王麗娟，王寧寧，王 樂(lè)，李 芬,2，劉曉強(qiáng)，王 妍，李勤凡,2

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

大腸桿菌是常見(jiàn)病原體，尤其是在水清潔度不夠及畜舍衛(wèi)生條件差的養(yǎng)殖場(chǎng)[1]。糞便中的大腸桿菌易通過(guò)氣溶膠擴(kuò)散到外部環(huán)境，污染附近的空氣、水和土壤，進(jìn)一步對(duì)公共環(huán)境和人類(lèi)健康構(gòu)成潛在威脅[2]。氟喹諾酮類(lèi)藥物(fluoroquinolones，F(xiàn)Qs)作為一類(lèi)廣譜抗生素，在治療由革蘭氏陰性菌引起的疾病中發(fā)揮著重要作用[3]。然而，F(xiàn)Qs的廣泛使用和濫用，導(dǎo)致耐藥大腸桿菌出現(xiàn)和快速傳播[4]。細(xì)菌耐FQs的最常見(jiàn)機(jī)制包括喹諾酮耐藥決定區(qū)(quinolone resistant determining region，QRDR)基因突變和質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類(lèi)耐藥(plasmid-mediated quinolone resistant，PMQR)基因流行[5-6]。對(duì)大腸桿菌而言，耐FQs的原因主要是QRDR突變，尤其是gyrA和parC基因編碼的氨基酸突變[7]。PMQR基因最早于1998年被發(fā)現(xiàn)[8]，研究表明，qnrS、aac(6′)-Ib-cr是最常見(jiàn)的PMQR基因[2,9]。雖然PMQR基因僅賦予大腸桿菌低FQs抗性，但其在腸桿菌中可以水平擴(kuò)散，并且被認(rèn)為是QRDR突變產(chǎn)生的有利條件[10]。

由于PMQR基因可以通過(guò)相互接觸、水及土壤污染從動(dòng)物傳播給人類(lèi)，同時(shí)該基因可以增加QRDR的突變機(jī)率，因此其對(duì)人或動(dòng)物大腸桿菌病的防治有重要影響。目前，關(guān)于牛源大腸桿菌PMQR基因和QRDR突變的檢測(cè)研究較少。本試驗(yàn)從犢牛糞便分離鑒定大腸桿菌，通過(guò)測(cè)定其對(duì)3種常用FQs的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，檢測(cè)PMQR基因與QRDR突變，為合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品采集 選取陜西寶雞、渭南、咸陽(yáng)和楊凌4個(gè)規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)的腹瀉犢牛進(jìn)行采樣。首先對(duì)犢牛肛門(mén)周?chē)M(jìn)行消毒，隨后用無(wú)菌棉簽采集腹瀉犢牛直腸內(nèi)糞便，將沾有糞便的棉簽放入無(wú)菌離心管保存，立即低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行大腸桿菌分離。

1.1.2 藥物和試劑 恩諾沙星(ENR)、環(huán)丙沙星(CIP)和諾氟沙星(NOR)，購(gòu)自索來(lái)寶公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；酵母提取物、胰蛋白粉、氯化鈉購(gòu)自O(shè)XOID公司；瓊脂糖購(gòu)自Hydra Gene公司；DL2000 DNA Marker和2×rTaqMix購(gòu)自TaKaRa公司；大腸桿菌ATCC 25922購(gòu)自杭州濱和微生物有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn) 將糞便樣品稀釋并涂布至麥康凱培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取粉紅色菌落進(jìn)一步分離和純化，最后使用大腸桿菌phoA基因特異性引物[11](表1)進(jìn)行鑒定。PCR反應(yīng)體系為：菌液2 μL，上游引物(F)0.5 μL，下游引物(R)0.5 μL，2×rTaqMix 10 μL，雙蒸水7 μL，總體積 20 μL。將菌液替換為雙蒸水設(shè)立陰性對(duì)照，其他體系不變。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。分離的大腸桿菌用體積分?jǐn)?shù)25%甘油于-80 ℃保存?zhèn)溆?。以大腸桿菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌，根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSL)推薦的微量肉湯稀釋法[12]，測(cè)定ENR、CIP、NOR 3種FQs對(duì)大腸桿菌分離株的MIC。3種FQs的MIC耐藥折點(diǎn)分別為：恩諾沙星(ENR)≥2 μg/mL，環(huán)丙沙星(CIP)≥4 μg/mL，諾氟沙星(NOR)≥16 μg/mL。

1.2.2 牛源大腸桿菌PMQR基因及QRDR突變的檢測(cè) 本試驗(yàn)涉及的PMQR基因包括qnr家族基因qnrA、qnrB、qnrD和qnrS，氨基糖苷乙轉(zhuǎn)移酶基因aac(6′)-Ib和喹諾酮類(lèi)藥物特異性外排泵基因qepA；QRDR突變基因包括編碼DNA旋轉(zhuǎn)酶的gyrA和編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的parC。備檢基因引物序列[13]由生工生物工程股份有限公司(生工)合成(表1)。PCR反應(yīng)體系及陰性對(duì)照的設(shè)立同1.2.1節(jié)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸15～40 s(gyrA17 s，parC17 s，qnrA38 s，qnrB30 s，qnrD35 s，qnrS40 s，aac(6′)-Ib30 s，qepA15 s)，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將aac(6′)-Ib基因PCR產(chǎn)物送生工進(jìn)行測(cè)序，并通過(guò)NCBI網(wǎng)站比對(duì)確定其亞型(aac(6′)-Ib-cr)。將gyrA和parC的PCR產(chǎn)物送至生工進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序所得核酸序列通過(guò)ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)翻譯為氨基酸序列，并通過(guò)DNAMAN軟件與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)錄入的E.coli-k12的gyrA和parC氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，分析QRDR突變情況。

表1 試驗(yàn)所用引物的信息Table 1 Sequences of primers used in this study

1.2.3 恩諾沙星(ENR)誘導(dǎo)試驗(yàn) 選取攜帶PMQR基因且QRDR未突變(2株)、不攜帶PMQR基因且QRDR未突變(2株)的大腸桿菌在含ENR的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，ENR初始誘導(dǎo)質(zhì)量濃度為0.25 μg/mL，若菌株生長(zhǎng)良好，第2天ENR濃度2倍遞增繼續(xù)誘導(dǎo)，以此類(lèi)推直至第10天；以在不加ENR的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第10天的菌株作為對(duì)照。PCR擴(kuò)增誘導(dǎo)和對(duì)照菌株的gyrA、parC基因，將PCR產(chǎn)物送至生工測(cè)序后比對(duì)分析gyrA和parC基因是否發(fā)生突變。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌的鑒定及藥敏試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)共分離到75株菌，經(jīng)PCR檢測(cè)均擴(kuò)增到468 bp的phoA基因，故確定其均為大腸桿菌，部分大腸桿菌phoA基因的鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1。

M.DNA Marker；1～8.分離菌株；9.陰性對(duì)照M.DNA Marker；1-8.Isolated strains；9.Negative control圖1 牛源分離菌株phoA基因的PCR擴(kuò)增(部分結(jié)果)Fig.1 PCR amplification of phoA gene from bovine isolated strains (partial results)

MIC試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，60.00%(45/75)的菌株對(duì)至少2種FQs耐藥，其中40.00%(30/75)的菌株對(duì)ENR、CIP、NOR均耐藥，且對(duì)ENR的耐藥程度較為嚴(yán)重(60.00%)。

2.2 PMQR基因及QRDR突變檢測(cè)結(jié)果

PMQR基因PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，75株大腸桿菌均未檢測(cè)到qnrA、qnrD、qepA，檢測(cè)出qnrS(642 bp)、aac(6′)-Ib亞型aac(6′)-Ib-cr(482 bp)和qnrB(469 bp)，部分菌株的PMQR基因檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。61.33%(46/75)的大腸桿菌菌株至少攜帶1個(gè)PMQR基因，其中以qnrS(45.33%，34/75)和aac(6′)-Ib-cr(21.33%，16/75)最為常見(jiàn)(表2)。

M.DL2000 DNA Marker；1,2.qnrS基因；3,4.qnrB基因；5,6.aac(6′)-Ib-cr基因；7.陰性對(duì)照M.DL2000 DNA Marker；1，2.qnrS gene；3，4.qnrB gene；5，6.aac(6′)-Ib-cr gene；7.Negative control圖2 牛源大腸桿菌PMQR基因的PCR擴(kuò)增(部分結(jié)果)Fig.2 PCR amplification of PMQR gene from bovine E. coli (partial results)

GyrA和ParC氨基酸序列比對(duì)分析的部分結(jié)果如圖3所示。

a.ParC氨基酸比對(duì)；b.GyrA氨基酸比對(duì)。1.E.coli-k12；2～10.不同的菌株。S.絲氨酸，D.天冬氨酸，L.亮氨酸，N.天冬酰胺，Y.酪氨酸，I.異亮氨酸，E.谷氨酸，G.甘氨酸a.ParC amino acid alignment;b.GyrA amino acid alignment.1.E.coli-k12；2-10.Different strains.S.Serine；D.Aspartic acid，L.Leucine，N.Asparagine，Y.Tyrosine，I.Isoleucine，E.Glutamic acid，G.Glycine圖3 牛源大腸桿菌parC和gyrA基因編碼氨基酸的突變分析(部分結(jié)果)Fig.3 Mutation analysis of amino acids encoded by parC and gyrA genes from bovine E.coli (partial results)

由表2可知，58.67%(44/75)的大腸桿菌發(fā)生了QRDR突變；43株菌發(fā)生了GyrA氨基酸的突變，其中90.70%(39/43)為Ser83Leu+Asp87Asn突變，6.70%(3/43)為Ser83Leu+Asp87Tyr突變，2.33%(1/43)為Ser83Leu單突變；43株菌發(fā)生了ParC氨基酸突變，其中93.02%(40/43)為Ser80Ile單突變，6.98%(3/43)為Ser80Ile+Glu84Gly突變。在發(fā)生QRDR突變的大腸桿菌中，有95.45%(42/44)的菌株同時(shí)發(fā)生了GyrA和ParC氨基酸突變，其中最常見(jiàn)的突變組合為GyrA:(Ser83Leu+Asp87Asn)+ParC:Ser80Ile。

表2 75株牛源大腸桿菌的耐藥表型、PMQR基因及QRDR突變檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of resistant phenotypes,PMQR genes,and QRDR mutations in 75 E.coli strains

分析75株大腸桿菌的耐藥表型與PMQR基因及QRDR突變的關(guān)系，結(jié)果表明發(fā)生QRDR突變且攜帶PMQR基因的菌株對(duì)ENR、CIP、NOR均耐藥；PMQR基因單獨(dú)存在的菌株耐藥性不強(qiáng)，但是QRDR突變與PMQR基因共存時(shí)，NOR、ENR和CIP的MIC較僅發(fā)生QRDR突變的菌株分別增加了4～32，4～16和2～16倍(表2)。

2.3 恩諾沙星誘導(dǎo)結(jié)果

恩諾沙星(ENR)誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果表明，攜帶PMQR基因且QRDR未突變的1株菌，在ENR誘導(dǎo)第2天時(shí)gyrA基因第521、539位的堿基由T變?yōu)镃，另1株菌在誘導(dǎo)第3天時(shí)gyrA基因第567、599位的堿基由C變?yōu)門(mén)、第513位的堿基由T變?yōu)镚；對(duì)照菌株僅在培養(yǎng)第2天時(shí)有1株菌gyrA基因第521位的堿基由T變?yōu)镃，另1株菌gyrA基因第599位的堿基由C變?yōu)門(mén)。以上堿基突變并未引發(fā)氨基酸突變，為沉默突變。攜帶PMQR基因且QRDR未突變的菌株，經(jīng)恩諾沙星誘導(dǎo)后parC基因未發(fā)生突變。不攜帶PMQR基因且QRDR未突變的菌株，在恩諾沙星誘導(dǎo)后未發(fā)生任何突變。

3 討論與結(jié)論

自1960年以來(lái)，在臨床上由大腸桿菌引起的疾病多使用FQs治療[13]，該類(lèi)抗生素主要通過(guò)抑制細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶-IV的活性而抑制細(xì)菌DNA合成，從而發(fā)揮抑菌作用[14]。研究表明，隨著FQs的大量使用甚至濫用，多數(shù)病原體對(duì)FQs的敏感性逐漸降低[15-17]，導(dǎo)致臨床治療面臨極大的挑戰(zhàn)。本試驗(yàn)從腹瀉犢牛糞便中分離得到75株大腸桿菌，其中60.00%(45/75)的菌株至少耐2種FQs，40.00%的菌株對(duì)ENR、CIP、NOR均耐藥，其中對(duì)ENR的耐藥程度較為嚴(yán)重(60.00%)，這可能與ENR作為動(dòng)物專(zhuān)用藥在養(yǎng)殖場(chǎng)使用較為頻繁有關(guān)。

QRDR突變是大腸桿菌耐FQs的主要原因，其主要通過(guò)抑制FQs與細(xì)菌DNA和酶復(fù)合物的結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥。gyrA基因編碼的氨基酸突變位點(diǎn)通常為第67～106位[18-19]，parC基因編碼的氨基酸突變位點(diǎn)通常發(fā)生于第71～110位[20]。研究表明，gyrA基因編碼的第83、87位以及parC基因編碼的第80、84位氨基酸的突變與FQs耐藥密切相關(guān)[21-22]。本研究結(jié)果顯示，牛源大腸桿菌有58.67%(44/75)發(fā)生了QRDR的突變，其中95.45%(42/44)的菌株同時(shí)發(fā)生了GyrA和ParC氨基酸突變。趙鳳菊等[23]研究表明，動(dòng)物源大腸桿菌GyrA氨基酸突變主要為Ile87Val、Leu101Met，ParC氨基酸突變主要為Ser80Ile；曹立亭等[24]研究表明，養(yǎng)殖環(huán)境中大腸桿菌的GyrA突變以Ser83Leu、Asp87Asn最常見(jiàn)。Nishikawa等[25]研究表明，日本雞源大腸桿菌GyrA突變以Ser83Leu、Asp87Asn為主，ParC以Ser80Ile最盛行。綜上可知，QRDR突變多出現(xiàn)在GyrA、ParC的氨基酸上，且以GyrA第83、87位及ParC第80位居多，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

雖然PMQR基因僅導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)FQs低水平耐藥，但由于其通過(guò)質(zhì)粒介導(dǎo)，可以在不同菌株甚至不同種屬間水平轉(zhuǎn)移[13]，這對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物的健康來(lái)說(shuō)都是一個(gè)不可忽視的隱患。本研究結(jié)果表明，61.33%的大腸桿菌至少攜帶1個(gè)PMQR基因，其中qnrS和aac(6′)-Ib-cr基因最常見(jiàn)；并且存在多個(gè)PMQR基因共存于同一分離株中的現(xiàn)象，這在很大程度上提高了大腸桿菌對(duì)FQs的抗性，這與Wu等[2]及Mitra等[18]的研究結(jié)果一致。此外，QRDR突變與PMQR基因共存菌株比僅有QRDR突變菌株對(duì)FQs的耐藥性更強(qiáng)，QRDR突變與qnrS+aac(6′)-Ib-cr共存的菌株比單獨(dú)攜帶qnrS或aac(6′)-Ib-cr的菌株MIC更高，這與Piekarska等[26]的報(bào)道一致。

gyrA、parC是QRDR最容易發(fā)生突變的2個(gè)基因，已有研究表明含PMQR基因的接合子在CIP誘導(dǎo)后會(huì)出現(xiàn)GyrA蛋白第83、87位氨基酸突變[16]。本研究通過(guò)ENR誘導(dǎo)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PMQR陽(yáng)性菌的gyrA基因出現(xiàn)5處堿基突變，且皆為沉默突變，未出現(xiàn)相應(yīng)氨基酸的突變，表明在低劑量ENR存在的情況下，PMQR基因的存在一定程度上會(huì)影響gyrA基因序列的穩(wěn)定性。PMQR陰性菌未發(fā)生突變。

以上結(jié)果表明，QRDR突變是大腸桿菌耐FQs的主要原因，PMQR基因僅賦予其低FQs抗性，但QRDR突變與PMQR基因共存一定程度上會(huì)加重耐藥菌的耐藥程度；此外，PMQR基因會(huì)增加gyrA基因序列的突變機(jī)率，尤其是ENR存在的情況下。因此臨床上合理使用該類(lèi)藥物就顯得十分必要，一旦造成致病性大腸桿菌發(fā)生QRDR突變，將可能導(dǎo)致該類(lèi)藥物治療無(wú)效。