于TP和TN平均去除率分別達(dá)到了76.3%、40.6%左右。而傳統(tǒng)MBR系統(tǒng)處理COD、NH3-N、TN和TP的最高去除率分別是90%、98%、50%、63%[9]，與傳統(tǒng)MBR系統(tǒng)相比，HMBR系統(tǒng)在較難處理的TN和TP上平均去除率分別提高了52.60%、55.17%。這可能歸因于本系統(tǒng)中生物膜內(nèi)層形成的厭氧微環(huán)境使得反應(yīng)器內(nèi)部具有更多元化的環(huán)境，有利于各種類型微生物的代謝，特別是具有脫碳脫氮除磷功能的微生物，因此生物膜內(nèi)層可以進(jìn)行反硝化反應(yīng)，故而脫氮效果較傳統(tǒng)活性污泥工藝有明顯提高。為了從生物學(xué)角度揭示HMBR去除污染機(jī)理，下面將從群落結(jié)構(gòu)和功能菌的角度進(jìn)行探討。

表4 HMBR工藝運(yùn)行效果

2.2 微生物群落多樣性分析

2.2.1各樣本 Alpha 多樣性分析

圖2所示，6個樣本的稀釋性曲線皆趨于平緩，可見樣品的測序數(shù)據(jù)量趨于飽和，即樣本的測序深度已經(jīng)能夠較為精準(zhǔn)地反映出樣品中OTU的豐富程度。根據(jù)圖3中的Chao指數(shù)曲線和Ace指數(shù)曲線可見C3組的OTU總數(shù)最大，C2組次之，C3最小，而根據(jù)Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可知三組的物種豐富度呈現(xiàn)出C2組>C3組>C1組。

圖2 稀釋性曲線

a) Simpson圖3 Alpha多樣性指數(shù)

b) Shannon指數(shù)曲線

c) Ace

d) Chao續(xù)圖3 Alpha多樣性指數(shù)

2.2.2樣本間Venn分析

Venn(花瓣)圖可用于統(tǒng)計(jì)多個樣品中所共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目，可以比較直觀地表現(xiàn)環(huán)境樣品的OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況。將C1、C2、C3 3個組別中的平行樣取平均值統(tǒng)計(jì)后得圖4、表5。3個組別中共有的OTU數(shù)目為1 034個，其中3個組別獨(dú)有的OTU數(shù)目分別為122個(C1)，235個(C2)以及252個(C3)，兩兩樣本之間分別有44個(C1∩C2)、439個(C2∩C3)和173個OTU(C1∩C3)。由此可見，C2、C3組的樣品微生物組成結(jié)構(gòu)上更為接近。

圖4 C組Venn花瓣

表5 各組別OTU共有數(shù)目交集

2.2.3基于OTU的Beta 多樣性分析

通過對3組樣品的聚類分析以及差異性分析，圖5所示，3個組別因位置的區(qū)別在微生物進(jìn)化方面存在明顯差異，而C1與C3在門水平下進(jìn)化相似度較高。通過分析統(tǒng)計(jì)出相對豐度大于1%的菌屬，作為3組樣品中的優(yōu)勢菌屬。其中，C1組別樣品中的優(yōu)勢菌屬依次為：變形菌門(Proteobacteria，68.7%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，16.6%)、厚壁菌門(Firmicute，6.7%)和酸桿菌門(Actinobacteria，4.2%)；C2組別樣品中的優(yōu)勢菌屬依次為：變形菌門(Proteobacteria，54.4%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，18.0%)、浮霉菌門(Planctomycetes，8.4%)和厚壁菌門(Firmicute，7.6%)，綠彎菌門(Chloroflexi，3.2%)和藍(lán)藻細(xì)菌門(Cyanobacteria，2.0%)， 酸桿菌門(Actinobacteria，1.9%)；C3組別樣品中的優(yōu)勢菌屬依次為：變形菌門(Proteobacteria，63.4%)、厚壁菌門(Firmicute，12.1%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，7.7%)、酸桿菌門(Actinobacteria，5.6%)、浮霉菌門(Planctomycetes，3.7%)、綠彎菌門(Chloroflexi，2.9%)、藍(lán)藻細(xì)菌門(Cyanobacteria，1.1%)。

由圖5可知，Proteobacteria(變形菌門)是膜絲污泥、活性污泥和和懸浮填料中的絕對優(yōu)勢菌群[10-11]。Proteobacteria為革蘭氏陰性菌，大部分Proteobacteria能夠以有機(jī)物作為碳源，代謝類型多種多樣，是典型的兼性異養(yǎng)菌，污水中的COD大部分由此類微生物降解[12]。由分析結(jié)果還可以得知在此HMBR工藝中，脫碳菌主要存在于膜絲表面和懸浮填料表面。相較于Proteobacteria(變形菌門)而言，Bacteroidetes(擬桿菌門)在系統(tǒng)中相對豐度較小，但仍然是優(yōu)勢菌種，特別是在C1、C2中(相對豐度分別為16.6%、18.2%)。Bacteroidetes(擬桿菌門)是化能異養(yǎng)菌，能夠降解纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)、脂類等大分子有機(jī)物[13]。

圖5 門水平樣品聚類樹與柱狀圖組合分析

表6 HMBR(膜生物反應(yīng)器)系統(tǒng)中硝化作用微生物分類統(tǒng)計(jì)

懸浮填料的投加增加了Proteobacteria(變形菌門)和Bacteroidetes(擬桿菌門)的數(shù)量，與傳統(tǒng)的MBR相比能夠提高污染物的去除率。

2.3 脫氮菌分析

此HMBR系統(tǒng)檢測到的兩大AOB優(yōu)勢菌群，分別是Nitrosomonas(亞硝化單胞菌，50.9%)和未培養(yǎng)菌(49.1%)；在NOB克隆文庫中檢測到傳統(tǒng)的硝化菌屬——Nitrospira(硝化螺菌屬)，而沒有檢測到另一個傳統(tǒng)的硝化菌屬——Nitrosococcus(硝化桿菌屬)。進(jìn)一步分析AOB和NOB在本反應(yīng)器內(nèi)分布的位置可知，AOB和NOB主要存在于懸浮填料表面，這是因?yàn)檫@兩類微生物的世代時間較長，而膜生物反應(yīng)器中懸浮填料上的微生物生長在固定的載體上，其SRT和HRT可分別控制，因此有利于亞硝酸菌和硝酸菌的生長。通過分析Nitrosomonas和Nitrospira在不同污泥樣品中的相對豐度可知，硝化作用主要在活性污泥混合液和懸浮填料上進(jìn)行，因此可以推斷HMBR中懸浮填料的投加能夠促進(jìn)硝化作用。

生物脫氮的最后一個環(huán)節(jié)是反硝化，傳統(tǒng)的反硝化過程是由反硝化菌在缺氧或厭氧環(huán)境下將硝酸氮和亞硝酸氮還原成N2，能夠進(jìn)行這類反應(yīng)的細(xì)菌主要有Proteus(變形桿菌屬)、Micrococcus(微球菌屬)、Bacillus(芽胞桿菌屬)、Alcaligenes(產(chǎn)堿桿菌屬)、Flavobacterium(黃桿菌屬)等兼性細(xì)菌，在本HMBR系統(tǒng)中檢測到的有Micrococcus、Pseudomonas、Bacillus、Alcaligenes和Flavobacterium，其中Flavobacterium的相對豐度較高。除了厭氧反硝化菌外，在本系統(tǒng)的混合液和膜絲表面還檢測到好氧反硝化菌屬，比如從屬于β-Proteobacteria的Comamonas(叢毛單胞菌屬)和Pseudomonas(假單胞菌屬)，說明此反應(yīng)器內(nèi)存在同步硝化反硝化過程。

3 結(jié)論

本文研究了HMBR的污染物去除效果，從微生物學(xué)角度比較分析了HMBR內(nèi)部各單元的群落結(jié)構(gòu)差異，并探討了功能微生物脫氮菌在HMBR內(nèi)的分布特點(diǎn)及原因，得到以下結(jié)論。

a) 本試驗(yàn)測序數(shù)據(jù)量合理，可以反映樣品中的真實(shí)情況；各樣本差異明顯，膜絲和混合液中的微生物在門水平下發(fā)育關(guān)系更為接近；HMBR系統(tǒng)中的絕對優(yōu)勢種群為變形菌門(Proteobacteria)，占克隆子總數(shù)的62.18%，其次是擬桿菌門(Bacteroidetes)，優(yōu)勢菌群與常規(guī)活性污泥系統(tǒng)、脫氮系統(tǒng)、除磷系統(tǒng)的優(yōu)勢菌群類似。

b) HMBR中含有豐富的脫氮菌，亞硝化和硝化過程主要由懸浮填料表面的AOB和NOB完成，反硝化反應(yīng)主要發(fā)生在混合液和膜絲表面，這些微生物相互協(xié)作，共同完成整個系統(tǒng)的脫氮過程。

c) 懸浮填料的投加促進(jìn)了厭氧環(huán)境的形成，多種代謝類型的微生物的大量存在表明系統(tǒng)內(nèi)同時存在好氧反硝化、異養(yǎng)硝化和同步硝化反硝化等多種脫氮途徑，從而提高了脫氮效率。