陳梟嘉,李 立，馬新新,史吉平，趙志軍

(1.中國科學(xué)院 上海高等研究院綠色化學(xué)工程研究中心，上海 201210；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049； 3.上?？萍即髮W(xué) 生命學(xué)院，上海 201210；4.上海清美綠色食品(集團)有限公司，上海 201300)

中國是豆制品消費的第一大國，2017年我國用于食品工業(yè)的大豆量約為1 200萬t，豆渣是豆制品生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)品，目前，國內(nèi)每年產(chǎn)生約1 500萬t豆渣[1]。豆渣雖然富含蛋白質(zhì)、膳食纖維、脂肪、維生素等營養(yǎng)元素，但因其含水量大，極易腐敗產(chǎn)生惡臭物質(zhì)，進而對環(huán)境造成污染[2]。目前，豆渣主要應(yīng)用于動物飼料和土壤有機肥生產(chǎn)，但由于豆渣含胰蛋白酶抑制因子、致甲狀腺腫素、凝血素等多種抗營養(yǎng)因子，長期將其作為飼料，容易導(dǎo)致牲畜消化不良，從而影響生長[3]。為了避免豆渣引起的環(huán)境污染和實現(xiàn)豆渣的資源化利用，制備有機肥是經(jīng)濟有效的方法[4]。

傳統(tǒng)發(fā)酵制備有機肥的溫度較低(長期保持在50～60 ℃)，發(fā)酵周期為2～3個月，腐熟緩慢[5-6]。高溫發(fā)酵制備有機肥是一種新型的好氧高溫發(fā)酵生產(chǎn)有機肥技術(shù)，該技術(shù)在農(nóng)業(yè)廢棄物料中接入高溫發(fā)酵菌劑，可以提高有機物料的降解速率，加速物料腐熟，進而提高有機肥制備效率[7-8]。如宋春等[9]采用高溫發(fā)酵技術(shù)，將羊糞有機肥腐熟時間縮短了1/2。其次，高溫發(fā)酵還能有效滅活有機廢棄物中的病原菌[10-11]。據(jù)文獻報道，在有機肥發(fā)酵過程中，只要溫度超過70 ℃并且時間持續(xù)25 min以上，就可以滅活有機廢棄物中的病原微生物[12]。此外，高溫微生物在通氣條件下還可以減少有機肥發(fā)酵過程中的甲烷和一氧化二氮等有害氣體產(chǎn)生，實現(xiàn)環(huán)境友好生產(chǎn)有機肥[13]。

目前關(guān)于豆渣高溫發(fā)酵制備有機肥的研究尚未見報道。鑒于豆渣物料本身缺乏高溫菌，為能夠讓豆渣高溫發(fā)酵制備有機肥順利實施，主要從以下幾個方面進行具體技術(shù)研究：從采集樣品中篩選能在70 ℃以上生長的高溫菌；從高溫菌中篩選可高效利用豆渣生長的菌株；研究篩選菌株的增殖培養(yǎng)條件；模擬豆渣發(fā)酵制備有機肥的高溫階段(70 ℃)，考察高溫菌株對豆渣發(fā)酵制備有機肥的影響。

1 材料和方法

1.1 豆渣高溫菌的篩選

采集上海野生動物園的馬糞樣品、上海光明生豬養(yǎng)殖場的糞污樣品、上海清美食品有限公司豆制品廠的豆渣樣品以及上海奉賢生活污泥處理廠的生活污泥樣品。將采集的新鮮樣品各取5 g分別加入至100 mL CYS液體培養(yǎng)基[14]，并將錐形瓶放在70 ℃水浴搖床中富集培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)速為200 r/min。取上述培養(yǎng)后的液體進行稀釋涂板，培養(yǎng)基為固體豆渣培養(yǎng)基，并將平板放在70 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將平板上形態(tài)不同的單菌落分別接種至固態(tài)CYS培養(yǎng)基平板上進行二次劃線培養(yǎng)和保藏。

固體豆渣培養(yǎng)基配方：將新鮮豆渣烘干后磨成粉，取50 g干豆渣、15 g瓊脂粉，加蒸餾水定容至1 L，pH值自然。121 ℃高壓滅菌20 min冷卻至室溫保存。

CYS培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨 3 g、酵母粉2 g、可溶性淀粉1 g、NaCl 3 g、CaCl20.5 g、MgCl20.125 g、FeSO410 mg，微量元素液100 μL，加蒸餾水定容至1 L，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.5，121 ℃高壓滅菌20 min冷卻至室溫保存。其中，微量元素液配方：Na2MoO4·2H2O 12 g、VOSO41 g、MnCl25 g、ZnSO4·7H2O 0.6 g、CuSO4·5H2O 0.15 g、COCl2·6H2O 8 g、NiCl2·6H2O 0.2 g，加蒸餾水定容至1 L，pH值自然。

1.2 高溫菌的16S rDNA鑒定

用無菌牙簽分別采集豆渣培養(yǎng)基平板上的菌落，轉(zhuǎn)接至50 μL生理鹽水中，沸水浴中放置5 min后，離心取上清液，獲得菌株基因組DNA的粗提液。使用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3′)/1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGAC-TT-3′)進行擴增，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。測序所得16S rDNA 序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)種屬的序列進行比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 降解豆渣高溫菌的驗證

將高溫菌用搖瓶培養(yǎng)24 h后，通過離心機6 000 r/min離心5 min收集菌體。將濕豆渣通過烘干措施控制含水量約在70%，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.5。取處理后的豆渣50 g加入250 mL錐形瓶中，各加入2 mL OD600=10 菌體溶液?？瞻捉M加入2 mL無菌水作對照。用透氣封口膜把錐形瓶封上，放入70 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，每天錐形瓶中的豆渣搖勻1次。記錄豆渣前后質(zhì)量和含水量的變化。以上試驗均重復(fù)3次，通過豆渣降解率的指標考察，篩選豆渣高溫降解菌。降解率公式如下:

(1)

其中:m0d和m5d分別代表豆渣初始質(zhì)量(濕質(zhì)量)和發(fā)酵5 d后的質(zhì)量(濕質(zhì)量)；w0d和w5d分別代表豆渣初始含水量和發(fā)酵5 d后的含水量。

1.4 豆渣降解菌的增殖培養(yǎng)條件優(yōu)化

將篩選的豆渣降解菌的菌體收集，用無菌水調(diào)節(jié)OD600=1，將1 mL調(diào)節(jié)好的菌液加入含50 mL CYS 培養(yǎng)基(pH值7.5)的250 mL錐形瓶中，分別放入30、40、50、60、65、70、75、80 ℃水浴搖床中150 r/min培養(yǎng)12 h后，測OD600，考察不同溫度下，豆渣降解菌在CYS 液體培養(yǎng)基中的增殖生長情況。

將1 mL調(diào)節(jié)好的菌液加入含50 mL CYS 培養(yǎng)基(pH值分別調(diào)至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)的250 mL錐形瓶中，放入70 ℃水浴搖床中150 r/min培養(yǎng)12 h后，測OD600，考察不同初始pH值下，豆渣降解菌在CYS 液體培養(yǎng)基中的增殖生長情況。

將1 mL調(diào)節(jié)好的菌液加入含50 mL CYS 培養(yǎng)基(pH值7.5)的250 mL錐形瓶中，放入70 ℃水浴搖床中150 r/min分別培養(yǎng)4、8、12、16、20、24 h，測OD600，考察不同培養(yǎng)時間下，豆渣降解菌在CYS液體培養(yǎng)基中的增殖生長情況。

細菌生長特性以單位細菌OD600值在單位時間內(nèi)增加量來表示。細菌的比生長速率μ計算公式如下：

(2)

其中：μ表示以細菌OD600值表示的比生長速率，單位h-1；X0代表細菌的初始OD600值；X代表細菌的OD600值；t代表細菌生長時間，單位h。

考察不同培養(yǎng)時間下豆渣降解菌在CYS液體培養(yǎng)基中的增殖生長情況。

以上試驗均重復(fù)3次。

1.5 豆渣恒溫高溫發(fā)酵模擬

在實驗室中模擬制作豆渣有機肥恒溫高溫發(fā)酵的小型發(fā)酵罐(圖1)。將濕豆渣烘干至含水量約70%，調(diào)節(jié)豆渣pH值為7.5。將40 mL OD600=10 的豆渣降解高溫菌的菌液接種至含1 000 g 豆渣(含5%黃漿水污泥)的發(fā)酵罐中，混合均勻?？瞻捉M(CK)則加入40 mL無菌水。發(fā)酵罐中溫度控制70 ℃，通風(fēng)量控制在0.5 L/min，模擬恒溫高溫有機肥發(fā)酵5 d。每天取30 g樣品，置于-20 ℃冰箱中冷凍保存，并及時進行指標檢測。以上試驗均重復(fù)3次。樣品基本理化性質(zhì)如表1所示。

表1 樣品基本理化指標Tab.1 Basic physical and chemical indexes of samples

1.6 測定方法

樣品總有機碳(TOC)含量參照《HJ 615—2011土壤有機碳的測定 重鉻酸鉀氧化—分光光度法》進行測定；總氮(TN)含量參照《NY/T 2542—2014 肥料總氮含量的測定》進行測定；碳氮比(C/N)=有機碳含量/總氮含量；種子發(fā)芽指數(shù)(GI)測定參照國標GB/T 23486—2009附錄A 并進行改進，采用10粒胡蘿卜種子替代方法中的20粒小白菜種子進行。

含水量測定步驟如下，將新鮮樣品放入105 ℃烘箱24 h，含水量計算如下：

(3)

其中：m0和m1分別為樣品烘干前和烘干后質(zhì)量，單位g。

磷、鉀含量測定步驟如下：取0.1 g干物質(zhì)加入2 mL濃硝酸和1 mL雙氧水，在微波消解爐中120 ℃消解2 h，消解后用去離子水稀釋至50 mL，并用離心機6 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液稀釋至50 mL，過膜0.22 μm微孔濾膜。液體中的磷和鉀含量用ICP光譜儀(PE avio 200)進行測定。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用 Microsoft Excel 2016 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計及相關(guān)性分析，采用Origin 2020作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆渣降解高溫菌的篩選與鑒定

在采集的馬糞、豬糞、豆渣以及生活污泥中，通過篩選獲得7株可以利用豆渣生長的高溫菌，其中 1、7號菌來源于馬糞，4、5和6號菌來源于生活污泥，3號菌株來源于豆渣，2號菌株來源于豬糞。16S rDNA菌種鑒定結(jié)果表明，所測的1號、2號菌株核苷酸序列分別為1 593、1 019 bp。將所測序列在NCBI上進行BLAST查找相似的序列，構(gòu)建以16S rDNA全序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖2所示，1號和2號菌株與Geobacillustoebii的同源性很高。結(jié)合形態(tài)初步確定1號和2號菌株為Geobacillustoebii，并分別命名為G.T1和G.T2。

所測的3號菌株核苷酸序列為1 334 bp。3號菌株與Geobacillussp.親緣關(guān)系較高，與Geobacillussp.strain NN-36的同源性為99.55%。結(jié)合形態(tài)初步確定3號菌株為Geobacillussp.，并將其命名為G.sp.70.L1。

所測的4號、5號菌株核苷酸序列分別為1 300、1 293 bp。4號和5號菌株與幾株Methylobacteriumsp.的同源性很高。結(jié)合形態(tài)初步確定4號和5號菌株為Methylobacteriumsp.，并分別命名為M.sp.85.H4和M.sp.83.H10。

所測的6號、7號菌株核苷酸序列分別為1 338、1 304 bp。6號和7號菌株與Thermusthermophilus的同源性很高。結(jié)合形態(tài)初步確定6號和7號菌株為Thermusthermophilus，并分別命名為The.t.83.H7和The.t.80.FJMF2。

2.2 豆渣降解高溫菌的驗證

微生物的代謝活動會導(dǎo)致有機物發(fā)生不同程度的降解，因此，通過農(nóng)業(yè)廢棄物干物質(zhì)的減少量可以間接反映微生物在該條件下的生長情況。如圖3所示，在70 ℃條件下發(fā)酵5 d后，接種不同高溫菌株的豆渣呈現(xiàn)出不同程度的降解率。其中，加入G.T1菌株后，豆渣降解效果最為明顯，干物質(zhì)的降解率達到4.80%。其次是菌株G.T2和菌株M.sp.85.H4，其對應(yīng)豆渣干物質(zhì)降解率分別為1.34%和1.26%，其他4株菌株接種的豆渣，其干物質(zhì)降解率均低于0.2%。根據(jù)文獻[15]報道，在70 ℃以上時，Geobacillustoebii分泌的淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶仍可維持高活性，因此，在70 ℃條件下，Geobacillustoebii可有效降解豆渣。然而，值得注意的是，盡管G.T1和G.T2 兩個株菌均從屬于Geobacillustoebii，但是降解效果差別很大，G.T1菌株對應(yīng)豆渣的降解率是G.T2的3.6倍。這可能與2株菌株的來源環(huán)境不同相關(guān)，G.T1來自馬糞樣品，生長環(huán)境的纖維含量較高，使得G.T1菌株在纖維含量同樣較高的豆渣中生長代謝更加旺盛，適應(yīng)性更強；而來源于豬糞的G.T2，因缺乏高纖維含量的環(huán)境馴化，其在豆渣中的代謝活動較弱。因此，本研究選擇最佳豆渣降解菌株G.T1作為進一步研究的對象。

2.3 豆渣降解高溫菌株G.T1的增殖培養(yǎng)條件優(yōu)化

微生物的增殖培養(yǎng)是其接種至有機廢棄物中進行發(fā)酵制備有機肥的必要條件。本研究分別從培養(yǎng)溫度、物料初始pH值和培養(yǎng)時間3個因素考察高溫菌株G.T1的增殖培養(yǎng)條件。如圖4a所示，在培養(yǎng)溫度40～75 ℃內(nèi)，菌株G.T1的最適生長溫度為65 ℃，其生長曲線與Geobacillustoebii的生長溫度(45～70 ℃)基本一致[16]。值得注意的是，菌株G.T1在環(huán)境溫度降低至40 ℃時，仍具有一定的生長活性，因此在實際發(fā)酵過程中，該菌株在物料發(fā)酵的初始升溫階段同樣可以發(fā)揮作用。如圖4b所示，菌株G.T1生長pH值在6.5～9.5，其中最適生長pH值為7.5。通常情況下，有機固體廢棄物在發(fā)酵制備有機肥的前中期，堆體pH值不斷升高。菌株G.T1的生長最高pH值為 9.5，可見其在堆肥堿性發(fā)酵階段仍可以繼續(xù)進行正常的生長代謝活動，從而促進物料腐熟。如圖4c所示，菌株G.T1在0～4 h處于生長遲緩期，在4～20 h處于快速生長期，而到24 h后基本處于穩(wěn)定期。從圖4d比生長速率可知，菌株G.T1在培養(yǎng)10 h時比生長速率最快，每小時可增長0.4個 OD600值。綜上所述，溫度65 ℃、pH值7.5培養(yǎng)條件下，菌株G.T1在豆渣物料中的生長性能最好，且在培養(yǎng)24 h后生長達到穩(wěn)定期。

2.4 豆渣降解高溫菌株G.T1對豆渣高溫發(fā)酵的影響

為了進一步考察高溫菌株G.T1在豆渣高溫發(fā)酵過程中的作用，將40 mL OD600=10的G.T1菌株培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐中含水量70%、pH值 7.5的1 kg 豆渣中，70 ℃保溫發(fā)酵5 d，定期取樣，測試各種理化指標(圖5)。由于新鮮豆渣的C/N為21.96，符合有機肥發(fā)酵的初始C/N范圍(20～30)[17]，因此發(fā)酵時無需再添加秸稈粉等輔料調(diào)節(jié)物料的C/N。

碳氮變化是物料腐熟過程中的基本特征之一，有機碳主要為微生物活動提供碳源，而總氮的變化則是微生物生理代謝轉(zhuǎn)化的結(jié)果[18]。由圖5可知， CK的TOC含量從初始的38.74% (0 d)上升到39.48% (5 d)，而試驗組則從39.43%上升到39.99%。試驗組初始TOC含量略高于CK，可能是因為添加的菌株G.T1中包含的有機碳所導(dǎo)致。CK和試驗組發(fā)酵前后TOC含量的變化幅度均較小，這與豆渣中含有較多微生物難以利用的纖維類物質(zhì)有關(guān)(表1)。CK的TN含量變化從1.76%(0 d)上升到2.34%(5 d)，而試驗組的TN含量變化也從1.84%(0 d)上升到2.77%(5 d)。這可能是由于物料發(fā)酵過程中，干物質(zhì)損失而導(dǎo)致的氮元素相對富集[19]。

C/N是常用的物料發(fā)酵腐熟指標之一[20]。CK的C/N從21.96 (0 d)上升到22.50 (3 d)并在第4 天開始下降，至發(fā)酵結(jié)束后C/N為16.86，達到腐熟的標準(C/N<20)。而試驗組C/N的變化趨勢也是先上升后下降，在發(fā)酵結(jié)束時C/N下降到14.43，明顯小于CK。相關(guān)研究表明，物料的C/N越低，腐熟度越高。試驗組腐熟程度高于CK，可能是由于菌株G.T1的添加加快了氮元素的轉(zhuǎn)化，并且降解了部分有機質(zhì)，使得試驗組的腐熟程度更高。

此外，GI值能通過發(fā)酵產(chǎn)物對植物的毒性大小來反映有機肥腐熟程度，是評估有機肥腐熟最可靠、最有效的指標之一[21]。CK與試驗組的GI值變化趨勢不一致，CK的GI值先下降后上升，可能原因是發(fā)酵過程中會產(chǎn)生氨和部分有害有機酸，能減少種子萌發(fā)和抑制根發(fā)育[22]。而試驗組GI值緩慢上升，從69.00% 0 d)上升至135.00%(5 d)?？赡茉蚴羌尤刖闓.T1能降解豆渣中的有害有機酸，從而減少對植物的毒害作用，使得GI值上升。在豆渣發(fā)酵的第5天，CK的GI值達到86.42%，達到腐熟標準(GI>85%)[23]，而試驗組則在第3天達到95.00%，比CK腐熟時間縮短40%。這些結(jié)果顯示，在豆渣中添加菌株G.T1可以顯著提高物料發(fā)酵的腐熟度。

氮、磷、鉀是植物生長所需較多的營養(yǎng)元素[24]，肥料中氮、磷、鉀含量能間接反映有機肥的肥力大小。如圖6所示，經(jīng)過高溫發(fā)酵后，豆渣中氮、磷、鉀含量均得到提升。試驗組經(jīng)發(fā)酵后的豆渣氮含量從18.40 g/kg 上升到27.72 g/kg，比CK提升了18.46%。磷含量從4.08 g/kg上升到7.69 g/kg，與CK相比提升了25.04%。鉀含量從9.01 g/kg上升到17.92 g/kg，比CK高22.74%。試驗組的氮、磷、鉀總體含量與CK相比都得到了提升，可能是由于試驗組的腐熟程度更高，肥料中氮、磷、鉀濃縮更為明顯導(dǎo)致的。因此，在豆渣高溫制備有機肥中，可通過添加菌株G.T1提高有機肥的肥力。

3 結(jié)論與討論

與畜禽糞污不同，豆渣本身不存在抗生素殘留、重金屬污染嚴重等一系列問題，是制備優(yōu)質(zhì)有機肥的良好原料，發(fā)展?jié)摿薮骩25]。傳統(tǒng)的堆肥發(fā)酵制備有機肥通常需要進行2～3個月，發(fā)酵過程中物料的溫度長期保持在40～60 ℃。隨著生態(tài)循環(huán)與環(huán)保理念的不斷增強，這種傳統(tǒng)發(fā)酵模式制備有機肥逐漸顯示出以下不足之處：1)發(fā)酵啟動慢，夏季豆渣在1 h內(nèi)就會發(fā)生酸敗，進而產(chǎn)生惡臭物質(zhì)，污染環(huán)境并影響正常發(fā)酵；2)發(fā)酵溫度低，病蟲害殺滅不徹底：堆肥物料發(fā)酵溫度在60 ℃以上發(fā)酵時間短，豆渣中污染的糞大腸桿菌等致病菌不易被徹底殺滅，施肥后易導(dǎo)致病蟲害的傳播；3)發(fā)酵溫度低，腐熟不徹底：由于發(fā)酵溫度低，發(fā)酵結(jié)束時，相當比例的物料養(yǎng)分仍為有機態(tài)，不能被作物直接吸收利用，導(dǎo)致肥效緩慢；4)發(fā)酵時間長，占地時間久，由于發(fā)酵溫度低，發(fā)酵過程需要持續(xù)2～3個月，因而占用土地時間長，土地利用效率低下[6,26]。

近年來，利用高溫微生物好氧發(fā)酵畜禽糞污制備有機肥成為畜禽糞污資源化的研究熱點，與低溫發(fā)酵制備發(fā)酵有機肥相比具有以下優(yōu)點：1)微生物利用自身的代謝產(chǎn)能，使得發(fā)酵物料的溫度長期保持在70 ℃以上，從而徹底殺滅糞污中的病蟲害；2)高溫下微生物生長代謝快，可將底物有機質(zhì)快速轉(zhuǎn)化為植物能利用的速效態(tài)，提升畜禽糞污制備有機肥的經(jīng)濟價值；3)通過高溫好氧發(fā)酵制備有機肥，可以將腐熟發(fā)酵周期縮短至6～12 d，比傳統(tǒng)堆肥發(fā)酵周期(35～45 d)，縮短了近90%，可以達到節(jié)約土地、高效產(chǎn)肥的目的[17]。

值得注意的是，豆渣農(nóng)業(yè)廢棄物目前還未見用于高溫發(fā)酵制備有機肥的相關(guān)報道，且前期研究發(fā)現(xiàn)，鑒于豆渣在營養(yǎng)架構(gòu)上與畜禽糞污差異較大，在畜禽糞污中應(yīng)用的高溫發(fā)酵微生物在豆渣農(nóng)業(yè)廢棄物中生長緩慢，無法實現(xiàn)正常的高溫堆肥發(fā)酵，因此本研究旨在針對性地篩選適合豆渣農(nóng)業(yè)廢棄物的高溫發(fā)酵微生物，并考察其在高溫階段中對豆渣物料轉(zhuǎn)化的影響。

本研究中，從馬糞、豬糞、豆渣及生活污泥中分離獲得7株可在70 ℃環(huán)境中生長的菌株，經(jīng)16 S rDNA分子鑒定，7株菌分別屬于Geobacillustoebii、Geobacillussp.、Methylobacteriumsp.和Thermusthermophilus4個屬種類別；經(jīng)過試驗驗證，其中菌株G.T1(Geobacillustoebii)降解豆渣效果最為明顯。

菌株G.T1生長溫度范圍在40～75 ℃，最適溫度為65 ℃。該菌株生長pH值在6.5～9.5，最適pH值為7.5。在70 ℃條件下，發(fā)酵4 h開始進入快速生長期，并在24 h內(nèi)可達到生長穩(wěn)定期。

利用菌株G.T1模擬豆渣高溫發(fā)酵過程(70 ℃)，發(fā)酵第3天，試驗組GI值為95.00%，達到腐熟標準，比CK腐熟時間縮短40%。豆渣在第4天C/N(16.86)達到腐熟標準，高于CK腐熟度。該菌株對豆渣中的TOC含量影響不大，對TN含量提高有促進作用。

高溫發(fā)酵5 d后的豆渣氮、磷、鉀含量分別為27.72、7.69、17.92 g/kg，比CK分別提升了18.46%、25.04%、22.74%。因此，菌株G.T1能促進豆渣發(fā)酵腐熟，提高有機肥肥力。