張祖蕓，李 震，吳志豪，黃 強，曾志將*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學 蜜蜂研究所，江西 南昌 330045；2.紅河學院 生命科學與技術(shù)學院，云南 蒙自 661100）

【研究意義】蜜蜂是一種重要的經(jīng)濟性社會昆蟲，為人類提供蜂蜜、蜂王漿、蜂花粉等蜂產(chǎn)品。而且也是一種重要的傳粉昆蟲，為許多蟲媒植物授粉，對農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)平衡與植物多樣性具有重要貢獻[1]。隨著蜜蜂基因組測序工作的完成，蜜蜂基因功能、轉(zhuǎn)基因技術(shù)和調(diào)控機制的研究將成為新的熱點[1-2]，人們進行有關(guān)農(nóng)藥誘導的蜜蜂基因功能和調(diào)控機制的研究意義深遠。【前人研究進展】Aufauvre 等[3]發(fā)現(xiàn)蜜蜂體內(nèi)編碼羧酸酯酶、細胞色素P450 和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的基因被認為主要負責殺蟲劑代謝；通過轉(zhuǎn)錄組分析蜜蜂對微孢子和殺蟲劑應答反應，免疫相關(guān)基因顯著下調(diào)，并影響屏障防御和海藻糖代謝的顯著改變。Wu等[4]在蜜蜂幼蟲期暴露于亞致死劑量吡蟲啉蔗糖溶液，羽化出房后蜜蜂進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，得出免疫相關(guān)基因和王漿蛋白相關(guān)基因顯著下調(diào)，而且解毒基因和感官相關(guān)基因特異表達；此外，多巴胺轉(zhuǎn)運體編碼基因和谷氨酸受體編碼基因顯著下調(diào)，而γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）神經(jīng)遞質(zhì)編碼基因顯著上調(diào)，這些轉(zhuǎn)運體和受體基因可能擾亂蜜蜂的神經(jīng)系統(tǒng)，進而影響學習記憶能力，損害蜜蜂的大腦功能。李志國等[5]通過蜜蜂腦部轉(zhuǎn)錄組分析亞致死劑量吡蟲啉對嗅覺學習記憶的影響，表明吡蟲啉誘導的氧化應激可能導致蜜蜂大腦氧化還原失衡，參與光傳導的基因顯著下調(diào)，擾亂蜜蜂大腦鈣離子平衡和長期記憶和嗅覺敏感性，同時參與免疫應答，解毒和化學感應的基因顯著下調(diào)，進而降低蜜蜂的學習記憶能力。

【本研究切入點】可變剪切（alternative splicing，AS）是真核生物基因表達的一種常見現(xiàn)象，基因轉(zhuǎn)錄成前體mRNA（pre-mRNA）后，可通過不同的剪接方式產(chǎn)生不同的mRNA 剪接異構(gòu)體，這些不同的mRNA 可能被翻譯成不同的蛋白質(zhì)。因此，一個基因可能編碼多個蛋白質(zhì)，可變剪切是調(diào)節(jié)基因表達和產(chǎn)生蛋白質(zhì)多樣性的重要機制[6]。此外，可變剪切可能是造成物種之間、器官之間、生理與病理之間差異的更重要因素，如表現(xiàn)在剪切調(diào)控的物種、組織和發(fā)育特異性方面[7-9]。目前許多研究表明西方蜜蜂體內(nèi)存在大量可變剪切[10-11]，而且可變剪切在海角蜂（A.mellifera capensis）的群居社會可塑性的控制上起重要作用[10]。石元元等[12]研究發(fā)現(xiàn)，蜂王漿對雌性蜜蜂發(fā)育與基因可變剪切密切相關(guān)，參與生長發(fā)育，物質(zhì)代謝的基因都發(fā)生了可變剪切。蜜蜂的免疫系統(tǒng)包括細胞免疫和體液免疫。郭睿等[13]研究發(fā)現(xiàn)，許多AS 基因全方位參與宿主響應球囊菌脅迫的免疫應答。這些共有AS 基因富集在多個細胞免疫通路，如黑化作用，泛素介導的蛋白水解、內(nèi)吞作用、溶酶體、吞噬作用和細胞凋亡等多個體液免疫通路和信號通路。【擬解決的關(guān)鍵問題】前人不僅做了大量有關(guān)殺蟲劑對蜜蜂生長發(fā)育、繁殖力和生理免疫能力影響方面的研究，還做了殺蟲劑對蜜蜂采集行為和學習行為的影響研究。本課題組前期已進行了殺蟲劑對蜜蜂舞蹈行為及內(nèi)在分子機理的研究，通過采食添加殺蟲劑糖水后，舞蹈蜜蜂大腦轉(zhuǎn)錄組水平存在差異。本研究結(jié)合前期行為學試驗和跳舞蜜蜂轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，進一步對2 種殺蟲劑誘導的舞蹈蜜蜂的可變剪切基因進行深入分析，旨在揭示可變剪切基因在蜜蜂應對殺蟲劑過程中的作用，為可變剪切基因功能研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源

本研究前期先進行蜜蜂舞蹈行為學試驗，分別用24μg/kg吡蟲啉蔗糖溶液，235μg/kg溴氰菊酯蔗糖溶液和50%蔗糖溶液（對照組）各飼喂3 群采集蜂，并在距蜂箱不同距離（300，500，1 000 m）的3 個試驗地點進行相關(guān)的行為學試驗，然后將27個跳舞蜜蜂腦部樣本（25個蜜蜂大腦）送檢。通過本課題組獲得的跳舞蜜蜂腦部轉(zhuǎn)錄組全部數(shù)據(jù)，本研究基于上述轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對跳舞蜜蜂腦部的AS基因進行分析。

1.2 可變剪切分析

以每個進行差異可變剪切分析的比較組為單位，先統(tǒng)計發(fā)生的可變剪切事件的種類及數(shù)量，再分別計算每類可變剪切事件表達量，最后對每類可變剪切事件進行差異分析。使用跨越內(nèi)含子的reads來鑒定2個外顯子的邊界，從而判定junction的位置，tophat比對結(jié)果中包含了所有剪切位點信息，rMATS軟件可以將AS事件分成5類，并且可以對有生物學重復的樣品進行差異AS分析。5類可變剪切事件分別是外顯子跳躍（skipped exon，SE），可變5'端剪切（alternative 5' splice site，A5SS），可變3'端剪切（alternative 3' splice site，A3SS），外顯子選擇性跳躍（mutually exclusive exon，MXE）和內(nèi)含子保留（retained intron，RI）。

1.3 共有與特有AS 基因的KEGG pathway富集分析

KEGG pathway 顯著性富集分析以KEGG pathway 為單位，應用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，在共有及特有AS基因中顯著性富集的pathway。

2 結(jié)果與分析

2.1 吡蟲啉誘導舞蹈蜜蜂腦部AS基因類型及數(shù)量

由表1 可知，吡蟲啉處理組檢測出5 種可變剪切：外顯子跳躍（SE），可變5'端剪切（A5SS），可變3'端剪切（A3SS），外顯子選擇性跳躍（MXE），內(nèi)含子保留（RI）等。SE是主要的可變剪切類型，檢測到各組之間事件數(shù)目占總事件數(shù)達60%以上。而SE類型的差異事件數(shù)占差異AS事件總數(shù)的50%以上。在300，500，1 000 m 發(fā)生5 種可變剪接的事件總數(shù)之間存在顯著差異（χ2=88.872，df=8，P＜0.001），而發(fā)生5 種可變剪接的差異事件數(shù)目之間不存在顯著差異（χ2=13.705，df=8，P=0.09）。

表1 吡蟲啉處理組間差異AS分類和數(shù)量統(tǒng)計Tab.1 AS classification and quantity statistics between imidacloprid treatment group and control group

由圖1 可知，各種類型可變剪切在3 個距離組間的基因數(shù)目，其中SE 類型的基因數(shù)依次分別為2 567，3 237 和3 395；A3SS 類型的基因數(shù)分別為935，1 047 和1 049；A5SS 類型的基因數(shù)分別為704，786和781；MXE 類型的基因數(shù)分別為332，518 和561；RI 類型的基因數(shù)分別為311，388 和380。在300，500，1 000 m發(fā)生5種可變剪接的基因數(shù)目之間存在顯著差異（χ2=36.501，df=8，P＜0.001）。

圖1 吡蟲啉處理組間可變剪切基因數(shù)Fig.1 Number of AS genes between imidacloprid treatment group and control group

2.2 吡蟲啉誘導舞蹈蜜蜂腦部AS基因KEGG pathway富集分析

根據(jù)這些發(fā)生可變剪切的基因做了KEGG 富集分析，這些顯著富集的通路可以影響機體的新陳代謝、細胞修復、氨基酸代謝和信號傳導等生物學活動，與重要的信號通路（wnt signaling pathway，MAPK signaling pathway-fly，phototransduction-fly，hippo signaling pathway-fly，neuroactive ligand-receptor interac?tion）和免疫應答通路（ubiquitin mediated proteolysis，endocytosis，lysosome）密切相關(guān)（表2）。

2.3 溴氰菊酯誘導舞蹈蜜蜂腦部AS基因類型及數(shù)量

由表3 可知，本試驗中檢測出5 種可變剪切：外顯子跳躍（SE），可變5'端剪切（A5SS），可變3'端剪切（A3SS），外顯子選擇性跳躍（MXE），內(nèi)含子保留（RI）等。SE是主要的可變剪切類型，檢測到各組之間事件數(shù)目占總事件數(shù)達60%以上。而SE類型的差異事件數(shù)占差異AS事件總數(shù)的55%以上。在300，500，1 000 m發(fā)生5種可變剪接的事件總數(shù)之間存在顯著差異（χ2=101.225，df=8，P＜0.001），且發(fā)生5種可變剪接的差異事件數(shù)目之間存在顯著差異（χ2=23.844，df=8，P=0.002）。由圖2 可知，各種類型可變剪切在3 個距離組間的基因數(shù)目，其中SE 類型的基因數(shù)依次分別為2 590，3 221 和3 438；A3SS 類型的基因數(shù)分別為945，1 037 和1 053；A5SS 類型的基因數(shù)分別為711，788和791；MXE 類型的基因數(shù)分別為344，531 和558；RI 類型的基因數(shù)分別為316，380 和385。在300，500，1 000 m發(fā)生5種可變剪接的基因數(shù)目之間存在顯著差異（χ2=34.724，df=8，P＜0.001）。

表2 可變剪切基因主要顯著富集通路分析（吡蟲啉）Tab.2 Main Pathway Enrichment of AS Genes（Imidacloprid）

表3 溴氰菊酯處理組間差異AS分類和數(shù)量統(tǒng)計Tab.3 AS classification and quantity statistics between deltamethrin treatment group and control group

2.4 溴氰菊酯誘導舞蹈蜜蜂腦部AS基因KEGG pathway富集分析

根據(jù)這些發(fā)生可變剪切的基因做了KEGG 富集分析，這些顯著富集的通路可以影響機體的新陳代謝、糖類代謝、脂肪酸代謝、氨基酸代謝和信號傳導等生物學活動，與重要的信號通路（wnt sig?naling pathway，TGF-beta signaling pathway，notch signaling pathway，MAPK signaling pathway-fly，pho?totransduction-fly，mTOR signaling pathway，phos?phatidylinositol signaling system，neuroactive ligandreceptor interaction）和免疫應答通路（regulation of autophagy，microbial metabolism in diverse environ?ments，nicotinate and nicotinamide metabolism，caf?feine metabolism）密切相關(guān)（表4）。

圖2 溴氰菊酯處理組間可變剪切基因數(shù)Fig.2 Number of AS genes between deltamethrin treatment group and control group

表4 可變剪切基因主要顯著富集通路分析（溴氰菊酯）Tab.4 Main Pathway Enrichment of AS Gene（Deltamethrin）

3 討論

本試驗中，筆者通過飼喂2 種亞致死劑量的殺蟲劑吡蟲啉和溴氰菊酯，蜜蜂轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)5 種類型的可變剪切，發(fā)生可變剪切的事件和基因主要集中在SE。由于1 個基因可能通過不同類型可變剪切產(chǎn)生不同轉(zhuǎn)錄本[14]，使1 個基因由于時間環(huán)境的不同翻譯出不同的蛋白質(zhì)。由于殺蟲劑的刺激，蜜蜂基因組發(fā)生一定可變剪切，可能改變配體受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子、生理節(jié)律、內(nèi)吞作用以及神經(jīng)信號傳導，會對細胞功能產(chǎn)生影響，包括免疫應答、學習記憶和飛行定位等。

在蜜蜂采食混有殺蟲劑的糖水后，體內(nèi)某些參與信號通路的基因發(fā)生了可變剪切，如參與MAPK signaling pathway-fly 的調(diào)節(jié)基因（LOC412003，LOC412529，LOC100576369），參與Wnt signaling pathway的調(diào)節(jié)基因（LOC406106，LOC411046，LOC551691，LOC726671，LOC408691，LOC408976）和參與Neuroac?tive ligand-receptor interaction 的調(diào)節(jié)基因（LOC411050，LOC726953，LOC410435，LOC411760）。MAPK 信號通路是由小GTP 酶中的岬家族控制的信號級聯(lián)放大反應[15]，調(diào)節(jié)細胞生理活動。大量行為學試驗證明MAPK信號通路能影響長期恐懼記憶[16-17]、空間記憶[18-19]和嗅覺氣味記憶的激活[20]。參與Wnt signaling路徑的基因與學習記憶有關(guān)[21]。而Neuroactive ligand-receptor interaction 通路是一批位于原生質(zhì)膜上參與神經(jīng)可塑性及學習記憶的受體[22]。說明2種殺蟲劑都能夠影響基因的可變剪切，從而影響蜜蜂的學習記憶能力，但其具體的功能還需要進行蛋白互作、RNA 干擾等試驗進一步研究。另外，發(fā)生可變剪切基因還參與細胞間的信號傳導、新陳代謝和正常的生理活動，但可變剪切基因?qū)r(nóng)藥的免疫應答機制還尚不清楚，有待進一步的研究。