鄭浩楠 張 瑛 遲 雁△

（1 北京大學(xué)第一醫(yī)院消化科，北京100034；2 北京大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所； 3 北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系；4 教育部/國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)神經(jīng)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100191）

腸易激綜合征 (irritable bowel syndrome, IBS) 是臨床最常見的胃腸功能紊亂性疾病，以腹痛、腹脹或腹部不適伴有排便習(xí)慣及排便性狀的改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)，同時(shí)缺乏明顯的形態(tài)學(xué)改變及臨床常規(guī)檢查的異常[1,2]。難以緩解且反復(fù)發(fā)作的腹痛癥狀是IBS 病人的典型臨床表現(xiàn)，其不僅嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量，同時(shí)也造成大量醫(yī)療資源的浪費(fèi)。目前認(rèn)為，腦-腸軸互動(dòng)紊亂、內(nèi)臟高敏感、腸道菌群紊亂、胃腸道動(dòng)力異常、腸黏膜屏障受損、黏膜免疫與炎癥、精神神經(jīng)因素、遺傳等機(jī)制共同參與IBS 的產(chǎn)生[3]，其中內(nèi)臟高敏感 (visceral hypersensitivity) 被認(rèn)為是IBS 的核心病理生理學(xué)機(jī)制和生物學(xué)標(biāo)記[4]，但是關(guān)于其形成機(jī)制目前尚不清楚。探討IBS 內(nèi)臟高敏感的形成機(jī)制，對(duì)發(fā)掘新的IBS 腹痛的治療靶點(diǎn)和臨床治療方案具有重要意義。

瞬時(shí)受體電位通道香草素亞型1 (transient receptor potential vanilloid, TRPV1) 是一種傷害性信息感受分子，可接受熱 (> 43oC)、H+、辣椒素等多種形式的刺激，引起傷害性感受器的激活，傳遞傷害性信息[5,6]。TRPV1 高表達(dá)在外周感覺神經(jīng)元及其神經(jīng)末梢，在支配消化道的內(nèi)臟感覺神經(jīng)纖維中也有廣泛的分布[7]，并且有多項(xiàng)研究表明，TRPV1 可通過(guò)表達(dá)和功能的改變參與IBS 內(nèi)臟高敏感的產(chǎn)生，其機(jī)制涉及TRPV1 與膽汁酸和肥大細(xì)胞表面及釋放的多種分子的相互作用[8～10]。

臨床上，IBS 病人的焦慮/抑郁水平顯著高于一般人群[11]，而且研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體在經(jīng)歷生理和心理應(yīng)激后，不僅可產(chǎn)生焦慮/抑郁情緒，同時(shí)對(duì)內(nèi)臟疼痛信號(hào)的感知也有所增強(qiáng)，即產(chǎn)生內(nèi)臟高敏感[12～14]。有研究顯示，TRPV1 受體可能參與焦慮/抑郁情緒的產(chǎn)生，除外周神經(jīng)系統(tǒng)外，在多個(gè)腦區(qū)如海馬、杏仁核、前額葉皮質(zhì)等，均可檢測(cè)到TRPV1 受體的表達(dá)，且在給予TRPV1 受體拮抗劑后，能明顯緩解動(dòng)物的焦慮/抑郁程度[15～17]。另外，有研究認(rèn)為，TRPV1 受體可介導(dǎo)位于基底外側(cè)杏仁核 (basolateral amygdala, BLA) 內(nèi)突觸傳遞功能的增強(qiáng)，這可能是內(nèi)臟痛的中樞敏化機(jī)制之一[18]。因此TRPV1 受體介導(dǎo)的焦慮水平的改變，是否可以作為IBS 內(nèi)臟敏感性升高的原因及其相關(guān)機(jī)制值得進(jìn)一步探討。本研究旨在探討 TRPV1 是否可以通過(guò)影響焦慮水平從而進(jìn)一步影響IBS 內(nèi)臟高敏感的產(chǎn)生。研究將為明確TRPV1 參與IBS 內(nèi)臟高敏感形成所涉及的途徑提供新的證據(jù)，從而為臨床IBS 難治性腹痛的治療提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物均為雄性11 周齡，清潔級(jí)，體重為20～30 g 的野生型C57BL/6 小鼠和背景為C57BL/6的Trpv1-/-小鼠；飼養(yǎng)環(huán)境溫度為 (20±1)oC，空氣濕度為 (50±5)%，光照為12/12 h 的明暗光照循環(huán)。動(dòng)物自由飲水?dāng)z食，每日更換飲水、飼料，定期更換墊料，保持小鼠生活環(huán)境通風(fēng)及清潔衛(wèi)生。野生型與Trpv1-/-小鼠分別隨機(jī)分為溶劑注射組 (CTRL) 與IBS 模型組 (IBS)，共4 組，每組8～10 只。

2. IBS 內(nèi)臟高敏感模型的建立

各組小鼠在造模前24 h 自由飲水但禁食。使用0.1 ml 三硝基苯磺酸 (trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS) (sigma, P2297) 灌腸液 (TNBS 130 μg/ml 溶于30%乙醇)，緩慢注入IBS 模型組小鼠結(jié)腸。對(duì)照組小鼠使用同樣方法，給予同等劑量的30%乙醇溶液灌腸。參照此前報(bào)道的方法進(jìn)行[19]。

灌腸結(jié)束后，將所有小鼠放回原飼養(yǎng)籠，常規(guī)環(huán)境飼養(yǎng)，正常進(jìn)食進(jìn)水。隨后為28 天的緩解期。緩解期結(jié)束進(jìn)行內(nèi)臟敏感性的檢測(cè)，常規(guī)進(jìn)行小鼠結(jié)腸炎癥水平的評(píng)估。

3. IBS 模型內(nèi)臟敏感性的評(píng)估

采用結(jié)直腸擴(kuò)張 (colorectal distension, CRD)-腹壁撤回反射 (abdominal withdrawal reflex, AWR) 的方法檢測(cè)內(nèi)臟敏感性。

異氟烷（瑞沃德生命科技有限公司，中國(guó)）麻醉小鼠后，潤(rùn)滑球囊并小心緩慢插入小鼠結(jié)腸，至球囊距離肛緣1 cm，并將導(dǎo)管固定于小鼠尾部。將小鼠置于固定器中，保持小鼠只可前后運(yùn)動(dòng)但不能轉(zhuǎn)身。待復(fù)蘇至少40 min 后開始CRD 操作?？焖傧蚯蚰覂?nèi)充氣。將球囊內(nèi)壓力維持在20、40、60及80 mmHg，每個(gè)壓力持續(xù)20 s，重復(fù)3 次，同一壓力每次充氣后為1 min 無(wú)壓力的間歇期。不同壓力之間為5 min 的間歇期。觀察不同壓力的CRD 下，小鼠腹壁撤回反射程度，并根據(jù)Al-Chaer 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相應(yīng)的評(píng)分（見表1）。為保證實(shí)驗(yàn)操作的嚴(yán)謹(jǐn)性，CRD-AWR 檢測(cè)由兩位不同實(shí)驗(yàn)人員依從盲法記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每只小鼠的每個(gè)CRD 壓力重復(fù)記錄3 次并取平均值。

表1 Al-Chaer 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Al-Chaer AWR score

4.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) (open field test, OFT) 及高架十字迷宮 (elevated plus maze, EPM)

通過(guò)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)反映小鼠的焦慮樣行為。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：塑料制箱 （小鼠 50 cm×50 cm ×100 cm 長(zhǎng)×寬×高） 置于安靜的環(huán)境中，照明來(lái)自曠場(chǎng)上方白熾燈。實(shí)驗(yàn)開始前，將實(shí)驗(yàn)用小鼠置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)1 h 后開始實(shí)驗(yàn)。將小鼠放置在曠場(chǎng)中心開始測(cè)試，每只小鼠測(cè)試間隙，用酒精擦拭測(cè)試箱，防止上一只小鼠遺留的氣味或臟物干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。小鼠的行為由攝像頭記錄，中心區(qū)域（小鼠 25 cm×25 cm）停留的時(shí)間、進(jìn)入中心區(qū)域次數(shù)及總運(yùn)動(dòng)距離由ANY-MAZE 軟件進(jìn)行分析。

高架十字迷宮：儀器由四個(gè)大小相同的塑料臂 （小鼠5 cm×35 cm）和一個(gè)中心平臺(tái)（小鼠5 cm×5 cm）組成，其中兩個(gè)相對(duì)的塑料臂為封閉臂，被40 cm 塑料墻封閉。實(shí)驗(yàn)開始前，將實(shí)驗(yàn)用小鼠置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)1 h 后開始實(shí)驗(yàn)。將小鼠至于迷宮中央，頭朝開臂，每只小鼠測(cè)試間隙，用酒精擦拭測(cè)試儀器，防止上一只小鼠遺留的氣味或臟物干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。小鼠的行為由攝像頭記錄，開放臂停留時(shí)間比例、進(jìn)入開放臂次數(shù)及總運(yùn)動(dòng)距離由ANY-MAZE 軟件進(jìn)行分析。

圖1 野生型小鼠溶劑注射組(WT-CTRL)和IBS 模型組(WT-IBS)，造模后第28 天，結(jié)腸H&E 染色圖。結(jié)果顯示，與溶劑注射組(WT-CTRL) 類似，IBS 模 型 組(WT-IBS) 在TNBS 注 射 后28 天，結(jié)腸組織均完整，無(wú)明顯的充血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。標(biāo)尺 = 50 μmFig. 1 H&E (hematoxylin and eosin) staining images of colon tissues 28 d after solvent (WT-CTRL) (left) or TNBS (WT-IBS) (right) injection in wild-type mice. The images show that analogous to the solvent-injected mice, the colon tissues of TNBS-injected mice are intact and no obvious congestion and inflammatory cell infiltration were observed. Scale bar = 50 μm

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1. TRPV1 參與IBS 內(nèi)臟高敏感的形成

參照文獻(xiàn)[19]，選取了單次灌注0.1 ml TNBS 灌腸液（TNBS 130 μg/ml 溶于30%乙醇）的方法構(gòu)建IBS 模型。野生型 (wild type, WT) 小鼠在TNBS 灌注后第28 天，結(jié)腸組織完整，無(wú)明顯的充血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（見圖1），表明本研究所用的TNBS 劑量不會(huì)引起持續(xù)的炎癥反應(yīng)，28 天可認(rèn)為炎癥期結(jié)束。同時(shí)，通過(guò)CRD-AWR 法檢測(cè)了IBS 造模后小鼠內(nèi)臟敏感性的變化。結(jié)果顯示，與溶劑注射組 (WT-CTRL) 相比，IBS 模型組小鼠 (WT-IBS) 在40 mmHg (P < 0.05) 和60 mmHg (P < 0.001) 的壓力下，內(nèi)臟敏感性升高，具有顯著性差異（見圖2）。以上結(jié)果表明，應(yīng)用TNBS 單次灌腸的方法在野生型小鼠成功構(gòu)建了IBS內(nèi)臟高敏感模型。

圖2 WT 小鼠與Trpv1-/-小鼠結(jié)腸灌注 TNBS 前后 CRDAWR 評(píng)分比較非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-Whitney 法，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001Fig. 2 Comparison of the CRD-AWR scores of WT and Trpv1-/- mice after intro-colonic injection of solvent (CTRL) or TNBS (IBS)Mann-Whitney Non-parametric tests, *P < 0.05, **P < 0.01，***P < 0.001.

為進(jìn)一步驗(yàn)證TRPV1 受體參與IBS 模型內(nèi)臟高敏感性的形成，本研究使用Trpv1-/-小鼠構(gòu)建了IBS模型。在TNBS 單次灌腸后第28 天CRD-AWR 法檢測(cè)顯示，Trpv1-/-造模小鼠(Trpv1-/--IBS)與Trpv1-/-溶劑注射組(Trpv1-/--CTRL) 相比，其在20 mmHg (P < 0.001)、40 mmHg (P < 0.05) 和 60 mmHg (P < 0.01) 的壓力下均表現(xiàn)出內(nèi)臟敏感性增加，具有顯著性差異（見圖2）。同時(shí)，與野生型IBS模型組 (WT-IBS) 小鼠相比，Trpv1-/-IBS 模型組 (Trpv1-/--IBS) 小鼠在40 mmHg 的壓力下，表現(xiàn)出內(nèi)臟高敏感性的緩解，差異具有顯著性（P < 0.05，見圖2）。以上結(jié)果表明，TRPV1 受體可參與IBS 內(nèi)臟高敏感性的形成，但內(nèi)臟高敏感并非僅通過(guò)TRPV1 受體這一單一途徑形成，其他機(jī)制也參與其中。

2. TRPV1 參與焦慮情緒的產(chǎn)生

接下來(lái)進(jìn)行了曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)與高架十字迷宮檢測(cè)，觀察IBS 模型小鼠焦慮水平的改變情況。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生型小鼠相比，Trpv1-/-小鼠不管在基礎(chǔ)狀態(tài)還是IBS 造模后，均顯示中心區(qū)停留時(shí)間延長(zhǎng)，具有顯著性差異（P < 0.05，見圖3A），但兩種基因型小鼠均未顯示IBS 造模前后，中心區(qū)停留時(shí)間的變化。類似的，Trpv1-/-小鼠在IBS 造模后 (Trpv1-/--IBS) 與野生型小鼠IBS 造模后 (WT-IBS) 比較顯示，其進(jìn)入中心區(qū)次數(shù)有增加的趨勢(shì)（P = 0.056，見圖3B）?？傔\(yùn)動(dòng)距離的比較顯示，野生型小鼠溶劑注射組和IBS 模型組、Trpv1-/-溶劑注射組和IBS 模型組，各組小鼠之間均無(wú)顯著性差異（見圖3C），提示各組小鼠的運(yùn)動(dòng)能力無(wú)差別。

高架十字迷宮結(jié)果顯示，各組小鼠進(jìn)入開放臂的時(shí)間比例（見圖4A）、開放臂進(jìn)入次數(shù)（見圖4B）及總運(yùn)動(dòng)距離（見圖4C）均無(wú)顯著性差異。

圖3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在基礎(chǔ)狀態(tài)和IBS 造模后，與野生型小鼠相比，Trpv1-/-小鼠中央?yún)^(qū)停留時(shí)間延長(zhǎng)(A)；進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)有增加的趨勢(shì)(B)；總運(yùn)動(dòng)距離無(wú)顯著性變化(C) (two-way ANOVA with Tukey's post-test)Fig. 3 Open field test showed that compared with the wild type mice，both under the basal condition and in the IBS model，Trpv1-/- mice spent more time in central (A); showed an increased tendency in the entries in central (B); and showed no significant change in the total distance travelled (C) (two-way ANOVA with Tukey's post-test).

圖4 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，在基礎(chǔ)狀態(tài)和IBS 造模后，與WT 小鼠比較，Trpv1-/-小鼠的開放臂停留時(shí)間(A)；開放臂進(jìn)入次數(shù)(B)和總運(yùn)動(dòng)距離(C)均無(wú)顯著性變化(two-way ANOVA with Tukey's post-test)Fig. 4 Elevated plus maze assay showed that compared with the wild type mice，both under the basal condition and in the IBS model, there is no significant difference in the time spent in the open arms (A); Entries in the open arms (B) and total distance travelled (C) between WT and Trpv1-/- mice (two-way ANOVA with Tukey's post-test).

討 論

IBS 內(nèi)臟高敏感模型的構(gòu)建方法種類繁多，如束縛應(yīng)激、母嬰分離-避水應(yīng)激、葡聚糖硫酸鈉 (dextran sulfate sodium, DSS) 灌腸、乙酸灌腸等。在眾多方法中，結(jié)腸內(nèi)灌注TNBS 是應(yīng)用最為廣泛的造模方法。TNBS 是一種化學(xué)半抗原，能夠與組織蛋白結(jié)合并刺激Th1 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。該方法能夠較好地模擬IBS 病人的內(nèi)臟高敏感、結(jié)腸動(dòng)力紊亂、黏膜通透性及分泌改變等病理特征。本研究結(jié)果也證實(shí)，應(yīng)用該方法建立的野生型小鼠IBS模型28 天未顯示結(jié)腸炎癥的病理改變，同時(shí)使用CRD-AWR 法檢測(cè)到，IBS 模型組小鼠在40 mmHg和60 mmHg 壓力下內(nèi)臟敏感性升高，表明TNBS單次灌腸方法建立的IBS 模型是探究?jī)?nèi)臟高敏感性的可靠模型。

近些年的多項(xiàng)研究證實(shí)TRPV1 受體與內(nèi)臟高敏感的形成相關(guān)[20]。Akbar 等發(fā)現(xiàn)IBS 病人的乙狀結(jié)腸黏膜中TRPV1 表達(dá)上調(diào)[21]。另一項(xiàng)研究顯示，在結(jié)腸炎康復(fù)期，Trpv1-/-小鼠并未表現(xiàn)出和野生鼠類似的疼痛相關(guān)行為學(xué)改變或結(jié)腸擴(kuò)張的內(nèi)臟動(dòng)力學(xué)改變[22]。在本研究中，使用Trpv1-/-小鼠也成功構(gòu)建了IBS 模型，提示IBS 內(nèi)臟高敏感的形成并非TRPV1 相關(guān)的單一通路所致，其產(chǎn)生是多種因素共同作用的結(jié)果。但與野生型IBS 模型組小鼠相比，敲除Trpv1 基因能夠顯著降低TNBS 灌注引起的內(nèi)臟高敏感性，提示TRPV1 受體是參與IBS 內(nèi)臟高敏感產(chǎn)生的重要分子之一。

臨床上，IBS 病人往往合并焦慮或抑郁狀態(tài)[11]。心理或生理應(yīng)激除誘發(fā)機(jī)體出現(xiàn)焦慮/抑郁情緒，亦可導(dǎo)致機(jī)體對(duì)內(nèi)臟痛覺的感知增加[14]。研究表明，TRPV1 受體與焦慮情緒的產(chǎn)生有關(guān)。除已在多個(gè)腦區(qū)檢測(cè)到TRPV1 受體的表達(dá)外[23]，研究發(fā)現(xiàn)，給予大鼠腹腔注射capsazepine，能夠減少其焦慮樣行為的產(chǎn)生[24], 將capsazepine 微量注射入大鼠腹內(nèi)側(cè)前額葉皮層 (vmPFC) 后可發(fā)揮其抗焦慮作用[25]。

本研究探討了TRPV1 是否可以通過(guò)影響焦慮水平而參與內(nèi)臟敏感性的形成。研究發(fā)現(xiàn)，Trpv1基因敲除小鼠出現(xiàn)基礎(chǔ)焦慮水平的顯著降低，但與對(duì)照組相比，IBS 模型組并未顯示有焦慮水平的升高。Salameh 等[26]的研究發(fā)現(xiàn)：連續(xù)3 周，給予0.25 ml 的不同濃度 (15, 30, 45 mg TNBS) 的TNBS-50%乙醇溶液灌腸，誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型小鼠，其在緩解期的焦慮水平升高。本研究與之結(jié)果不同的原因，我們考慮與TNBS 的灌腸劑量有關(guān)。雖然TNBS 灌腸作為經(jīng)典的感染后IBS (post-infection IBS, PI-IBS)內(nèi)臟高敏感動(dòng)物模型已經(jīng)得到了廣泛的認(rèn)可，但其缺點(diǎn)在于現(xiàn)存的使用TNBS 造模的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，始終無(wú)統(tǒng)一的灌腸劑量與灌腸位置及模型評(píng)估時(shí)間。灌腸位置與劑量的不同，能夠引起不同程度的Th1型細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，造成不同程度的炎癥反應(yīng)。因此我們認(rèn)為本研究所用的TNBS 造模劑量不足以引起小鼠焦慮水平的改變。另一方面，研究表明TRPV1 受體參與焦慮/抑郁情緒的產(chǎn)生。本研究分別借助野生型和Trpv1 敲除的小鼠構(gòu)建了IBS 模型，均檢測(cè)到內(nèi)臟敏感性的升高且Trpv1 基因敲除可緩解IBS 導(dǎo)致的內(nèi)臟高敏感，但是與各自的溶劑注射組相比，并未檢測(cè)到焦慮水平的改變。由于TNBS造模后，Trpv1-/-小鼠在不改變其焦慮水平的情況下，仍然表現(xiàn)出內(nèi)臟高敏感緩解的現(xiàn)象，提示TRPV1受體參與焦慮和內(nèi)臟敏感性的形成可能為兩條不同的通路，不存在相關(guān)性。因此認(rèn)為在TNBS 誘導(dǎo)的IBS 模型中，TRPV1 受體可能通過(guò)非焦慮依賴的機(jī)制參與內(nèi)臟高敏感形成。

在本研究中，沒能在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Trpv1-/-小鼠焦慮水平的改變。針對(duì)這種曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致的現(xiàn)象，我們認(rèn)為可能的原因是在于曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)后再次進(jìn)行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)，小鼠對(duì)這種刺激已經(jīng)產(chǎn)生適應(yīng)，所以并未在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生明顯差異。類似的情況在此前的一項(xiàng)關(guān)于TNBS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎緩解期焦慮水平的研究中也有報(bào)道[26]。因此，接下來(lái)會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)樣本量，確認(rèn)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，TRPV1 參與IBS 內(nèi)臟高敏感的形成，也影響焦慮狀態(tài)的形成。但在TNBS 模型中其影響內(nèi)臟高敏感形成的過(guò)程可能主要是通過(guò)非焦慮依賴的機(jī)制參與。今后若需進(jìn)一步探尋TRPV1 受體通過(guò)焦慮影響內(nèi)臟敏感性的產(chǎn)生，可以嘗試增加TNBS 灌腸劑量或使用其他化學(xué)誘導(dǎo)法如葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium, DSS)灌腸、乙酸灌腸的造模方法，比較WT 鼠與Trpv1-/-鼠構(gòu)建IBS 模型后的差異。在觀察到內(nèi)臟敏感性與焦慮水平有所改變的基礎(chǔ)上，繼續(xù)比較灌腸給藥和腦室注射TRPV1 拮抗劑后內(nèi)臟敏感性水平改變的差異，以期能更準(zhǔn)確的說(shuō)明中樞和外周TRPV1 受體在此中發(fā)揮的作用。