李霞，陳曉水，黃藝偉，楊君，周國(guó)俊*，李劍鋒*

(1.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，浙江 杭州 310008；2.廈門大學(xué)，福建 廈門 361005)

1 引言

多菌靈和甲基硫菌靈同屬于苯并咪唑類，是具有高效、廣譜、低毒等特點(diǎn)的一類殺菌劑，其原理是通過(guò)干擾病原菌有絲分裂中紡錘體的形成，影響細(xì)胞分裂，從而起到殺菌作用，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中植物真菌病害的防治，同時(shí)也是煙草登記使用的農(nóng)藥，用于煙草白粉病、根黑腐病等的防治。甲基硫菌靈在植物體內(nèi)可代謝為多菌靈。研究發(fā)現(xiàn)，多菌靈和甲基硫菌靈對(duì)哺乳動(dòng)物有一定的毒害作用[1]，同時(shí)煙草在燃燒后仍有部分多菌靈和甲基硫菌靈(2.2～4.5%)能夠保持分子的原有結(jié)構(gòu)，然后通過(guò)主流煙氣進(jìn)入到人體內(nèi)從而對(duì)人體健康造成損傷[2]。國(guó)際煙草科學(xué)研究合作中心(CORESTA)規(guī)定了煙草中多菌靈的指導(dǎo)性殘留限量。因此，發(fā)展煙草中多菌靈和甲基硫菌靈殘留的檢測(cè)分析方法很有必要。

目前，煙草中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法主要有：氣相、液相色譜及其與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[3-5]、分光光度法[6]、免疫分析法[7]等。色譜檢測(cè)方法具有準(zhǔn)確性高，結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，但往往需要復(fù)雜的提取、凈化等前處理過(guò)程，周期長(zhǎng)、成本高，且需要昂貴的分析儀器，不能滿足大量樣品和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)需求?，F(xiàn)有分光光度法簡(jiǎn)單易行，但存在靈敏度低、檢測(cè)范圍小、易出現(xiàn)假陽(yáng)、假陰性等問(wèn)題。免疫分析法是一種有效而快速的方法，但是在獲得高效和高特異性的抗體，以及提高方法檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)限方面，仍待進(jìn)一步研究和改進(jìn)。而且，由于多菌靈與甲基硫菌靈的化學(xué)性質(zhì)相似，目前的快速檢測(cè)方法中經(jīng)常未能解決它們之間的相互干擾問(wèn)題。因此，尋求成本低、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快、靈敏度高且兩種農(nóng)藥不相互干擾的方法，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)(SERS)是一種具有超高靈敏度的指紋光譜技術(shù)，甚至能夠達(dá)到單分子檢測(cè)級(jí)別，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用在食品和農(nóng)產(chǎn)品中危害物質(zhì)、食用添加劑、農(nóng)藥殘留等的快速檢測(cè)[8-10]。例如，Alsammarraie等[11]制備了有序陣列的納米金棒活性SERS基底來(lái)對(duì)果汁和牛奶中的西維因進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度可達(dá)50 ppb。Chen等[12]將納米粒子粘附在膠帶上來(lái)制備SERS基底，從而對(duì)蔬菜水果中的甲基對(duì)硫磷、福美雙、毒死蜱等農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速檢測(cè)。近年來(lái)，有關(guān)SERS檢測(cè)農(nóng)藥的相關(guān)研究報(bào)道日趨增多，SERS技術(shù)在農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方面突顯出了很大的應(yīng)用價(jià)值。例如，吳燕等人[13]以表面增強(qiáng)試劑為基底，利用SERS技術(shù)對(duì)茶葉中的多菌靈進(jìn)行檢測(cè)；李俊杰等[14]則利用SERS技術(shù)來(lái)對(duì)臍橙樣品中不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)噻菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行拉曼檢測(cè)。然而，上述方法都是通過(guò)利用SERS技術(shù)來(lái)對(duì)單一的農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)，而對(duì)煙草樣品中多菌靈和甲基硫菌靈進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)的方法卻未見相關(guān)報(bào)道?；诖耍竟ぷ骼帽銛y式拉曼光譜儀結(jié)合前處理技術(shù)開展煙葉中多菌靈和甲基硫菌靈的同時(shí)快速檢測(cè)。通過(guò)優(yōu)化前處理?xiàng)l件，使得多菌靈與甲基硫菌靈分離于同一前處理液的不同溶液層中，并用便攜式拉曼光譜儀分別進(jìn)行檢測(cè)。該方法只需結(jié)合簡(jiǎn)單前處理便可準(zhǔn)確區(qū)分檢測(cè)多菌靈與甲基硫菌靈，實(shí)現(xiàn)了多通道的快速檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度低、檢測(cè)速度快、成本低、操作簡(jiǎn)便，適用于現(xiàn)場(chǎng)批量樣品的快速篩查。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑

多菌靈(分析標(biāo)準(zhǔn)品，99%)、甲基硫菌靈(分析標(biāo)準(zhǔn)品)、乙腈(分析純)、環(huán)己烷(分析純)、溴化鉀(分析純)、碳酸鉀(分析純)、氯化鈉(分析純)和無(wú)水硫酸鎂(分析純)均購(gòu)于阿拉丁化學(xué)試劑有限公司，PSA(N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑)購(gòu)于安捷倫科技有限公司，納米金(粒徑約為55 nm)增強(qiáng)試劑購(gòu)于廈門賽納斯科技有限公司。

2.2 儀器

便攜式拉曼光譜儀(SHINE-P785N廈門賽納斯科技有限公司，激發(fā)光波長(zhǎng)785 nm，最大激光功率為500 mW)，超純水儀(Heal-force，smart-N系列)，高速離心機(jī)(湘儀 H2500R)，漩渦振蕩器(VORTEX-GENIE2)。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1多菌靈和甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜采集

將標(biāo)準(zhǔn)品多菌靈/甲基硫菌靈固體粉末置于干凈的載玻片上壓平后，直接用便攜式拉曼光譜儀進(jìn)行拉曼光譜采集，獲取拉曼光譜。

采用逐級(jí)稀釋的方法，分別配制不同濃度的多菌靈、甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)酸性水溶液(0.2 mg/kg、0.1 mg/kg、0.05 mg/kg、0.01 mg/kg、0 mg/kg)。

多菌靈的檢測(cè)：取100 μL標(biāo)準(zhǔn)液，加入50 μL團(tuán)聚劑1(1 mol/L碳酸鉀與1 mol/L溴化鉀水溶液按體積比1：4混合)，加入300 μL納米金溶膠，混勻，于便攜式拉曼光譜儀進(jìn)行圖譜采集；

甲基硫菌靈的檢測(cè)：取200 μL標(biāo)準(zhǔn)液，加入50 μL團(tuán)聚劑2(1 mol/L氯化鈉水溶液)，加入200 μL納米金溶膠，混勻，于便攜式拉曼光譜儀進(jìn)行圖譜采集；

拉曼檢測(cè)條件：激發(fā)光785 nm，激光功率500 mW，掃描時(shí)間5000 ms。

2.3.2原煙樣品的前處理

準(zhǔn)確稱取磨粉后的原煙空白樣品0.5 g于離心管中，分別添加農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品至濃度為0、0.5、1、3、5、7 mg/kg，自然晾干，備用。然后取上述待測(cè)樣品0.5 g，加入4 mL有機(jī)試劑(乙腈和甲苯按5∶1的比例混合)，將煙絲用有機(jī)試劑完全浸濕，然后超聲振蕩2 min，再將有機(jī)層取出置于新離心管(離心管中含有0.2 g無(wú)水硫酸鎂和0.025 g PSA(N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑)，振蕩、離心，取上層有機(jī)層吹干，加入500 μL純水和250 μL環(huán)己烷復(fù)溶，離心分層，得到上層多菌靈待測(cè)液，下層甲基硫菌靈待測(cè)液。

2.3.2SERS檢測(cè)

多菌靈的檢測(cè)：取100 μL上層待測(cè)液于樣品管中，按上述標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，獲得拉曼圖譜，并與多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品SERS譜對(duì)比；

甲基硫菌靈的檢測(cè)：取200 μL下層待測(cè)液于樣品管中，按上述標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，獲得拉曼圖譜，并與甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)品SERS譜對(duì)比。

圖1 煙葉中多菌靈和甲基硫菌靈的檢測(cè)示意圖

3 結(jié)果與討論

3.1 多菌靈、甲基硫菌靈的拉曼光譜分析

由于拉曼光譜的峰位移、強(qiáng)度及拉曼峰形狀反映物質(zhì)化學(xué)鍵的振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)頻率，是確定化學(xué)鍵、官能團(tuán)的重要依據(jù)，因此通過(guò)分子的拉曼光譜可以確定分子的結(jié)構(gòu)。首先，分別采集多菌靈的固體譜和SERS譜，結(jié)果如圖2a所示。由圖可知，多菌靈的固體譜和SERS譜的主要特征峰位置基本相符且與文獻(xiàn)報(bào)道的相一致[15]，證明了獲得的SERS譜即為多菌靈的SERS譜。同時(shí)，根據(jù)之前的文獻(xiàn)報(bào)道在625 cm-1處的多菌靈的拉曼信號(hào)，為C-C-C的面內(nèi)彎曲振動(dòng)，而756 cm-1、940 cm-1則歸屬于苯環(huán)中C-H 的面外彎曲振動(dòng)，1006 cm-1和1224 cm-1分別歸屬于苯環(huán)的變形振動(dòng)和N-H 的面內(nèi)彎曲振動(dòng)，1263 cm-1歸屬于C-N的伸縮振動(dòng)和C-H面內(nèi)彎曲振動(dòng)的耦合。同時(shí)，上述特征峰峰強(qiáng)較為明顯，可作為SERS光譜檢測(cè)多菌靈的判別依據(jù)。

類似的，我們分別對(duì)甲基硫菌靈的固體譜和SERS譜進(jìn)行采集，得到圖2b所示拉曼譜圖，并且甲基硫菌靈的固體譜和SERS亦是相對(duì)應(yīng)的。其中在605 cm-1處的拉曼信號(hào)，為N-H 的變形振動(dòng)，在712 cm-1、1039cm-1處的拉曼信號(hào)，可歸屬于苯環(huán)上的C-H的變形振動(dòng)，在961 cm-1和1189 cm-1處的拉曼信號(hào)，分別歸屬于苯環(huán)上的C-H的變形振動(dòng)和分子中-CH3的變形振動(dòng)，以及-CH3的變形振動(dòng)，在1259 cm-1處的拉曼信號(hào)，則為N-H和C-H的變形振動(dòng)。因此，上述特征峰可作為SERS光譜檢測(cè)甲基硫菌靈的判別依據(jù)。

圖2 (a)多菌靈的分子式、常規(guī)拉曼光譜及其表面增強(qiáng)拉曼光譜；(b)甲基硫菌靈的分子式、常規(guī)拉曼光譜及其表面增強(qiáng)拉曼光譜

圖3所示的拉曼光譜圖為不同濃度(0.2 mg/kg、0.1 mg/kg、0.05 mg/kg、0.01 mg/kg、0 mg/kg)的多菌靈和甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液的SERS譜圖，由圖可知，多菌靈和甲基硫菌靈的SERS譜中特征峰峰強(qiáng)隨著濃度的減小而減小，且均在濃度低至0.01 mg/kg時(shí)仍能明顯識(shí)別。表明，該方法對(duì)多菌靈和甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢出濃度均可達(dá)到0.01 mg/kg。

圖3 (a)不同濃度多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液SERS譜(b)不同濃度甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液SERS譜

3.2 原煙樣品中多菌靈和甲基硫菌靈的檢測(cè)

煙草樣品成分的多樣性和復(fù)雜性，為表面增強(qiáng)拉曼光譜的檢測(cè)帶來(lái)一定的干擾。本文首先采用N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑(PSA)和無(wú)水硫酸鎂作為凈化劑，除去原煙樣品中色素及多酚等的干擾影響(詳細(xì)前處理步驟如實(shí)驗(yàn)部分2.3.2所示)。因甲基硫菌靈在植物體內(nèi)可代謝為多菌靈，故在噴灑過(guò)甲基硫菌靈農(nóng)藥的原煙樣品中通常同時(shí)存在多菌靈和甲基硫菌靈殘留。為了排除多菌靈和甲基硫菌靈分子在表面增強(qiáng)拉曼基底表面的競(jìng)爭(zhēng)吸附，我們將多菌靈與甲基硫菌靈分離于同一處理液的不同溶液層中，進(jìn)而分別得到原煙樣品中多菌靈和甲基硫菌靈的SERS光譜(見圖4)，實(shí)現(xiàn)多通道檢測(cè)。由圖4a可知，原煙中多菌靈的濃度為1 mg/kg時(shí)，625 cm-1、940 cm-1、1006 cm-1、1224 cm-1和1263 cm-1等多菌靈SERS特征峰仍能明顯識(shí)別，當(dāng)濃度低至0.5 mg/kg時(shí)，所得的SRES光譜與空白原煙樣品相似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該檢測(cè)方法對(duì)原煙中多菌靈農(nóng)藥殘留的最低檢出濃度可達(dá)到1 mg/kg。相似的，在甲基硫菌靈的加標(biāo)樣檢測(cè)中，當(dāng)原煙的加標(biāo)濃度為1 mg/kg時(shí)，甲基硫菌靈在605 cm-1、712 cm-1、961 cm-1和1189 cm-1處的特征峰可以明顯識(shí)別。當(dāng)濃度低至0.5 mg/kg時(shí)，所得的SRES光譜與空白原煙樣品的相似，說(shuō)明該檢測(cè)方法對(duì)原煙中甲基硫菌靈農(nóng)藥殘留的最低檢出濃度可達(dá)到1 mg/kg。

圖4 (a)不同濃度的原煙多菌靈提取液的表面增強(qiáng)拉曼光譜；(b)不同濃度的原煙甲基硫菌靈提取液的表面增強(qiáng)拉曼光譜

4 結(jié)論

本文建立了一種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)，多通道快速檢測(cè)煙草中多菌靈和甲基硫菌靈的方法。該方法首先采用環(huán)己烷和純水將多菌靈與甲基硫菌靈分離于不同的溶液層中，然后以便攜式拉曼光譜儀分別進(jìn)行檢測(cè)，得到相應(yīng)的SERS光譜。該方法前處理簡(jiǎn)單，一次前處理便可滿足多菌靈和甲基硫菌靈的同時(shí)檢測(cè)。測(cè)試結(jié)果表明，煙葉中多菌靈和甲基硫菌靈殘留量的檢測(cè)靈敏度均為1 mg/kg，檢測(cè)時(shí)間為10～15 min。為煙葉中痕量農(nóng)藥的檢測(cè)提供一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的分析檢測(cè)途徑。煙草中對(duì)于農(nóng)殘的檢測(cè)不僅僅包括母體化合物，還有其同系物、分解產(chǎn)物等等。同時(shí)，農(nóng)殘樣品的最大殘留量不斷下降，新型農(nóng)藥的不斷研制和應(yīng)用，這些都對(duì)農(nóng)殘的檢測(cè)提出了新的要求與目標(biāo)。因此，發(fā)展穩(wěn)定性好、靈敏度高、適用范圍廣，而且可以同時(shí)進(jìn)行快速及多元化的檢測(cè)技術(shù)以及分析方法是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)與難點(diǎn)。而光譜技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的大批量、快速檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)煙草生產(chǎn)和銷售環(huán)節(jié)的快速篩查，因此加快光譜分析技術(shù)的研究與發(fā)展，逐步實(shí)現(xiàn)對(duì)煙草農(nóng)殘檢測(cè)的大批量快速、無(wú)損檢測(cè)具有重要意義和發(fā)展前景。