張永福，徐仕琴，荊贊革，莫麗玲，黃 麗

(昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650214)

占地殼總質(zhì)量7%～8%的鋁[1]在pH值大于5的土壤中，主要以不被植物吸收的硅酸鹽或氧化物的形式存在[2]，不危害植物，但在pH值小于5的酸性土壤中，大量Al3+被釋放并被植物所吸收，對(duì)植物造成傷害[3]。酸性土壤在我國南方地區(qū)分布較廣，酸雨頻發(fā)和生理酸性化肥的濫用，導(dǎo)致日趨嚴(yán)重的土壤酸化和鋁毒害問題。葡萄(VitisviniferaL.)是世界廣泛栽培的大宗果樹之一，原產(chǎn)于中亞地區(qū)，對(duì)我國南方的酸性土壤適應(yīng)性差，易受到鋁毒威脅。張永福等[4]發(fā)現(xiàn)，葡萄在鋁脅迫下植株生長受抑，芽片黃化，根系活力下降且變黑。作物的耐鋁性在不同種甚至同種不同品種中均有顯著差異[5-6]，可進(jìn)行耐鋁種質(zhì)資源的篩選，篩選出的耐鋁種質(zhì)資源可進(jìn)一步培育成耐鋁的優(yōu)良品種。

鋁對(duì)作物的危害首先是阻礙其根系的生長和抑制根系對(duì)營養(yǎng)元素的吸收，進(jìn)而導(dǎo)致葉片無機(jī)營養(yǎng)元素含量減少，引起抗氧化酶活性降低，光合速率下降，最終造成減產(chǎn)[7-16]。自然界中，有十余種元素是作物生長發(fā)育必需的無機(jī)營養(yǎng)元素，這些元素對(duì)鋁脅迫的反應(yīng)不盡相同，前人的研究揭示了鋁脅迫抑制作物根系對(duì)N、P、K的吸收，進(jìn)而導(dǎo)致葉片N、P、K含量下降[17]?？梢?，耐鋁性強(qiáng)者在鋁脅迫下其根系的吸收能力強(qiáng)于耐鋁性弱者，進(jìn)而使其葉片中的無機(jī)營養(yǎng)元素含量高于耐鋁性弱者[18-19]。此外，植物根系大量吸收和積累鋁元素是造成鋁毒害現(xiàn)象的根源，鋁脅迫下體內(nèi)積累鋁元素少者更有利于降低鋁毒害作用。由于鋁脅迫下不同葡萄種質(zhì)資源對(duì)各無機(jī)營養(yǎng)元素的反應(yīng)不盡相同，僅通過少數(shù)幾種無機(jī)營養(yǎng)元素含量來鑒定其耐鋁性局限性很大，鑒定結(jié)果不夠客觀準(zhǔn)確。為尋找一種能夠客觀準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)作物種質(zhì)資源抗逆性的方法，前人采用能夠準(zhǔn)確確定各指標(biāo)權(quán)重的主成分分析法，把具有一定關(guān)系的多個(gè)變量轉(zhuǎn)換成少數(shù)幾個(gè)新的綜合變量，再算出每份種質(zhì)資源的隸屬函數(shù)值，加權(quán)后得出各種質(zhì)資源耐鋁性的綜合評(píng)價(jià)值[20-21]，此法亦適合對(duì)作物進(jìn)行耐鋁性評(píng)價(jià)。

因?yàn)殇X脅迫對(duì)葡萄無機(jī)營養(yǎng)的吸收、運(yùn)輸及分配的影響是錯(cuò)綜復(fù)雜的，需要綜合多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)、歸類和篩選不同種質(zhì)資源耐鋁能力的強(qiáng)弱，其結(jié)果才較為可靠。近年來，主成分分析法和隸屬函數(shù)法已應(yīng)用在谷子[20]、胡麻[22]、油菜[23]、大麥[24]等作物的抗逆性鑒定中，但至今仍未見在葡萄耐鋁鑒定中有報(bào)道。鑒于此，以云南省野生和引種栽培的26份不同來源的葡萄種質(zhì)為材料，通過測定鋁脅迫下各葡萄種質(zhì)葉片中無機(jī)營養(yǎng)元素的含量，采用主成分分析、隸屬函數(shù)和聚類分析等多種方法，基于各自無機(jī)營養(yǎng)元素含量，對(duì)葡萄不同種質(zhì)資源進(jìn)行耐鋁性鑒定，從無機(jī)營養(yǎng)的角度建立葡萄耐鋁性鑒定、篩選及評(píng)價(jià)方法，為葡萄耐鋁品種的選育奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用的26份葡萄種質(zhì)資源：東亞種有蘡薁(泰山-1，Vitisbryoniaefolia‘Taishan-1’)、山葡萄(通化-3，V.amurensis‘Tonghua-3’)、刺葡萄(高山-2，V.davidii‘Gaoshan-2’)，野生種毛葡萄(V.quinquangularis，縮寫VQ)和小葉葡萄(V.sinocinerea，縮寫VS)；美洲種群內(nèi)雜種有SO4(V.berlondieri×V.riparia‘SO4’)、貝達(dá)(V.riparia×V.labrusca‘Beta’)；歐美雜種有水晶(V.vinifera×V.labrusca‘Shuijing’)、紅玫瑰(V.vinifera×V.labrusca‘Hongmeigui’)、巨峰(V.vinifera×V.labrusca‘Kyoho’)、玫瑰蜜(V.vinifera×V.labrusca‘Meiguimi’)、巨玫瑰(V.vinifera×V.labrusca‘Jumeigui’)、黑提無極(V.vinifera×V.labrusca‘Heitiwuji’)、夏黑(V.vinifera×V.labrusca‘Summer Black’)、超級(jí)無核(V.vinifera×V.labrusca‘Chaojiwuhe’)、黑玫瑰(V.vinifera×V.labrusca‘Heimeigui’)；歐山雜種有北醇(V.vinifera×V.amurensis‘Beichun’)和左優(yōu)紅[(V.amurensis×V.vinifera)×V.amurensis‘Zuoyouhong’]；歐亞種有紅地球(V.vinifera‘Red Globe’)、黑提(V.vinifera‘Heiti’)、紅比勒特(V.vinifera‘Hongbilete’)、赤霞珠(V.vinifera‘Cabernet Sauvignon’)、白牛奶(V.vinifera‘Bainiunai’)、黑加侖(V.vinifera‘Blackcurrant’)、京秀(V.vinifera‘Jingxiu’)、瑪麗歐(V.vinifera‘Mario’)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在2017—2018年進(jìn)行，26份試驗(yàn)材料種植在云南省昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)實(shí)踐園大棚內(nèi)。栽培方式為無土栽培，基質(zhì)按V(泥炭)∶V(珍珠巖)∶V(蛭石)=2∶1∶1的比例混合好后裝入直徑30 cm、高30 cm的營養(yǎng)缽中，每缽裝4 kg。在定植葡萄苗前參照考廖伯壽等[25]的方法對(duì)基質(zhì)進(jìn)行酸化處理，并用鋁處理液澆透基質(zhì)。然后挑選1年生、健壯、無病蟲害的扦插苗定植于營養(yǎng)缽中，每缽植1株。

在前期不同鋁濃度對(duì)葡萄生長脅迫研究的基礎(chǔ)上，設(shè)置10 mmol/L鋁脅迫[Al2(SO4)3，pH=4.0]和1/2 Hoagland’s營養(yǎng)液對(duì)照(CK)2個(gè)處理，10 mmol/L Al2(SO4)3處理液用1/2 Hoagland’s營養(yǎng)液配制。每份葡萄種質(zhì)定植10盆，5盆用于鋁脅迫處理，5盆用于對(duì)照處理，試驗(yàn)重復(fù)4次。鋁脅迫處理60 d，期間根據(jù)環(huán)境條件和植株需水狀況，每隔2～3 d不同處理分別澆500 mL的鋁處理液和1/2 Hoagland’s營養(yǎng)液。

1.3 測定項(xiàng)目和方法

供試樣品為健壯、成熟、無病蟲害的葉片，采摘后用蒸餾水清洗干凈后烘干、磨碎，過孔徑0.212 mm標(biāo)準(zhǔn)篩，篩下的粉末用H2SO4-H2O2在Multiwave PRO微波萃取儀中消煮后，用于測定各無機(jī)營養(yǎng)元素含量。測定的12種元素包括N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、B、Mo、Cu、Al。用納氏試劑法測定N含量，其余11種元素含量均用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)分析系統(tǒng)測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

選用SPSS 22.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢測、相關(guān)性分析、主成分分析、聚類分析和回歸分析。利用各項(xiàng)指標(biāo)的耐鋁系數(shù)與耐鋁性綜合評(píng)價(jià)值(D值)建立最優(yōu)回歸方程，計(jì)算公式如下：

與耐鋁性呈正相關(guān)的指標(biāo)，如N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、B、Mo、Cu含量的耐鋁系數(shù)為脅迫下的指標(biāo)值與非脅迫下的指標(biāo)值的比值；與耐鋁性呈負(fù)相關(guān)的指標(biāo)，如Al含量的耐鋁系數(shù)為非脅迫下的指標(biāo)值與脅迫下的指標(biāo)值的比值。變幅 =(耐鋁系數(shù)-1)×100%。

各種質(zhì)資源的每個(gè)綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值的計(jì)算公式：U(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)，j=1,2……n。式中,Xj表示第j個(gè)綜合指標(biāo)，Xmin和Xmax分別表示第j個(gè)綜合指標(biāo)的最小值和最大值。

2 結(jié)果與分析

2.1 26份葡萄種質(zhì)資源12種無機(jī)營養(yǎng)元素的耐鋁系數(shù)及相關(guān)性

根據(jù)26份葡萄種質(zhì)資源鋁脅迫處理與對(duì)照葉片12種無機(jī)營養(yǎng)元素的測定結(jié)果，計(jì)算各性狀的耐鋁系數(shù)(表1)。不同葡萄種質(zhì)資源的耐鋁系數(shù)差異極顯著者有N、P、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、B、Al含量。在鋁脅迫下，各葡萄種質(zhì)資源的葉片無機(jī)營養(yǎng)元素均受到不同程度的影響，鋅、硼、鉬、銅含量的變幅分別為-62.0%～276.5%、-68.1%～252.8%、-92.2%～132.6%和-75.7%～286.8%。供試葡萄種質(zhì)資源葉片各無機(jī)營養(yǎng)元素含量的變化幅度不同，若僅根據(jù)某一元素的耐鋁系數(shù)來評(píng)價(jià)耐鋁性，其結(jié)果太片面。此外，不同元素在葡萄耐鋁性中所起的作用也不同，因此，直接利用這些元素含量來評(píng)價(jià)各葡萄種質(zhì)資源的耐鋁性結(jié)果準(zhǔn)確性不高。從相關(guān)系數(shù)矩陣(表2)上也可看出，不同營養(yǎng)元素的耐鋁系數(shù)間均存在或大或小的相關(guān)性，致使其所呈現(xiàn)的信息相互重疊，同時(shí)各元素在葡萄種質(zhì)資源耐鋁性中所起的作用亦不相同，直接利用這些元素含量來評(píng)判各葡萄種質(zhì)資源的耐鋁性結(jié)果不可靠。

表1 26份葡萄種質(zhì)資源12種無機(jī)營養(yǎng)元素的耐鋁系數(shù)Tab.1 Aluminum tolerance coefficient of 12 inorganic nutrient elements in 26 grape germplasm resources

表2 12種無機(jī)營養(yǎng)元素耐鋁系數(shù)的相關(guān)系數(shù)矩陣Tab.2 Correlation matrix of Al-tolerance coefficients of 12 inorganic nutrition elements

2.2 26份葡萄種質(zhì)資源12種無機(jī)營養(yǎng)元素的主成分分析

利用SPSS 22.0軟件對(duì)26份葡萄種質(zhì)資源的12種無機(jī)營養(yǎng)元素的耐鋁系數(shù)進(jìn)行主成分分析(表3)，前5個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率(CR)分別為37.729%、21.714%、11.156%、8.110%和6.386%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)85.095%，其余可忽略不計(jì)。把原有的12個(gè)單項(xiàng)無機(jī)營養(yǎng)指標(biāo)轉(zhuǎn)變成5個(gè)各自獨(dú)立的、全新的綜合指標(biāo)，這5個(gè)指標(biāo)代表了原有指標(biāo)85.095%的信息量。決定第1主成分大小的主要是K、Ca、Mg、Mn含量等4個(gè)性狀分量；決定第2主成分大小的主要是P、Mn、Zn、Al含量等4個(gè)性狀分量；決定第3主成分大小的主要是N、Fe、Mo含量等3個(gè)性狀分量；決定第4、5主成分大小的主要是Cu、B含量等2個(gè)性狀分量。

表3 各綜合指標(biāo)的系數(shù)及貢獻(xiàn)率Tab.3 Coefficients of comprehensive index and their contribution rate

2.3 基于無機(jī)營養(yǎng)的26份葡萄種質(zhì)資源耐鋁性綜合評(píng)價(jià)和聚類分析

分別利用上述公式計(jì)算各種質(zhì)資源所有綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值(U值)及權(quán)重(IW)，并通過U值和權(quán)重計(jì)算耐鋁綜合評(píng)價(jià)值(D值)(表4)。根據(jù)D值的大小來判斷各種質(zhì)資源耐鋁性的強(qiáng)弱，即D值越大，耐鋁性越強(qiáng)。黑提、黑玫瑰、紅地球、小葉葡萄的D值較大，耐鋁性較強(qiáng)。

采用歐氏距離和最大距離法對(duì)D值進(jìn)行聚類分析(圖1)，從聚類圖上可看出,葡萄不同種質(zhì)資源的耐鋁性，圖1從虛線處將26份葡萄種質(zhì)資源分為3類。第1類為泰山-1、黑提無極、水晶、玫瑰蜜、赤霞珠、紅玫瑰、夏黑、超級(jí)無核、白牛奶、紅比勒特等10份種質(zhì)資源；第2類為通化-3、京秀、巨峰、北醇、瑪麗歐、高山-2、毛葡萄、貝達(dá)、巨葡萄等9份種質(zhì)資源；第3類為小葉葡萄、紅地球、黑玫瑰、黑提、SO4、黑加侖和左優(yōu)紅等7份種質(zhì)資源。

表4 26份葡萄種質(zhì)資源的綜合指標(biāo)值、權(quán)重(IW)、U(X)值、D值和預(yù)測值(P)Tab.4 The comprehensive index(CI) value,index weight(IW),U(X) value,D value and prediction value(P) of 26 grape germplasm resources

2.4 基于無機(jī)營養(yǎng)元素篩選葡萄耐鋁性鑒定指標(biāo)

采用逐步回歸的方法，以12個(gè)無機(jī)營養(yǎng)耐鋁系數(shù)為自變量，以D值為因變量，進(jìn)行回歸分析，獲得能夠進(jìn)行耐鋁性預(yù)測或評(píng)價(jià)的數(shù)學(xué)模型，即最優(yōu)回歸方程。該方程為D=-0.019+0.111X3+0.143X5+0.106X8+0.025X9(F=129.032**，R2=0.985)，式中，X3、X5、X8、X9分別指代K、Mn、Zn、B含量。26份種質(zhì)資源的D值與耐鋁預(yù)測值(P值)相關(guān)性極顯著，r=0.989**，表明用此方程對(duì)葡萄種質(zhì)資源的耐鋁性進(jìn)行預(yù)測準(zhǔn)確性和可信度高，預(yù)測結(jié)果可靠。由該方程可知，在12種無機(jī)營養(yǎng)元素中，K、Mn、Zn、B這4種元素對(duì)葡萄種質(zhì)資源耐鋁性有顯著影響。今后在葡萄耐鋁性鑒定中，僅需要測定這4種元素，鑒定工作大大簡化。

3 結(jié)論與討論

3.1 葡萄耐鋁性鑒定的方法

鋁脅迫對(duì)葡萄生長的影響幾乎涉及葡萄生長發(fā)育的方方面面，對(duì)不同葡萄種質(zhì)資源耐鋁性強(qiáng)弱進(jìn)行評(píng)價(jià)和篩選的過程就是耐鋁性鑒定。作物發(fā)生鋁毒害的重要原因之一就是鋁毒干擾作物根系對(duì)無機(jī)營養(yǎng)的吸收，使作物發(fā)生缺素癥[18]，如有報(bào)道鋁毒導(dǎo)致作物缺氮癥和缺鉀癥的發(fā)生[17]，及鋁毒影響作物對(duì)磷、鈣元素的吸收，且一致認(rèn)為鋁會(huì)與作物體內(nèi)的磷結(jié)合形成沉淀而引起缺磷癥，及鋁與鈣競爭細(xì)胞膜上的鈣結(jié)合位點(diǎn)而導(dǎo)致缺鈣[19]；此外，盡管鋁脅迫下作物體內(nèi)無機(jī)營養(yǎng)元素的積累量可作為作物耐鋁性評(píng)定的重要指標(biāo)，但鋁脅迫下不同作物種質(zhì)資源對(duì)某一種元素的反應(yīng)不盡相同，難以用一種或少數(shù)幾種元素全面準(zhǔn)確地反映其耐鋁性，需綜合多種營養(yǎng)元素去評(píng)價(jià)作物的耐鋁性才較為可靠。本研究以12種無機(jī)營養(yǎng)元素的耐鋁系數(shù)作為判斷葡萄單項(xiàng)耐鋁性強(qiáng)弱的指標(biāo)，并將這12種無機(jī)營養(yǎng)元素指標(biāo)通過主成分分析法轉(zhuǎn)換成既能夠多方面地反映原指標(biāo)的信息，又能將原指標(biāo)中差異不明顯的信息集中表現(xiàn)出來的5個(gè)全新的綜合指標(biāo)[26]。這5個(gè)綜合指標(biāo)共同決定26份葡萄種質(zhì)資源的耐鋁性，而并不僅僅由某一綜合指標(biāo)來完全決定。根據(jù)這5個(gè)綜合指標(biāo)值的貢獻(xiàn)率求出其相應(yīng)的隸屬函數(shù)值，并進(jìn)行加權(quán)，得到不同種質(zhì)資源的耐鋁性綜合評(píng)價(jià)值，從而使各種質(zhì)資源之間的耐鋁性差異具有可比性。用聚類分析的方法將26份葡萄種質(zhì)資源劃分為3類：耐鋁性較強(qiáng)的是小葉葡萄、紅地球、黑玫瑰、黑提、SO4、黑加侖和左優(yōu)紅，耐鋁性較弱的是通化-3、京秀、巨峰、北醇、瑪麗歐、高山-2、毛葡萄、貝達(dá)、巨葡萄，其余為耐鋁性中等。

3.2 葡萄耐鋁性鑒定指標(biāo)

在耐鋁種質(zhì)資源鑒定及耐鋁新品種選育中，篩選出能夠簡單、快捷、可靠的鑒定指標(biāo)尤為重要。目前，國內(nèi)外學(xué)者已提出許多與作物耐鋁性相關(guān)的形態(tài)及生理指標(biāo)[27-32]，在葡萄上，也開展了一些耐鋁性方面的研究，發(fā)現(xiàn)鋁脅迫使葡萄葉綠素和類胡蘿卜素含量下降，脯氨酸和鋁含量上升，過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性上升等[4];此外,鋁脅迫也會(huì)降低各無機(jī)營養(yǎng)元素的含量[33]，可作為葡萄耐鋁性的鑒定指標(biāo)。本研究從無機(jī)營養(yǎng)元素的角度來篩選葡萄種質(zhì)資源的耐鋁性鑒定指標(biāo)，分析這些無機(jī)營養(yǎng)元素含量與耐鋁性之間的關(guān)系，建立起葡萄耐鋁毒鑒定的數(shù)學(xué)模型。最后通過最優(yōu)回歸方程使各種質(zhì)資源的耐鋁性得以量化，并且篩選出了葉片中K、Mg、Zn、B含量對(duì)耐鋁性有顯著的影響，使葡萄的耐鋁性評(píng)價(jià)及耐鋁種質(zhì)資源的鑒定變得準(zhǔn)確、快捷和高效。以后對(duì)新引入或新選育的葡萄種質(zhì)資源，可通過測定這4種無機(jī)營養(yǎng)元素的含量后計(jì)算出D值，根據(jù)D值的大小來大致推測該種質(zhì)資源的耐鋁水平。