王立波，邵澤強(qiáng)，陸文龍

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132101；2.吉林化工學(xué)院 資源與環(huán)境工程學(xué)院，吉林 吉林 132022；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

吉林省地處我國(guó)東北農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)[1]，是我國(guó)重要的商品糧和畜牧業(yè)生產(chǎn)基地，為我國(guó)的社會(huì)穩(wěn)定發(fā)展提供了有力保障。但是，長(zhǎng)期的集約化種植和過(guò)量施用化學(xué)氮肥對(duì)該地區(qū)的糧食產(chǎn)量和土壤生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了負(fù)面影響[2]，嚴(yán)重制約了當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)發(fā)展。因此，如何調(diào)整作物種植結(jié)構(gòu)和減量施用化學(xué)氮肥是該地區(qū)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展面臨的主要問(wèn)題。間作種植模式因其在我國(guó)具有悠久的歷史和諸多的優(yōu)勢(shì)成為當(dāng)前解決上述問(wèn)題的主要途徑[3]，尤其是禾豆間作在氮素高效利用方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。玉米和紫花苜蓿是該地區(qū)主要的糧食作物和豆科牧草，玉米/紫花苜蓿間作具有廣闊的應(yīng)用前景。

禾豆間作能夠利用豆科作物的生物固氮特性[4]，將空氣的氮?dú)夤潭ㄞD(zhuǎn)變成生長(zhǎng)需要的銨態(tài)氮，更重要的是豆科作物還能將固定的一部分氮素轉(zhuǎn)移給與之間作的作物吸收利用[5]。這樣在生產(chǎn)中就能達(dá)到減少氮肥施用量的目的[6-7]。大量研究發(fā)現(xiàn)，在禾豆間作體系中，豆科作物的結(jié)瘤數(shù)量、質(zhì)量和固氮量得到提高[8-11]。LI等[12]發(fā)現(xiàn)，與豌豆單作相比，玉米/豌豆間作體系可以使豌豆的根瘤數(shù)量和質(zhì)量分別增加29.63%和48.21%。采用15N自然豐度法研究玉米/蠶豆間作系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，與蠶豆單作相比，玉米/蠶豆間作體系可以使蠶豆的單株根瘤的質(zhì)量平均增加22.5%，同時(shí)在初花期、盛花期、鼓粒期和成熟期的固氮量分別提高8%～33%、54%～61%、18%～50%和7%～72%，說(shuō)明間作增強(qiáng)了蠶豆根瘤的固氮能力[11]。發(fā)生上述現(xiàn)象的主要機(jī)制可能是在禾豆間作體系中根系接觸產(chǎn)生了一系列的生理生化反應(yīng)，從而促進(jìn)了豆科固氮能力的增強(qiáng)[13]。由此可見(jiàn)，間作體系中作物之間的距離是影響豆科作物生物固氮能力的重要因素[4]。SUN等[14]研究發(fā)現(xiàn)，根系形態(tài)的變化是影響玉米/紫花苜蓿間作體系中氮素高效利用的重要因素。由此可見(jiàn)，根系形態(tài)是影響作物氮素吸收和生長(zhǎng)的重要因素[15]。然而，在玉米/紫花苜蓿間作體系中，根系形態(tài)的改變是否也同樣影響紫花苜蓿根瘤的固氮能力到目前為止還未見(jiàn)報(bào)道。為此，探究施氮和根系分割對(duì)玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿根系形態(tài)和固氮特征的影響，為充分挖掘豆科作物的生物固氮潛力、降低化學(xué)氮肥施用量以及現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供重要理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)概況及試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2016年在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代化溫室(43°56′30″N、126°27′55″E，海拔190 m)中進(jìn)行，該區(qū)屬于溫帶大陸性季風(fēng)氣候，四季分明，雨熱同期。試驗(yàn)作物生長(zhǎng)季內(nèi)的平均氣溫19.4 ℃，無(wú)霜期130 d，降雨量約498.4 mm，積溫2 600 ℃。供試土壤為黑土，具體理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

供試玉米和紫花苜蓿品種分別為鄭單958(由吉林省四平市神農(nóng)種業(yè)有限公司提供)和東苜1號(hào)(由東北師范大學(xué)草地所提供)。供試紫花苜蓿根瘤菌液由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院微生物教研室提供，含根瘤菌數(shù)3.0×107個(gè)/mL。供試肥料由吉林隆源農(nóng)業(yè)股份有限公司提供，氮肥是尿素(含N 46%)，磷肥為過(guò)磷酸鈣(含P2O546%)，鉀肥為氯化鉀(含K2O 60%)。

表1 供試土壤的理化性質(zhì)Tab.1 Physical and chemical properties of the tested soil

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用盆栽試驗(yàn)，每個(gè)盆(45 cm×30 cm×50 cm)中裝51 kg干土，播種2～3粒玉米種子，在玉米二葉期開(kāi)始間苗，每個(gè)盆中只保留1株玉米。紫花苜蓿播種量為18 kg/hm2，在苗期進(jìn)行定植和間苗。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)2個(gè)施氮水平：不施氮(N0)和施氮(N1)，3種根系分隔模式：塑料板分隔(PSS)、尼龍網(wǎng)分隔(NNS)、根系完全不分隔(NS)，每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù)。為了確保紫花苜蓿在試驗(yàn)過(guò)程中能夠充分結(jié)瘤，紫花苜蓿間苗后在其根部澆灌20 mL/盆的根瘤菌液。為了同時(shí)滿足玉米和紫花苜蓿生長(zhǎng)的需要，施N 225.0 kg/hm2、P2O5135.0 kg/hm2、K2O 90.0 kg/hm2。根據(jù)上述施肥量進(jìn)行換算，盆栽N1處理的N、P2O5、K2O施用量分別為0.20、0.12、0.08 g/kg，N0處理P2O5、K2O施用量同N1處理。播種時(shí)間為6月1日，紫花苜蓿根系挖掘時(shí)間為10月18日，紫花苜蓿接種根瘤菌時(shí)間為6月18日。適時(shí)灌水以滿足供試作物對(duì)水分的需求，除草和病蟲(chóng)害的防治等措施均按當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)生產(chǎn)進(jìn)行。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 根系形態(tài)指標(biāo) 玉米成熟期，采用挖掘法將紫花苜蓿根系整體挖出，抖落根系上附著的大土塊，將根系放到紗網(wǎng)中用水管沖洗干凈，并帶回實(shí)驗(yàn)室，用吸水紙將根系上的水吸干，并用剪子剪成等長(zhǎng)度的根段，保存在75%的乙醇中，然后用Epson(V800)掃描儀掃描根系，掃描圖片用WinRHIZO根系分析系統(tǒng)(Regent公司,Canada,2013)進(jìn)行分析，獲得紫花苜蓿的根長(zhǎng)、根表面積、根體積等指標(biāo)。本研究將根系直徑設(shè)置4個(gè)莖級(jí)，D1：0<直徑≤0.5 mm，D2：0.5 mm<直徑≤1 mm，D3：1 mm<直徑≤1.5 mm，D4：直徑>1.5 mm。

1.3.2 根瘤數(shù)、根瘤干質(zhì)量及豆血紅蛋白含量 10月18日開(kāi)始取樣，采用挖掘法用鐵锨挖約50 cm 深，取出整株紫花苜蓿 10 株置于編織袋上，輕輕抖落根上的土，收集掉落的根瘤，并將抖落土中的根瘤挑選干凈。將取回的樣品放在0.15 mm篩中用流水沖洗，摘可見(jiàn)根瘤，計(jì)數(shù)，風(fēng)干，測(cè)定根瘤干質(zhì)量；紫花苜蓿根瘤的豆血紅蛋白含量參照WANG等[4]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 固氮率及固氮量 本研究采用自然豐度法測(cè)定紫花苜蓿的固氮率，計(jì)算方法參考SHEARER等[16]的公式。

式中，δ15N為植物地上部15N豐度相對(duì)于大氣15N豐度的變化，B為紫花苜蓿在沙培試驗(yàn)中不施氮條件下植株中的15N自然豐度值。在前期研究中獲知B值為-0.92[4]。

固氮量采用下面公式[4]進(jìn)行計(jì)算：

固氮量=固氮率×紫花苜蓿干質(zhì)量×紫花苜蓿氮含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、統(tǒng)計(jì)和分析，采用SAS 9.2雙因素ANOVA分析和多重比較法(Tukey’s HSD)檢驗(yàn)各處理間的差異顯著性，采用GraphPad Prism 6.02繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 施氮和根系分隔對(duì)玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿不同莖級(jí)根系形態(tài)的影響

由圖1可知，施氮能夠增加紫花苜蓿根系不同莖級(jí)根長(zhǎng)。與N0處理相比，施氮處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個(gè)莖級(jí)根長(zhǎng)分別增加42.4%、14.6%、0.7%、31.8%。其中，D1莖級(jí)根長(zhǎng)增加幅度最大，D3莖級(jí)增加幅度最小。在4個(gè)莖級(jí)中，D1莖基所占比例最大，D3莖級(jí)所占比例最小。

根系分隔增加紫花苜蓿4個(gè)莖級(jí)的根長(zhǎng)(圖1)。在N0條件下，與PSS處理相比，NS和NNS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個(gè)莖級(jí)根長(zhǎng)分別降低19.0%、22.4%、22.7%、40.2%和9.2%、19.5%、16.2%、9.5%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個(gè)莖級(jí)根長(zhǎng)分別降低10.7%、3.6%、7.8%、33.9%。在N1條件下，與PSS處理相比，NS和NNS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個(gè)莖級(jí)根長(zhǎng)分別降低17.5%、32.3%、26.7%、19.1%和12.0%、21.8%、13.9%、2.6%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個(gè)莖級(jí)根長(zhǎng)分別降低6.3%、13.5%、14.8%、16.9%。

施氮能夠增加紫花苜蓿根系不同莖級(jí)根表面積(圖1)。與N0處理相比，施氮處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個(gè)莖級(jí)根表面積分別增加17.9%、7.9%、19.3%、28.6%。其中，D4莖級(jí)根表面積增加幅度最大，D2莖級(jí)增加幅度最小。4個(gè)莖級(jí)中，根表面積以D4莖級(jí)所占比例最大，D3莖級(jí)所占比例最小。

根系分隔方式增加紫花苜蓿4個(gè)莖級(jí)根表面積(圖1)。在N0條件下，與PSS處理相比，NS和NNS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個(gè)莖級(jí)根表面積分別降低19.5%、18.0%、36.4%、42.6%和5.6%、5.1%、10.3%、30.4%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個(gè)莖級(jí)根表面積分別降低14.7%、13.6%、29.1%、17.6%。在N1條件下，與PSS處理相比，NS和NNS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個(gè)莖級(jí)根表面積分別降低24.1%、12.8%、41.1%、35.2%和16.7%、6.1%、28.2%、10.2%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個(gè)莖級(jí)根表面積分別降低8.8%、7.1%、17.9%、27.9%。

施氮能夠增加紫花苜蓿根系不同莖級(jí)根體積(圖1)。與N0處理相比，施氮處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個(gè)莖級(jí)根體積分別增加8.1%、32.3%、4.7%、22.3%。其中，D2莖級(jí)根體積增加幅度最大，D3莖級(jí)增加幅度最小。4個(gè)莖級(jí)中，根體積以D4莖級(jí)所占比例最大，D1莖級(jí)所占比例最低(圖1)。

根系分隔增加紫花苜蓿4個(gè)莖級(jí)根體積(圖1)。在N0條件下，與PSS處理相比，NS和NNS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個(gè)莖級(jí)根體積分別降低48.1%、21.6%、14.7%、63.0%和30.4%、12.4%、7.5%、43.8%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個(gè)莖級(jí)根體積分別降低25.4%、10.4%、7.8%、34.2%。在N1條件下，與PSS處理相比，NS和NNS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個(gè)莖級(jí)根體積分別降低32.7%、28.1%、18.0%、50.4%和42.2%、8.2%、12.2%、31.5%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿根系D1、D2、D3、D4四個(gè)莖級(jí)根體積分別降低16.5%、21.7%、6.6% 27.5%。

總之，在玉米/紫花苜蓿間作體系中，施氮能促進(jìn)紫花苜蓿不同莖級(jí)根長(zhǎng)、根表面積、根體積增加，根長(zhǎng)以D1增幅最大，根表面積以D4莖級(jí)增幅最大，根體積以D2莖級(jí)增幅最大；根系分隔能促進(jìn)紫花苜蓿根長(zhǎng)、根表面積、根體積增加，對(duì)D4莖級(jí)影響最大，相反的，根系不分割會(huì)抑制紫花苜蓿根系生長(zhǎng)。

2.2 施氮和根系分隔對(duì)玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿根瘤數(shù)、根瘤干質(zhì)量的影響

施氮水平、根系分隔方式以及二者的交互作用對(duì)紫花苜蓿根瘤數(shù)、根瘤干質(zhì)量的影響均達(dá)到顯著、極顯著水平(表2)。由表2可知，與N0處理相比，N1處理紫花苜蓿的根瘤數(shù)、根瘤干質(zhì)量分別降低33.8%、64.5%。N0條件下，與PSS處理相比，NS和NNS處理紫花苜蓿的根瘤數(shù)、根瘤干質(zhì)量分別增加69.5%、76.4%和49.3%、61.4%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿的根瘤數(shù)、根瘤干質(zhì)量分別增加13.5%、9.3%。N1條件下，與PSS處理相比， NS和NNS處理紫花苜蓿的根瘤數(shù)、根瘤干質(zhì)量分別增加45.5%、97.6%和42.8%、45.5%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿的根瘤數(shù)、根瘤干質(zhì)量分別增加1.9%、35.8%。

2.3 施氮和根系分隔對(duì)玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿固氮量和固氮率的影響

施氮水平、根系分隔方式以及二者的交互作用對(duì)紫花苜蓿的固氮率和固氮量影響極顯著(表3)。由表3可知，與N0處理相比， N1處理紫花苜蓿的固氮率和固氮量分別降低29.4%和17.0%。在N0條件下，與PSS處理相比，NS和NNS處理紫花苜蓿的固氮率、固氮量分別增加148.2%、52.9%和66.0%、41.9%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿的固氮率、固氮量分別增加49.5%和7.8%。在N1條件下，與PSS處理相比，NS和NNS處理紫花苜蓿的固氮率、固氮量分別增加105.5%、30.0%和58.6%、26.2%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿的固氮率、固氮量分別增加29.6%、2.9%。

2.4 施氮和根系分隔對(duì)玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿根瘤豆血紅蛋白含量的影響

由圖2可知，與N0處理相比， N1處理紫花苜蓿的根瘤豆血紅蛋白含量降低55.4%。在N0條件下，與PSS處理相比，NS和NNS處理紫花苜蓿的根瘤豆血紅蛋白含量分別增加73.3%和43.3%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿的根瘤豆血紅蛋白含量增加20.9%。在N1條件下，與PSS處理相比，NS和NNS處理紫花苜蓿的根瘤豆血紅蛋白含量分別增加42.6%和18.2%；與NNS處理相比，NS處理紫花苜蓿的根瘤豆血紅蛋白含量增加20.7%。

表2 施氮和根系分隔對(duì)紫花苜蓿根瘤數(shù)量和干質(zhì)量的影響Tab.2 Effects of nitrogen application levels and root separation patterns on the number and dry weight of alfalfa nodules

表3 施氮和根系分隔對(duì)紫花苜蓿固氮率和固氮量的影響Tab.3 Effects of nitrogen application levels and root separation patterns on the nitrogen fixation rate and nitrogen fixation amount of alfalfa nodules

2.5 玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿固氮率與其根瘤數(shù)、根瘤干質(zhì)量、豆血紅蛋白含量、根系形態(tài)的相關(guān)分析

由圖3可知，無(wú)論施氮與否，玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿固氮率與根瘤數(shù)(N0：R2=0.747 9,P<0.01；N1:R2=0.581 5,P<0.01)、根瘤干質(zhì)量(N0：R2=0.642 6,P<0.01；N1:R2=0.555 4,P<0.01)、根瘤豆血紅蛋白含量(N0：R2=0.916 2,P<0.01；N1:R2=0.745 0,P<0.01)均呈極顯著正相關(guān)，與紫花苜蓿根長(zhǎng)(N0：R2=0.834 2,P<0.01；N1:R2=0.655 8,P<0.01)、根表面積(N0：R2=0.830 0,P<0.01；N1:R2=0.773 3,P<0.01)、根體積(N0：R2=0.892 3,P<0.01；N1:R2=0.923 8,P<0.01)均呈極顯著負(fù)相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

施氮能夠促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[17]，在本試驗(yàn)中也取得了類似的結(jié)果。但是，在本研究中，施氮降低了紫花苜蓿的根瘤數(shù)、根瘤干質(zhì)量、固氮率、固氮量和根瘤豆血紅蛋白含量，說(shuō)明施氮會(huì)抑制玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿的固氮能力，存在“氮阻遏”現(xiàn)象[8]。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)該調(diào)控好氮肥的施用量，以使紫花苜蓿的生物固氮能力達(dá)到最大化。

本研究還發(fā)現(xiàn)，無(wú)論施氮與否，3種根系分隔條件下紫花苜蓿的根瘤數(shù)、根瘤干質(zhì)量、固氮率、固氮量和根瘤豆血紅蛋白含量都存在顯著的差異。紫花苜蓿的根瘤量、根瘤干質(zhì)量、固氮率、固氮量和根瘤豆血紅蛋白含量均表現(xiàn)為NS>NNS>PSS。說(shuō)明玉米/紫花苜蓿間作體系中存在明顯的種間交互作用，這在蠶豆/玉米間作體系中也得到了驗(yàn)證[8]，同時(shí)也說(shuō)明在NS條件下存在明顯的種間競(jìng)爭(zhēng)作用[18]，而前人的研究表明，在禾豆間作體系中禾本科作物的競(jìng)爭(zhēng)能力一般大于豆科作物[19-20]，種間的競(jìng)爭(zhēng)促進(jìn)了紫花苜蓿的生物固氮能力。3種根系分隔方式在施氮條件下都存在明顯的“氮阻遏”現(xiàn)象，3種根系分隔方式下紫花苜蓿的根瘤數(shù)、根瘤干質(zhì)量、固氮率、固氮量和根瘤豆血紅蛋白含量均是在PSS條件下最低，在NS條件下最高。這說(shuō)明，玉米/紫花苜蓿間作具有明顯的減緩“氮阻遏”效應(yīng)，這與玉米/蠶豆間作系統(tǒng)中獲得的試驗(yàn)結(jié)果是一致的[8]。另外，NS和NNS條件下，紫花苜蓿的根瘤數(shù)、根瘤干質(zhì)量、固氮率、固氮量和根瘤豆血紅蛋白含量也都有不同程度的差異，這說(shuō)明，在玉米/紫花苜蓿間作體系中除了水分和養(yǎng)分的流動(dòng)能夠影響紫花苜蓿的生長(zhǎng)和生物固氮能力之外，根系接觸也是影響紫花苜蓿生長(zhǎng)和生物固氮能力的一個(gè)重要因素。可能的原因是在玉米/紫花苜蓿間作體系中根系接觸縮短了水分和養(yǎng)分的運(yùn)輸距離[21]。相關(guān)性分析表明，玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿的固氮率與根瘤數(shù)、根瘤干質(zhì)量和豆血紅蛋白含量在N0和N1條件下均呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系，這與REDIET等[22]在玉米/大豆間作體系的研究結(jié)果是一致的。因此，在研究中可以采用豆科作物的根瘤數(shù)、根瘤干質(zhì)量和豆血紅蛋白含量指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)豆科作物的固氮能力[22-23]。同時(shí)，通過(guò)分析紫花苜蓿4個(gè)莖級(jí)根系的形態(tài)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論施氮與否，在NS和NNS條件下紫花苜蓿4個(gè)莖級(jí)根系的根長(zhǎng)、根表面積和根體積都受到明顯的抑制，顯著低于PSS處理。但在莖級(jí)為0～0.5 mm時(shí)根長(zhǎng)、根表面積和根體積明顯大于其他莖級(jí)。相關(guān)性分析表明，在玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿的根長(zhǎng)、根表面積和根體積與固氮率均呈極顯著負(fù)相關(guān)，由此可見(jiàn)，在玉米/紫花苜蓿間作體系中，玉米和紫花苜蓿之間存在明顯的種間競(jìng)爭(zhēng)作用[5]。

綜上所述，施氮和根系分隔都能促進(jìn)玉米/紫花苜蓿間作體系中紫花苜蓿根系生長(zhǎng)，但會(huì)抑制紫花苜蓿的固氮能力。在實(shí)際生產(chǎn)中，玉米/紫花苜蓿間作體系可以降低化學(xué)氮肥的施用量，這對(duì)于減肥增效和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的應(yīng)用價(jià)值。