賀凌霄，薛 剛，孫聚濤，張智強(qiáng)，丁永樂(lè)，楊鐵釗，徐世曉，程昌合

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心，浙江 杭州 310024)

赤霉素與高等植物的生物合成調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理活動(dòng)發(fā)生互作[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥腺毛的生長(zhǎng)需要赤霉素進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[5-6]。煙草中，腺毛不僅能起到保護(hù)作用，還是一種重要的分泌器官，其分泌物與煙葉香氣質(zhì)和香氣量的形成存在密切關(guān)系[7]，且在一定程度上反映煙葉的某些品質(zhì)特性，如香氣、吃味等[8-9]。

赤霉素與煙草葉面腺毛主要分泌物(西柏烷類(lèi))同為二萜類(lèi)化合物，有共同的底物香葉基香葉基焦磷酸(Geranylgeranyl-PP，GGPP)。在赤霉素途徑中，GGPP經(jīng)柯巴基焦磷酸合酶(Ent-copalyl diphosphate synthase，CPS)、內(nèi)-貝殼杉烯合成酶(Ent-kaurene synthase，KS)的催化作用形成內(nèi)-貝殼杉烯(Ent-kaurene)，然后在內(nèi)-貝殼杉烯氧化酶(Ent-kaurene oxidase，KO)、內(nèi)-貝殼杉烯酸氧化酶(Ent-kaurenoic acid oxidase，KAO)氧化作用下轉(zhuǎn)化成GA12，后通過(guò)GA20-氧化酶(GA20-oxidase，GA20ox)、GA2-氧化酶 (GA2-oxidase，GA2ox) 等的作用合成具有生物活性的赤霉素[10-13]。而在西柏烷類(lèi)途徑中，首先，西柏三烯醇環(huán)化酶(Cembratrien-ol synthase，CBTS)經(jīng)CYC-1基因編碼[14]后，使GGPP發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，形成西柏三烯一醇[15]，然后在細(xì)胞色素 P450 羥化酶(Cytochrome P450 hydroxylase,CYP450)的作用下，西柏三烯一醇的第6位碳發(fā)生羥化反應(yīng)形成西柏三烯二醇[16]。

圍繞外源赤霉素對(duì)煙草生長(zhǎng)和品質(zhì)調(diào)控的影響，前人已開(kāi)展了一些研究。周繼華等[17]研究表明，對(duì)煙草外施一定濃度的赤霉素，煙株莖尖內(nèi)源赤霉素與生長(zhǎng)素含量提高，煙草株高與節(jié)間距顯著增加。李振華[18]研究發(fā)現(xiàn)，煙草種子在100 mg/L GA3溶液引發(fā)24 h后，胚根萌發(fā)更加整齊一致。王林等[19]探究發(fā)現(xiàn)，增施赤霉素及生長(zhǎng)素均可改善烤后煙葉的香氣成分、物理特性和化學(xué)成分，且濃度越高效果越優(yōu)。李浩亮等[20]發(fā)現(xiàn)，在打頂當(dāng)天噴施20 mg/L赤霉素可明顯提高烤后煙葉的鉀含量,降低上部煙葉煙堿含量,并使上部和中部煙葉的主要化學(xué)成分具有較好的協(xié)調(diào)性。截至目前，外施赤霉素對(duì)煙草的影響研究多集中在對(duì)株高和種子萌發(fā)的調(diào)控方面，且對(duì)烤煙品質(zhì)的影響多集中在理化性質(zhì)方面，對(duì)煙草葉面腺毛及香氣物質(zhì)的研究較少[21-22]。鑒于此，以烤煙品種中煙100、NC71為材料，于苗期噴施赤霉素，研究外源赤霉素對(duì)烤煙葉面腺毛密度及分泌物的影響，以期增加烤后煙葉中性致香成分萜類(lèi)降解產(chǎn)物的含量，提高煙葉品質(zhì)，同時(shí)為明確赤霉素在西柏烷類(lèi)物質(zhì)合成代謝途徑中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況及供試材料

試驗(yàn)于2019年在許昌市襄城縣王洛鎮(zhèn)進(jìn)行，選擇土壤肥力中上等且均勻、地勢(shì)平坦、排灌方便、前茬一致的生茬地塊作為試驗(yàn)地，土壤為褐土。供試烤煙品種為中煙100、NC71，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院育種實(shí)驗(yàn)室提供。赤霉素(GA3)粉劑(HPLC≥90.0%)由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共4個(gè)處理，分別為未經(jīng)赤霉素噴施的中煙100(ZY100)、NC71和經(jīng)赤霉素噴施的中煙100(ZY100G)、NC71(NC71G)?？緹熡?019年3月1日播種，5月1日移栽，移栽時(shí)對(duì)準(zhǔn)煙草莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)噴施赤霉素，噴施時(shí)間為傍晚17:30—18:30，噴施時(shí)液滴細(xì)小且均勻，用量以噴施部位藥液下滴為度。赤霉素噴施液由100 mg/L赤霉素和20 mL/L表面活性劑吐溫80組成，赤霉素質(zhì)量濃度設(shè)定參照劉超等[23]的方法。7月10日打頂，其他栽培措施按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范執(zhí)行。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 煙草腺毛形態(tài)觀察和腺毛密度統(tǒng)計(jì) 在中部葉葉齡50 d時(shí)取樣[24]，用2 g/L羅丹明B水溶液染色，葉片上表面朝上置于VHX-600V超景深顯微鏡(日本基恩士公司)下進(jìn)行腺毛形態(tài)觀察和腺毛密度統(tǒng)計(jì)。每個(gè)樣本取3個(gè)葉片，每個(gè)葉片觀察3個(gè)視野計(jì)數(shù)。

1.3.2 葉面腺毛分泌物含量測(cè)定 在中部葉葉齡60 d時(shí)取樣[24]，參照陳偉等[25]的方法，在煙葉主脈兩側(cè)分別截取直徑為9 cm的葉圓片共20片，將各處理葉圓片置于500 mL二氯甲烷中浸提。收集剩余的二氯甲烷加入10 g無(wú)水硫酸鈉，過(guò)濾后加入1 mL含正-17-烷醇的內(nèi)標(biāo)，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至50 mL，經(jīng)氮吹和衍生化反應(yīng)后，進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析。通過(guò)NIST12檢索譜庫(kù)定性,并使用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.3.3 中性致香成分含量檢測(cè) 同時(shí)蒸餾萃取裝置一端接入500 mL圓底燒瓶，加入10.000 g烤后煙樣(C3F)、1.0 g檸檬酸和350 mL蒸餾水，恒溫電熱套加熱；另一端接入250 mL圓底燒瓶，加入40 mL二氯甲烷、500 μL含硝基苯的內(nèi)標(biāo)，恒溫水浴鍋加熱。2.5 h后收集250 mL圓底燒瓶中的液體，加入10 g無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至1 mL左右，采用GC-MS進(jìn)行檢測(cè)分析。通過(guò)NIST12檢索譜庫(kù)定性，并使用內(nèi)標(biāo)法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量，并對(duì)測(cè)得的物質(zhì)按照姜慧娟[26]的方法進(jìn)行分類(lèi)。

1.3.4 內(nèi)源激素含量測(cè)定 噴施赤霉素后0、10、20、30、40、50、60、70 d，采集各處理中部葉 0.5 g新鮮煙草樣品，用液氮速凍后，存放于超低溫冰箱中，采用由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)化控中心提供的酶免疫試劑盒(ELISA)[27]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 煙草葉片總RNA的提取及基因表達(dá)分析 采用Plant RNA isolation Aid提取供試材料中部葉葉齡60 d時(shí)葉片總RNA，利用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme，R223-01)將待測(cè)RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，引物采用Roche LCPDS2軟件設(shè)計(jì)(表1)并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 熒光定量引物序列Tab.1 Sequences of fluorescence quantitative primers

利用ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒(Q311-03，Vazyme)在LightCycler?480Ⅱ型熒光定量PCR儀(Roche，Swiss)上進(jìn)行反應(yīng)。以NtL25為內(nèi)參基因，依據(jù)Ct值,計(jì)算相對(duì)表達(dá)量并作圖。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和作圖，使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源赤霉素對(duì)烤煙葉面腺毛形態(tài)和密度的影響

根據(jù)圖1可知，NC71G的腺毛長(zhǎng)度顯著高于其他處理，較未噴施的NC71顯著增加了118.95 μm；NC71、NC71G的腺毛直徑顯著大于ZY100、ZY100G；

腺毛密度表現(xiàn)為NC71G>NC71>ZY100G>ZY100，其中NC71G處理顯著高于NC71處理，ZY100G處理顯著高于ZY100，噴施赤霉素后烤煙葉面腺毛密度平均提高30.97%?？梢?jiàn)，噴施赤霉素有助于提高烤煙葉面腺毛密度。

2.2 外源赤霉素對(duì)烤煙葉面腺毛分泌物的影響

根據(jù)圖2可知，西柏烷類(lèi)在烤煙葉面腺毛分泌物中含量最高。中部葉葉齡60 d時(shí)，NC71的西柏烷類(lèi)含量明顯高于ZY100。噴施赤霉素后，2個(gè)烤煙品種西柏烷類(lèi)含量占比均有明顯增加，烷烴類(lèi)含量占比明顯減少。ZY100G、NC71G的西柏烷類(lèi)含量均高于未噴施赤霉素處理，分別提高40.91%、37.92%；葉面腺毛分泌物總含量分別提高了39.23%、35.64%，表明莖尖噴施赤霉素對(duì)烤煙葉面分泌物含量影響較大，特別是西柏烷類(lèi)含量，有助于提高煙葉的香味特征。

2.3 外源赤霉素對(duì)烤后煙葉中性致香成分的影響

根據(jù)圖3可知，新植二烯在中性致香成分中占比最大。葉面噴施赤霉素后，烤后煙葉類(lèi)西柏烷降解產(chǎn)物、類(lèi)胡蘿卜素降解產(chǎn)物、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物、芳香族氨基酸降解產(chǎn)物、其他類(lèi)中性致香成分含量均顯著增高，其中NC71G各類(lèi)中性致香成分含量顯著高于其他處理。噴施赤霉素后，2個(gè)烤煙品種類(lèi)西柏烷降解產(chǎn)物含量平均提高了70.35%，類(lèi)胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量平均提高了85.89%，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量平均提高了70.52%，芳香族氨基酸降解產(chǎn)物含量平均提高了86.76%，表明葉面噴施赤霉素對(duì)中性致香成分的影響較大，有助于提高烤煙的香味特征。

2.4 外源赤霉素對(duì)烤煙內(nèi)源赤霉素含量的影響

根據(jù)圖4可知，噴施赤霉素20～70 d，NC71G、ZY100G內(nèi)源赤霉素含量較未噴施赤霉素的NC71、ZY100顯著增加。噴施赤霉素后40 d，4個(gè)處理內(nèi)源赤霉素含量均達(dá)到高峰，之后逐漸下降。ZY100G在噴施赤霉素10 d后內(nèi)源赤霉素含量顯著高于其他處理，NC71G在噴施赤霉素20 d后內(nèi)源赤霉素含量顯著高于NC71，且與ZY100差異不顯著?？梢?jiàn)，苗期噴施赤霉素有助于增加烤煙植株內(nèi)源赤霉素含量，但不同品種間對(duì)外源赤霉素的響應(yīng)快慢存在差異。

2.5 外源赤霉素對(duì)烤煙赤霉素和西柏烷類(lèi)物質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)量的影響

根據(jù)圖5可知，噴施外源赤霉素后，2個(gè)烤煙品種CYC-1、CPS和GA20ox基因的表達(dá)量均上調(diào)，GA2ox基因的表達(dá)量下調(diào)。ZY100G除CPS表達(dá)量與ZY100差異不顯著外，CYC-1、GA20ox、GA2ox基因的表達(dá)量均與ZY100有顯著差異；NC71G 以上4個(gè)基因的表達(dá)量與NC71均有極顯著差異。

3 結(jié)論與討論

研究表明，細(xì)胞外赤霉素濃度高時(shí),赤霉素受體GA IN-SENSITIVE DWARF1(GID1)通過(guò)其C端結(jié)構(gòu)域與赤霉素結(jié)合并引發(fā)相關(guān)應(yīng)答反應(yīng)，從而提高內(nèi)源赤霉素含量[28]。本研究在噴施赤霉素后每隔10 d測(cè)定1次各處理內(nèi)源赤霉素的含量，發(fā)現(xiàn)苗期噴施赤霉素有助于增加植株內(nèi)源赤霉素的含量，同時(shí)赤霉素合成正調(diào)控基因CPS、GA20ox表達(dá)量上調(diào)，負(fù)調(diào)控基因GA2ox表達(dá)量下調(diào)。

腺毛是存在于大多數(shù)維管植物表面的表皮細(xì)胞突起，保護(hù)植物免受昆蟲(chóng)、食草動(dòng)物、紫外線和水分流失的侵害[29-30]。此前，有研究已確定，赤霉素在擬南芥腺毛生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要作用[5-6，31]。MATIAS-HERNANDEZ等[32]對(duì)轉(zhuǎn)錄因子TEMs功能的發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)調(diào)了赤霉素的運(yùn)輸和分布對(duì)擬南芥腺毛形成調(diào)控的重要性。本研究結(jié)果表明，外源赤霉素對(duì)烤煙葉面腺毛密度有正向調(diào)節(jié)作用，與前人研究結(jié)果[5-6]相近。有研究表明，赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)影響腺毛生長(zhǎng)關(guān)鍵基因的啟動(dòng)。在影響腺毛生長(zhǎng)的基因中，GLABRA1(GL1)和TRANSPARENT TESTA GLABRA(TTG)基因的作用是啟動(dòng)腺毛的生長(zhǎng)[33-34]，其中GL1蛋白序列與被赤霉素上調(diào)的Myb家族轉(zhuǎn)錄因子同源[35-36]，而TTG基因在腺毛形成中的功能可被與GA信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)R基因所替代[37]。

煙草葉面腺毛除保護(hù)葉片外，還會(huì)特異性合成并分泌二萜化合物等香味物質(zhì)[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，外源赤霉素提高了腺毛分泌物含量，其中，二萜化合物的主要組分類(lèi)西柏烷及其降解產(chǎn)物含量均有顯著增加，四萜類(lèi)物質(zhì)類(lèi)胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量顯著增加。有研究表明，腺毛密度是腺毛分泌物積累的基礎(chǔ)條件[39]。在青蒿的研究中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源赤霉素含量提高有利于其萜類(lèi)物質(zhì)含量的增加[40]。赤霉素是二萜化合物的一種，與西柏烷類(lèi)、類(lèi)胡蘿卜素的直接前體物質(zhì)脫落酸有著共同的前體物質(zhì)GGPP[10-12，41-42]。通過(guò)施加外源赤霉素可以增加內(nèi)源赤霉素的產(chǎn)生，節(jié)省了前體物質(zhì)GGPP在此合成途徑中的消耗，進(jìn)而增加了其他萜類(lèi)合成途徑前體物質(zhì)的可用量，提高了西柏三烯醇環(huán)化酶[43]、八氫番茄紅素合成酶(Phytoene synthase，PSY)[44]的活性，并促進(jìn)了西柏三烯醇環(huán)化酶的編碼基因CYC-1表達(dá)量的上調(diào)，從而增加了西柏烷類(lèi)、類(lèi)胡蘿卜素的合成與積累。

本研究發(fā)現(xiàn)，在苗期對(duì)煙草莖尖噴施外源赤霉素后，不僅有效增加了煙草葉面腺毛密度，并且通過(guò)增加煙草內(nèi)源赤霉素含量，提高了葉面腺毛分泌物萜類(lèi)物質(zhì)的含量，進(jìn)而增加了萜類(lèi)化合物西柏烷降解產(chǎn)物和類(lèi)胡蘿卜素降解產(chǎn)物的含量，表明外源赤霉素對(duì)烤煙葉面腺毛生長(zhǎng)具有正向調(diào)節(jié)作用，而且增加了葉面腺毛分泌物的含量，提高了煙葉質(zhì)量，為研究赤霉素在萜類(lèi)代謝中的作用提供了借鑒意義。