劉宏祥，王 健，宋衛(wèi)濤，朱春紅，陶志云，徐文娟，章雙杰，李慧芳

(1.江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225125； 2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

畜禽遺傳資源是畜牧生產(chǎn)和可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)，也是滿足未來(lái)不可預(yù)見需求的種質(zhì)資源基因庫(kù)[1]。我國(guó)畜禽遺傳資源是世界上最豐富的[2]，大部分地方品種與國(guó)外的一些專用品種(品系)相比，具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼、抗病力強(qiáng)、繁殖力高以及肉質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)[3]。但隨著外來(lái)品種以及品種改良的沖擊，一些地方品種逐步處于瀕危狀態(tài)[4]。太湖鵝是江浙地區(qū)比較重要的地方鵝種，以體型小、產(chǎn)蛋多而聞名，并被列入國(guó)家級(jí)保護(hù)名錄[5]。由于受到外來(lái)品種的沖擊，以及近親交配導(dǎo)致的品種衰退，太湖鵝數(shù)量持續(xù)下降，目前主要保存在多個(gè)原種場(chǎng)以及國(guó)家級(jí)水禽基因庫(kù)(江蘇)(以下簡(jiǎn)稱基因庫(kù))中[6]。

筆者所在課題組前期對(duì)不同世代的太湖鵝江蘇原種場(chǎng)和基因庫(kù)中的太湖鵝遺傳結(jié)構(gòu)及保種效果進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2個(gè)太湖鵝群體的近交系數(shù)均有所上升[7]。其后江蘇原種場(chǎng)與基因庫(kù)改進(jìn)了保種方法，實(shí)行嚴(yán)格的家系等量隨機(jī)選配法。鑒于此，利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)太湖鵝種群江蘇原始群體(TS)、2個(gè)世代后江蘇原種場(chǎng)全體(TC)、國(guó)家級(jí)水禽基因庫(kù)(江蘇)群體(TK)以及浙江原種場(chǎng)群體(TZ)進(jìn)行系統(tǒng)比較分析，以期全面了解江蘇省太湖鵝群體改進(jìn)后的保種效果以及浙江省的保種情況，為江浙地區(qū)太湖鵝保種策略的進(jìn)一步改進(jìn)提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)方法

1.1 供試動(dòng)物

采集TS群體(江蘇省家禽科學(xué)研究所保存)、TC群體、TK群體以及TZ群體血樣各10個(gè)。TS群體血樣為2007年在江蘇原種場(chǎng)所采血樣，TC群體、TK群體和TZ群體血樣分別于2019年采集。2007年國(guó)家級(jí)水禽基因庫(kù)(江蘇)從太湖鵝江蘇原種場(chǎng)引進(jìn)保種，因此，TS群體可視為TC群體、TK群體的祖先群體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 ddRAD簡(jiǎn)化基因組測(cè)序 常規(guī)酚-氯仿法提取基因組DNA，利用ddRAD建庫(kù)方式[8]構(gòu)建長(zhǎng)度在300～500 bp的pair-end文庫(kù)，進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序。

1.2.2 參考基因組比對(duì)與單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測(cè) 使用BWA軟件[9]對(duì)短序列reads與鵝參考基因組(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_002166845.1/)比對(duì)得到Clean reads，使用Samtools軟件[10]對(duì)Clean reads進(jìn)行去重復(fù)，GATK軟件[11]進(jìn)行局部重比對(duì)、堿基質(zhì)量校正等預(yù)處理。堿基質(zhì)控條件包括Q20(正確率99%的堿基數(shù)目比例)>95%，ddRAD depth(雙酶切基因測(cè)序的覆蓋深度)>60%，SNP call rate(在所有群體中單核苷酸多態(tài)性檢出率)>70%[7]。最后使用GATK軟件進(jìn)行SNP檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用PopGen32軟件[12]計(jì)算平均雜合度、近交系數(shù)(FIS)、群體分化指數(shù)(Fst)和核苷酸多樣性(θπ)，使用Admixture軟件[13]進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析；使用GCTA軟件(https://cnsgenomics.com/software/gcta/#Overview)進(jìn)行主成分分析(Principal component analysis,PCA)，得到樣品的主成分聚類情況；利用Treemix軟件推斷多個(gè)群體分化和基因交流情況；使用PLINK軟件[14]進(jìn)行選擇信號(hào)分析，其中以100 kb為窗口、10 kb為步長(zhǎng)計(jì)算基因組上不同區(qū)域的Fst和θπ值。

2 結(jié)果與分析

2.1 太湖鵝4個(gè)群體基因組SNP鑒定

經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)質(zhì)控，在4個(gè)太湖鵝群體中平均鑒定出SNP數(shù)目為181 876個(gè)，其中NW_013185654.1和NW_013185655.1染色體上鑒定到的SNP數(shù)量最多，分別為13 139個(gè)和12 966個(gè)。SNP位點(diǎn)在染色體上的數(shù)量及密度分布分別見圖1和圖2。

2.2 群體內(nèi)遺傳多樣性分析

根據(jù)變異位點(diǎn)對(duì)群體遺傳學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表1)。由表1可知，TS群體、TC群體、TK群體和TZ群體雜合度分別為0.249 5、0.225 5、0.218 2和0.211 0。TC群體、TK群體和TZ群體雜合度明顯低于TS群體，核酸多樣性也低于TS群體。與TS群體相比，TC群體和TK群體的FIS明顯上升。TZ群體的雜合度最低，且近交系數(shù)明顯高于TC群體和TK群體。

表1 太湖鵝4個(gè)群體遺傳多樣性參數(shù)統(tǒng)計(jì)Tab.1 Statistics of genetic diversity parameters of four Taihu goose populations

2.3 群體間遺傳分化分析

通過(guò)滑窗分析，計(jì)算不同組合Fst平均值(表2)。群體間Fst值越高，說(shuō)明群體間序列的差異越大。TZ群體與TS、TC和TK群體的Fst值分別為0.051 5、0.049 8和0.048 6，明顯高于其他3個(gè)群體間的Fst值。TS和TC群體間的Fst值最小，為0.032 5。

表2 太湖鵝不同群體間Fst比較Tab.2 Comparison of Fst between different populations in Taihu goose

2.4 群體間遺傳結(jié)構(gòu)分析

群體遺傳結(jié)構(gòu)指遺傳變異在物種或群體中的一種非隨機(jī)分布[15]。按照地理分布或親緣關(guān)系可將一個(gè)群體分為若干亞群，處于同一亞群內(nèi)的不同個(gè)體親緣關(guān)系較近，而亞群與亞群之間則親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)。群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，k=2時(shí)，4個(gè)群體可以明顯分為2類，TS群體、TK群體和TC群體之間享有較多的血統(tǒng)，TZ群體單獨(dú)分為一類，但與TC群體享有少量血統(tǒng)(圖3)。

2.5 群體PCA分析

對(duì)4個(gè)群體進(jìn)行PCA分析，并利用前3個(gè)主成分對(duì)群體進(jìn)行分層(圖4)。PCA分析結(jié)果表明，TZ群體單獨(dú)聚在一起，而TS群體、TC群體和TK群體聚為一類，這與群體遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致。

2.6 基因流分析

在群體遺傳學(xué)上，基因流(Gene flow，也稱基因遷移)是指從一個(gè)物種的一個(gè)種群向另一個(gè)種群引入新的遺傳物質(zhì)，從而改變?nèi)后w基因庫(kù)的組成。通過(guò)基因交流向群體中引入新的等位基因，是一個(gè)非常重要的遺傳變異來(lái)源，影響群體遺傳多樣性，產(chǎn)生新的性狀組合?；蛄鞣治鼋Y(jié)果表明，TK群體與TC群體有少量的遷移，即發(fā)生基因交流情況(圖5)。

2.7 選擇信號(hào)分析

選擇群體間分化較大的TS群體和TZ群體進(jìn)行選擇信號(hào)分析。結(jié)合θπ比率和Fst值，選擇前5%的區(qū)域(圖6)，篩選到了161個(gè)區(qū)域，與這些區(qū)域重疊(包括部分重疊和完全重疊)的基因中注釋到了343個(gè)基因。

GO富集分析結(jié)果表明，與TS群體相比，TZ群體生物學(xué)過(guò)程(Biological process)中富集到的受選擇基因主要集中在代謝過(guò)程(Metabolic process)、細(xì)胞進(jìn)程(Cellular process)以及生物學(xué)調(diào)控(Biological regulation)3個(gè)條目(圖7)。

KEGG富集分析結(jié)果(圖8)表明，與TS群體相比，TZ群體受選擇基因主要集中在脂肪酸代謝相關(guān)的5個(gè)通路中，包括亞油酸代謝通路、甘油磷脂代謝通路、不飽和脂肪酸生物合成通路、花生四烯酸代謝通路、α亞麻酸代謝通路。

3 結(jié)論與討論

種群遺傳多樣性的研究是保護(hù)生物學(xué)研究的主要內(nèi)容之一[16]。制定科學(xué)合理的保護(hù)策略需要建立在對(duì)物種遺傳多樣性成分了解的基礎(chǔ)上，而基于DNA序列變異的分析策略則成為研究物種遺傳多樣性的主流方法，也是衡量遺傳結(jié)構(gòu)和監(jiān)測(cè)保種效果的主要手段。

前期筆者所在課題組對(duì)TS群體、TC群體、TK群體進(jìn)行了簡(jiǎn)化基因組測(cè)序[7]，分析了TC群體、TK群體的保種效果。為全面了解太湖鵝品種在江蘇省保種效果動(dòng)態(tài)變化過(guò)程以及與浙江省的保種情況比較，本試驗(yàn)利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序?qū)S群體、TC群體、TK群體以及TZ群體進(jìn)行了系統(tǒng)比較分析。前期研究發(fā)現(xiàn)，TC群體和TK群體的近交系數(shù)分別為0.140 9和0.131 5[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，2個(gè)世代后的TC群體和TK群體的近交系數(shù)分別降低到0.087 5和0.075 3。由于前期2個(gè)群體都進(jìn)行了嚴(yán)格的家系等量隨機(jī)選配，近交系數(shù)的降低說(shuō)明該方法在小群保種中具有一定的效果。該方法在張學(xué)余等[17]對(duì)狼山雞的保種中得到了證實(shí)，其采用家系等量隨機(jī)選配法使得近交系數(shù)下降了65%。另外，2018年TC群體適當(dāng)引入了TK群體的血統(tǒng)，這可能也是TC群體近交系數(shù)變小的一個(gè)因素，該遷移事件的發(fā)生在基因流分析中也得到了體現(xiàn)。TZ群體近交系數(shù)較高，達(dá)到了0.11，說(shuō)明與江蘇省太湖鵝群體相比，浙江原種場(chǎng)群體需要適當(dāng)增加保種群數(shù)量，以及引入其他地區(qū)太湖鵝血統(tǒng)，條件允許下可以使用家系等量隨機(jī)選配法，避免近交系數(shù)持續(xù)上升。

群體結(jié)構(gòu)分析、PCA分析均表明，江蘇省3個(gè)太湖鵝群體(TS、TC、TK)聚為一類，而TZ群體單獨(dú)聚為一類；群體間遺傳分化分析表明，TZ群體與TS、TC和TK群體分化系數(shù)均達(dá)到0.05左右，屬于中度分化[18]。這些結(jié)果說(shuō)明，由于地理位置的差異，浙江原種場(chǎng)太湖鵝群體與江蘇省太湖鵝群體差別較大。

對(duì)群體間分化程度最高的TZ和TS 2個(gè)群體進(jìn)行基于Fst和θπ比率的選擇信號(hào)分析，并對(duì)受選區(qū)域關(guān)聯(lián)的基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析，發(fā)現(xiàn)與脂肪酸代謝相關(guān)的通路得到了富集。該通路在課題組前期TC群體與TS群體比較中也得到了富集[7]，說(shuō)明在不同地區(qū)保種過(guò)程中這些通路的基因受到選擇是普遍且不可避免的。在保種過(guò)程中群體大小是有限的，即使沒有受到突變、選擇和遷移的影響，隨機(jī)漂變等因素也會(huì)使得群體的某些基因頻率發(fā)生變化[19]，最終某些基因受到選擇。本研究及前期研究均發(fā)現(xiàn)，脂肪酸代謝相關(guān)的基因得到選擇，這可能更多與保種環(huán)境的飼養(yǎng)條件、營(yíng)養(yǎng)水平和疾病控制等因素的變化有關(guān)[20]。

綜上，江蘇省太湖鵝群體保種效果較好，家系等量隨機(jī)選配法以及適當(dāng)血緣交換可以避免近交系數(shù)上升。