邵寒雨 符元元 王 娟 趙林霞 高永靜 張志軍,3

（1 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系，南通226001；2 南通大學(xué)特種醫(yī)學(xué)研究院，南通226019；3 南通大學(xué)疼痛醫(yī)學(xué)研究院，南通 226019）

神經(jīng)病理性疼痛是指軀體感覺系統(tǒng)的損傷或疾病而直接造成的疼痛，是臨床上難治性疾病，據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，其影響7%～10% 社會(huì)人口，我國的神經(jīng)病理性疼痛病人約9000 萬人；神經(jīng)病理性疼痛癥狀存在時(shí)間長，可在原發(fā)疾病治愈后，痛覺異常（痛覺過敏、觸誘發(fā)痛和自發(fā)性疼痛）依然存在，甚至持續(xù)終生[1,2]；這種長期存在的痛覺異常會(huì)使病人痛苦不堪、精神異常，嚴(yán)重影響病人的軀體和社會(huì)功能，也給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。目前，臨床常用的鎮(zhèn)痛藥如阿片類藥物、抗驚厥類藥物、局部麻醉藥、抗抑郁藥等對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的治療效果并不理想[1,2]。深入了解神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制，必將為臨床治療提供有力的依據(jù)。

血紅素加氧酶1 (heme oxygenase 1, HO-1) 分子量為32 KD，位于微粒體內(nèi)，是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，能被多種氧化應(yīng)激產(chǎn)物所誘導(dǎo)表達(dá)[3]。HO-1 是體內(nèi)分解血紅素(heme)的限速酶，分解產(chǎn)生CO、自由鐵 (Fe2+)和膽綠素，膽綠素隨即被膽綠素還原酶還原成膽紅素。HO-1 也稱為熱休克蛋白32 (heat shock protein 32, HSP32)，作為保護(hù)性基因在多系統(tǒng)及組織細(xì)胞中被廣泛研究，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗增殖等特性[4]。HO-1 在正常細(xì)胞內(nèi)表達(dá)很少，但在炎癥氧化應(yīng)激下，HO-1 可被誘導(dǎo)表達(dá)，因此在細(xì)胞炎癥狀態(tài)下，HO-1 是關(guān)鍵的分解血紅素 (heme) 的限速酶[5]。內(nèi)源性的CO 作為第二信使分子，影響細(xì)胞的炎癥、增殖、凋亡；膽綠素和膽紅素都具有抗氧化特性；鐵離子能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白表達(dá)增加，進(jìn)而能有效清除細(xì)胞內(nèi)的鐵離子。HO-1 基因缺失的人表現(xiàn)和HO-1 基因敲除的小鼠表現(xiàn)相似，可表現(xiàn)為慢性炎癥反應(yīng)、組織中鐵沉積、淋巴結(jié)病、白細(xì)胞增多以及細(xì)胞易受到氧化應(yīng)激損傷[6]。

接受皮膚痛覺信息的外周感覺神經(jīng)元 (peripheral sensory neurons) 的胞體主要位于背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion, DRG) 和三叉神經(jīng)節(jié) (trigeminal ganglion, TG) 中[7～9]。這些感覺神經(jīng)元可以根據(jù)細(xì)胞大小和基因表達(dá)特征分為不同類型，如肽能和非肽能的中小直徑神經(jīng)元負(fù)責(zé)傷害性信息感受，而大直徑神經(jīng)元負(fù)責(zé)觸覺和本體感受[7,10]。本課題組前期的研究顯示，外周神經(jīng)損傷小鼠脊髓背角中HO-1誘導(dǎo)過表達(dá)后能緩解多種疾病誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛[11～13]，但HO-1 在DRG 中表達(dá)和分布以及DRG中HO-1 在外周神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛中的作用還未見報(bào)道。外周神經(jīng)損傷后可導(dǎo)致DRG中神經(jīng)元炎癥氧化應(yīng)激[7]，為此，本研究將探討DRG 中的HO-1 表達(dá)分布，以及在神經(jīng)病理性疼痛中作用。本研究結(jié)果將為臨床研發(fā)治療神經(jīng)病理性疼痛新藥物提供新的策略和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

方 法

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性ICR 小鼠(25～35 g)購自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠飼養(yǎng)于獨(dú)立通風(fēng)籠具，維持12 h/12 h的明暗光照循環(huán)，環(huán)境溫度為22±2°，相對(duì)濕度為40%～70%，保持食水充足。本研究中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)國際疼痛學(xué)會(huì)的指南，并經(jīng)南通大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。保留性坐骨神經(jīng)損傷 (spared nerve injury, SNI) 誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛模型的構(gòu)建是在腘窩中將坐骨神經(jīng)的脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)兩大分支用6-0 絲線緊緊結(jié)扎，并去除遠(yuǎn)側(cè)端2 mm神經(jīng)組織，手術(shù)過程中完整保留坐骨神經(jīng)的腓腸神經(jīng)分支[14,15]。

2. 藥物和給藥途徑

HO-1 誘導(dǎo)劑原卟啉IX 氯化鈷 (cobalt protoporphyrin-IX, CoPP) 購自Santa Cruz 公司，溶于含2% DMSO 的0.01 M 的PBS 中。CoPP 腹腔注射劑量為1 mg/kg 和5 mg/kg 兩種劑量，首次于SNI 造模后立即給藥，連續(xù)給藥5 天；對(duì)照組注射相應(yīng)的溶劑（含2% DMSO 的0.01 M 的PBS），注射時(shí)程與CoPP 相同[11,12]。

3. 疼痛行為學(xué)檢測(cè)

小鼠在行為檢測(cè)前兩天適應(yīng)測(cè)試環(huán)境，行為檢測(cè)過程中環(huán)境溫度和濕度保持相對(duì)穩(wěn)定。機(jī)械性觸誘發(fā)痛測(cè)試時(shí)，小鼠放置在金屬網(wǎng)格架上方的塑料盒中適應(yīng)30 min 后開始檢測(cè)[11,12]。用系列von Frey細(xì)絲(0.02～2.56 g)刺激小鼠足底，垂直刺激5 次，每次2～3 s。如果有3 次以上的抬爪或舔爪反應(yīng)，即為陽性反射。最終用機(jī)械縮足閾值表示，其數(shù)值根據(jù)Dixon 的up-down 計(jì)算方法得出，機(jī)械縮足閾值數(shù)值越低說明機(jī)械性觸誘發(fā)痛越嚴(yán)重。

4. 免疫熒光染色

小鼠用異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）氣體麻醉后，從主動(dòng)脈起始處灌注0.01 M 的PBS，隨后用4%多聚甲醛 (Sigma-Aldrich) 固定液灌注。DRG 和脊髓組織在固定液中固定4°過夜，隨后在30%蔗糖 (Sigma-Aldrich) 中脫水。冰凍切片機(jī) (Leica) 中脊髓行30 μm 漂片，DRG 行15 μm 貼片。組織切片先用5%驢血清室溫封閉2 h，隨后孵育一抗4°過夜：HO-1 (rabbit, 1:1000, Enzo Life Sciences)、CGRP (mouse, 1:3000, Sigma-Aldrich)、NF200 (mouse, 1:1000, Millipore)；切片漂洗后加下列熒光試劑或二抗：IB4-FITC (1:200, Sigma-Aldrich)、Donkey anti-rabbit cy3 (1:1000, Jackson ImmunoResearch)、Donkey anti-rabbit 488 (1:1000, Jackson ImmunoResearch)、Donkey anti-mouse 488 (1:1000, Jackson ImmunoResearch)。切片的熒光信號(hào)用熒光顯微鏡拍攝 (Nikon Eclipse Ni-E)，并用Image J 軟件分析統(tǒng)計(jì)。

5. Western blot

小鼠L4和L5的DRG 取材后用含蛋白酶抑制劑 (Sigma-Aldrich) 的蛋白裂解液 (RIPA, Millipore) 提取蛋白質(zhì)，BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度（BCA 購自ThermoFisher scientific）。SDS-PAGE 凝膠電泳每孔加30 μg 總蛋白，電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，用5%脫脂牛奶封閉，隨后孵育一抗：HO-1 (rabbit, 1:1000, Enzo Life Sciences)、GAPDH (rabbit, 1:1000, Millipore)；PVDF 膜漂洗后加下列熒光二抗：IRDye 800CW goat-anti-rabbit (1:10 000, LI-COR)， 用Odyssey CLx system 獲取條帶圖片。條帶的顯色強(qiáng)度分析使用Image J 軟件。

6. 病毒鞘內(nèi)注射

小鼠用異氟烷吸入麻醉后，在小鼠L4和L5腰椎間隙中，將過表達(dá)HO-1 的AAV (AAV2/9-hSyn-HO-1-mCherry) 和對(duì)照病毒 (AAV2/9-hSyn-MCSmCherry) 行鞘內(nèi)注射，劑量為10 μl，病毒滴度為1.0E + 13 v.g./ml。小鼠蘇醒后立即放回飼養(yǎng)籠中，飼養(yǎng)3 周后小鼠機(jī)械縮足閾值測(cè)定后行SNI 模型，在SNI 后的設(shè)定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行疼痛行為學(xué)檢測(cè)。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析軟件用GraphPad Prism 8.0.1，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤 (±SEM)表示。行為學(xué)數(shù)據(jù)用雙因素重復(fù)測(cè)量方差分析 (Two-way repeated measures ANOVA)，如果有差異，進(jìn)一步用Bonferroni's test 比較不同時(shí)間點(diǎn)差異。免疫熒光和western blot 數(shù)值的兩組比較用Student's t test，三組比較用 One-way ANOVA。P < 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. SNI 誘導(dǎo)DRG 中HO-1 陽性神經(jīng)元數(shù)量減少

本研究使用免疫熒光來檢測(cè)DRG 中HO-1 的表達(dá)定位和分布，免疫熒光染色顯示結(jié)果：在正常小鼠和手術(shù)對(duì)照組小鼠DRG 中有大量的HO-1 陽性神經(jīng)元，約占總神經(jīng)元數(shù)量的22%（見圖1 A, B, E）；而SNI 造模后3 天和10 天時(shí)，HO-1 陽性神經(jīng)元的數(shù)量較正常組大幅度下降，分別為9.6%和8.2%（見圖1 C-E）。

2. DRG 中HO-1 陽性神經(jīng)元的定位分布

DRG 感覺神經(jīng)元根據(jù)胞體大小和基因表達(dá)模式分成幾種類型：非肽類神經(jīng)元是IB4 陽性并且是小直徑無髓鞘的神經(jīng)元；肽類神經(jīng)元是中直徑的薄髓鞘的神經(jīng)元表達(dá)CGRP；大直徑神經(jīng)元的髓鞘較厚，表達(dá)NF200[10]。本研究用免疫熒光雙標(biāo)顯示：HO-1 與IB4 共標(biāo)較多（見圖2A-C），統(tǒng)計(jì)顯示HO-1 陽性神經(jīng)元中93.4%是IB4 陽性神經(jīng)元，IB4 陽性神經(jīng)元中96.5%是HO-1 陽性神經(jīng)元（見圖2J）；而HO-1 與CGRP 以及與NF200 共標(biāo)很少（見圖2D-I），統(tǒng)計(jì)顯示HO-1陽性神經(jīng)元中只有1.5%左右的CGRP 神經(jīng)元，同樣的CGRP 陽性神經(jīng)元中也只有0.9%的HO-1 陽性神經(jīng)元（見圖2K）；另外，HO-1 陽性神經(jīng)元中只有1.3%左右的NF200 神經(jīng)元，NF200 陽性神經(jīng)元中也只有1.1%的HO-1 陽性神經(jīng)元（見圖2L）。胞體大小分布統(tǒng)計(jì)顯示HO-1 陽性神經(jīng)元主要集中在300 μm2面積以下的小型細(xì)胞（見圖2M）。

3. HO-1 誘導(dǎo)劑CoPP 減輕SNI 誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛

在SNI 造模后立即腹腔注射HO-1 誘導(dǎo)劑CoPP，每天1 次，連續(xù)注射5 天（見圖3A）。行為學(xué)結(jié)果顯示，在造模前各自的機(jī)械縮足基礎(chǔ)閾值(baseline, BL)無顯著性差異，注射溶劑對(duì)照組的SNI 小鼠在造模后1 天機(jī)械縮足閾值就顯著降低，表明小鼠產(chǎn)生了機(jī)械性觸誘發(fā)痛，并且持續(xù)21 天以上（見圖3B）；連續(xù)注射高劑量的CoPP (5 mg/kg)后，SNI 誘導(dǎo)的機(jī)械性觸誘發(fā)痛在7 天時(shí)較溶劑對(duì)照組減輕，疼痛緩解持續(xù)到造模后14 天以上（見圖3B）；連續(xù)注射低劑量的CoPP (1 mg/kg)后，SNI 誘導(dǎo)的機(jī)械性觸誘發(fā)痛較溶劑對(duì)照組無顯著性差異（見圖3B）。

4. DRG 神經(jīng)元過表達(dá)HO-1 顯著緩解SNI 誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛

圖1 免疫熒光染色顯示DRG 中HO-1 陽性神經(jīng)元在SNI 后的變化 (n = 5, ±SEM)(A)正常組DRG 中HO-1 陽性神經(jīng)元；(B) 假手術(shù)10 天組DRG 中HO-1 陽性神經(jīng)元；(C) SNI 3 天組DRG 中HO-1 陽性神經(jīng)元；(D) SNI 10 天組DRG 中HO-1 陽性神經(jīng)元；(E)各組DRG 中HO-1 陽性神經(jīng)元占總神經(jīng)元數(shù)量的百分比統(tǒng)計(jì)；*P < 0.05，與正常組相比，#P < 0.05，與假手術(shù)10 天組相比Fig. 1 Immunofluorescence staining shows the change of HO-1+ neurons in the DRG after SNI (n = 5, ±SEM)(A) DRG HO-1+ neurons in the Naive mice; (B) DRG HO-1+ neurons in the Sham 10 d mice; (C) DRG HO-1+ neurons in the SNI 3 d mice; (D) DRG HO-1+ neurons in the SNI 10 d mice; (E) Statistical data show the percentage of HO-1+ neurons in the DRG. *P < 0.05, compared with the Naive group; #P < 0.05, compared with the Sham 10 d group.

小鼠在測(cè)定機(jī)械縮足的基礎(chǔ)閾值后，鞘內(nèi)注射過表達(dá)HO-1 的AAV 和對(duì)照病毒（見圖4A），21 天后行SNI 造模，造模前1 天再測(cè)兩組機(jī)械縮足的基礎(chǔ)閾值。鞘內(nèi)注射病毒28 天后DRG 組織切片顯示AAV 能浸染大部分DRG 神經(jīng)元（見圖4B），脊髓組織切片顯示AAV 能顯示DRG 神經(jīng)元到達(dá)脊髓背角的末梢，而未見AAV 浸染脊髓神經(jīng)元（見圖4C）。Western blot 結(jié)果顯示過表達(dá)HO-1的AAV 較對(duì)照病毒能顯著上調(diào)DRG 中HO-1 的表達(dá)，上調(diào)幅度約3 倍（見圖4D, E）。免疫熒光染色顯示對(duì)照AAV 病毒浸染的神經(jīng)元中約50%能表達(dá)內(nèi)源性HO-1，而約82%內(nèi)源性HO-1 神經(jīng)元能被AAV 病毒浸染（見圖4F-I）。行為學(xué)檢測(cè)顯示，鞘內(nèi)注射病毒前兩組基礎(chǔ)閾值沒有差別，注射病毒后SNI 造模前的基礎(chǔ)閾值也沒有差異。SNI 造模后3 天起過表達(dá)HO-1 小鼠的機(jī)械性觸誘發(fā)痛明顯較對(duì)照AAV組緩解，這種緩解能持續(xù)21 天以上（見圖4J）。

討 論

本課題組前期研究的結(jié)果顯示HO-1 誘導(dǎo)劑CoPP 能有效緩解骨癌痛[13]，還能有效減輕長春新堿誘導(dǎo)的化療痛和脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛。這與腹腔注射CoPP 能上調(diào)脊髓部位的HO-1的蛋白和基因表達(dá)有關(guān)[11～13]；特異性在脊髓部位注射過表達(dá)HO-1 的病毒能緩解長春新堿誘導(dǎo)的化療痛和脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛[11,12]。免疫熒光定位結(jié)果顯示化療痛和外周神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛的脊髓中HO-1 主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。上調(diào)表達(dá)脊髓中HO-1 能使膠質(zhì)細(xì)胞的激活減輕和炎癥因子表達(dá)下調(diào)[11,12]。然而外周感覺神經(jīng)元，如DRG 中的HO-1 表達(dá)情況還一無所知。本研究用免疫熒光染色顯示DRG 中有大量的HO-1 神經(jīng)元，并且大部分與IB4 陽性神經(jīng)元共標(biāo)，胞體大小分布統(tǒng)計(jì)也顯示HO-1 陽性神經(jīng)元主要為小型神經(jīng)元。外周神經(jīng)損傷后小型神經(jīng)元較大型神經(jīng)元容易損傷[10]；而且小型神經(jīng)元是傳導(dǎo)痛覺信息的神經(jīng)元，所以這些小型神經(jīng)元的病變與神經(jīng)病理性疼痛密切相關(guān)。因而，這些結(jié)果提示小型神經(jīng)元中HO-1 表達(dá)可能與神經(jīng)損傷后的病理性疼痛相關(guān)。

圖2 免疫熒光雙標(biāo)染色顯示DRG 中HO-1 分別與IB4、CGRP、NF200 共標(biāo)以及HO-1+神經(jīng)元大小分布(A-C) HO-1 與IB4 免疫熒光共標(biāo)染色；(D-F) HO-1 與CGRP 免疫熒光共標(biāo)染色；(G-I) HO-1 與NF200 免疫熒光共標(biāo)染色；(J-L) 韋恩圖顯示DRG 中HO-1+分別與IB4+、CGRP+、NF200+神經(jīng)元共標(biāo)百分比；(M) DRG 中HO-1+神經(jīng)元和總神經(jīng)元細(xì)胞大小分布頻率統(tǒng)計(jì)Fig. 2 The double immunostaining of HO-1 with IB4, CGRP, NF200 and the cell-size distribution of HO-1+ neurons in the DRG(A-C) The double immunostaining of HO-1 with IB4; (D-F) The double immunostaining of HO-1 with CGRP; (G-I) The double immunostaining of HO-1 with NF200; (J-L) The Venn diagrams showing the double immunostaining of HO-1+ with the IB4+, CGRP+, and NF200+; (M) The cell-size distribution frequency of HO-1+ neurons and total neurons in the DRG.

圖3 HO-1 誘導(dǎo)劑CoPP 能緩解SNI 誘導(dǎo)的機(jī)械性觸誘發(fā)痛 (n = 5, ±SEM)(A) 行為學(xué)檢測(cè)和SNI 以及CoPP 給藥的時(shí)間流程圖；(B) CoPP 緩解了SNI 誘導(dǎo)的機(jī)械性觸誘發(fā)痛；*P < 0.05，與溶劑組相比Fig. 3 HO-1 inducer CoPP alleviates SNI-induced mechanical allodynia (n = 5, ±SEM)(A) The timeline of behavioral test and SNI and CoPP treatments; (B) The CoPP attenuated SNI-induced mechanical allodynia. * P < 0.05, compared with the vehicle group.

SNI 模型能誘導(dǎo)小鼠快速（小于24 h）、長時(shí)程（大于6 個(gè)月）的機(jī)械性觸誘發(fā)痛[14]。本研究的行為學(xué)結(jié)果也同樣顯示小鼠在SNI 后1 天就能產(chǎn)生機(jī)械性觸誘發(fā)痛，并能持續(xù)21 天（觀察時(shí)間點(diǎn)內(nèi)）以上。對(duì)于SNI 后3 和10 天的DRG 免疫熒光染色顯示HO-1 陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯較正常組和對(duì)照組減少。此前大量文獻(xiàn)報(bào)道了HO-1 在氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)中作用[5,6,16]，本課題組前期研究也揭示了脊髓中星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中過表達(dá)HO-1 能緩解神經(jīng)炎癥反應(yīng)[11,12]，這些分子機(jī)制參與了慢性疼痛的進(jìn)程。因而，我們推斷SNI 后DRG 神經(jīng)元中的HO-1 表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致了或加強(qiáng)了神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展。對(duì)此，本研究和多個(gè)課題組發(fā)現(xiàn)腹腔注射CoPP 后行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明誘導(dǎo)HO-1 表達(dá)能緩解神經(jīng)病理性疼痛，然而腹腔注射CoPP 是發(fā)揮全身作用，也會(huì)影響脊髓和DRG 中HO-1 表達(dá)[17,18]。

為了特異性檢測(cè)DRG 神經(jīng)元中HO-1 在神經(jīng)病理性疼痛中的作用，本研究使用了新的策略，即在鞘內(nèi)注射過表達(dá)HO-1 的AAV。形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示AAV 能高效特異浸染DRG 神經(jīng)元，并且這些DRG神經(jīng)元的突起能進(jìn)入脊髓背角，進(jìn)一步說明病毒浸染的是DRG 神經(jīng)元。另外，脊髓中并未觀察到病毒浸染的神經(jīng)元，這說明鞘內(nèi)注射的病毒不會(huì)透過血腦屏障或者腦脊液屏障進(jìn)入脊髓神經(jīng)元。Western blot 結(jié)果顯示過表達(dá)HO-1 的AAV 能使DRG 中HO-1大幅度增加，結(jié)合行為學(xué)結(jié)果顯示，DRG 中過表達(dá)HO-1 組的小鼠神經(jīng)病理性疼痛能有效緩解，持續(xù)緩解21 天以上。在脊髓中，已經(jīng)證明了上調(diào)HO-1表達(dá)能緩解神經(jīng)炎癥反應(yīng)，如膠質(zhì)細(xì)胞激活、炎癥因子產(chǎn)生等[11,12]。在外周，我們課題組結(jié)果也顯示DRG 中神經(jīng)炎癥在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[7,9,19]。因此，DRG 中HO-1 在神經(jīng)損傷后的表達(dá)減少可能與神經(jīng)炎癥發(fā)生有關(guān)，而過表達(dá)HO-1 可能通過減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)進(jìn)而緩解神經(jīng)病理性疼痛，但具體機(jī)制還需要深入研究。在臨床上，對(duì)DRG 神經(jīng)元的調(diào)控，如電刺激等也能很好地緩解神經(jīng)病理性疼痛[20]，而這種臨床治療是針對(duì)DRG 中所有神經(jīng)元的調(diào)控。本研究中用AAV 上調(diào)了DRG 中幾乎所有類型神經(jīng)元中的HO-1，原因是目前還沒有特異感染IB4 陽性神經(jīng)元的AAV，但考慮到HO-1 具有抗炎作用，而外周神經(jīng)損傷后DRG神經(jīng)元幾乎都會(huì)受到炎癥氧化應(yīng)激損傷[7,21]。因此，不管是IB4 陽性還是陰性神經(jīng)元中HO-1 表達(dá)上調(diào)對(duì)神經(jīng)病理性疼痛緩解是有利的。

圖4 鞘內(nèi)注射過表達(dá)HO-1 病毒能長時(shí)程緩解SNI 誘導(dǎo)的機(jī)械性觸誘發(fā)痛 (±SEM)(A)行為學(xué)檢測(cè)和SNI 以及病毒給藥的時(shí)間流程圖；(B) 鞘內(nèi)注射AAV 后mCherry 熒光蛋白表達(dá)在DRG 神經(jīng)元，(C) mCherry 熒光蛋白標(biāo)記神經(jīng)纖維在脊髓中的分布；(D, E) Western blot 結(jié)果顯示AAV-HO-1 鞘內(nèi)注射后DRG 中HO-1 蛋白表達(dá)顯著增加，*P < 0.05，與對(duì)照AAV 組相比 (n = 3)；(F-I)免疫熒光結(jié)果顯示HO-1 與對(duì)照AAV 病毒的mCherry 雙標(biāo)染色及統(tǒng)計(jì)結(jié)果 (n = 3)；(J) AAV-HO-1 鞘內(nèi)注射后能持續(xù)緩解SNI 誘導(dǎo)的機(jī)械性觸誘發(fā)痛，能持續(xù)3 周以上，*P < 0.05，與相對(duì)應(yīng)的對(duì)照AAV 組相比 (n = 5)Fig. 4 SNI-induced mechanical allodynia is persistently attenuated by the intrathecal injection of AAV-HO-1 (±SEM)(A) The timeline of behavioral test and SNI and intrathecal injection of AAV; (B) Representative fluorescence photomicrograph showing mCherry expression in DRG neurons; (C) The distribution of mCherry positive neuronal fibers in the spinal cord; (D, E) Western blot shows that HO-1 protein was significantly increased after intrathecal injection of AAV-HO-1. *P < 0.05, compared with the AAV-Control group (n = 3); (F-I) Immunostaining and statistical results show the double staining of HO-1 with mCherry (n = 3); (J) Intrathecal injection of AAV-HO-1 attenuated SNI-induced mechanical allodynia for more than 21 days. *P < 0.05, compared with the AAV-Control group (n = 5).

綜上所述，HO-1 作為一種抗炎癥分子，在神經(jīng)損傷后DRG 部位減少。上調(diào)DRG 神經(jīng)元中HO-1表達(dá)，可能具有減輕神經(jīng)炎癥作用，進(jìn)而緩解了神經(jīng)病理性疼痛。