李慶飛，張曼楠，王夢夢，陳碧華，王廣印，周俊國，李新崢

(1.河南科技學(xué)院 園藝園林學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453003；2.河南省園藝植物資源利用與種質(zhì)創(chuàng)新工程研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

南瓜是葫蘆科南瓜屬的1年生蔓性草本植物，在世界各地廣泛栽培，主要栽培種有中國南瓜(CucurbitamoschataD.)、印度南瓜(CucurbitamaximaD.)和美洲南瓜(CucurbitapepoL.)，其中，中國南瓜栽培范圍最為廣泛[1]。南瓜是一種具有較高營養(yǎng)價值和藥用價值的蔬菜作物[2-3]，且因口感好而備受人們喜愛。南瓜是典型的雌雄異花同株植物，雜種優(yōu)勢明顯，南瓜的性別決定是南瓜雜交優(yōu)勢利用的基礎(chǔ)。南瓜屬植物的花性別分化表現(xiàn)為，基部節(jié)位首先著生雄花，雄花產(chǎn)生后，雌花和雄花交替產(chǎn)生，最后階段多產(chǎn)生雌花，但總體雄花的比例遠(yuǎn)高于雌花。葫蘆科植物的性別表達(dá)受遺傳、激素和環(huán)境等多種因子調(diào)控。目前已報道的參與植物花性別分化的激素有多種，包括乙烯、生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸、茉莉酸等[4-10]。

乙烯在葫蘆科作物花性別表達(dá)和花發(fā)育中起著決定性作用。乙烯被認(rèn)為是潛在的促雌激素，外源乙烯或乙烯釋放劑可以增加雌花的數(shù)量[11-12]。乙烯抑制劑硝酸銀可以導(dǎo)致乙烯合成途徑中的ACC合成酶基因ACS受到抑制，乙烯合成減少，誘導(dǎo)西瓜純雌植株雄性化[13]。葫蘆科作物中，黃瓜的花性別分化研究已較為深入。研究表明，黃瓜花性別分化受F、M和A基因的控制[14]。3個基因都編碼乙烯合成途徑中的關(guān)鍵限速酶1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶(ACS)[15]。除ACS外，乙烯合成途徑中的另一關(guān)鍵酶1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)在雌花的發(fā)育中也扮演著重要的角色。研究表明，ACO基因?qū)Υ苹ㄐ钠さ陌l(fā)育至關(guān)重要，黃瓜CsACO2基因突變，導(dǎo)致植株莖尖組織中的乙烯損失50%，進一步導(dǎo)致突變植株只著生雄花[16]。在其他作物中研究發(fā)現(xiàn)，施加外源乙烯利后，其ACO的表達(dá)量升高[17-18]。乙烯信號響應(yīng)基因也參與了瓜類作物的花性別分化。乙烯可以通過乙烯接受體CsETR1特異地誘導(dǎo)黃瓜花藥原基的DNA損傷，從而抑制雌花中雄蕊的發(fā)育[6,19-21]。研究發(fā)現(xiàn)，外源施用乙烯利后，乙烯受體基因CS-ETR2和CS-ERS的轉(zhuǎn)錄水平提高，而施用乙烯合成抑制劑AVG時二者的轉(zhuǎn)錄水平被抑制[22]。由此可見，在其他作物中乙烯關(guān)鍵合成酶基因ACO和乙烯接受體基因ETR對乙烯利和乙烯抑制劑具有一定的響應(yīng)。

生產(chǎn)中乙烯利與乙烯抑制劑常被用作黃瓜、西瓜、甜瓜的促雌促雄劑，但其作用機制尚不明確，且在南瓜屬中應(yīng)用較少，尤其是栽培面積最為廣泛的中國南瓜，其應(yīng)用劑量及作用效果鮮有報道。為了明確乙烯利與乙烯抑制劑對中國南瓜花性別分化的作用，以3份中國南瓜自交系為材料，研究乙烯利和乙烯抑制劑硫代硫酸銀(STS)處理對中國南瓜花性別分化的影響，探究乙烯關(guān)鍵合成酶基因ACO和乙烯接受體基因ETR對乙烯利和乙烯抑制劑處理的響應(yīng)，以期為生產(chǎn)中提高南瓜坐果率、控制花期，進一步深入了解外源激素處理對內(nèi)源基因水平的影響，以及揭示乙烯利與乙烯抑制劑調(diào)控瓜類作物花性別分化的作用機制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用3個中國南瓜自交系336、229-1、6-10均為河南科技學(xué)院南瓜課題組保存的高代自交系，表型性狀穩(wěn)定一致。所用試劑為 0.1% Tween-20、乙烯利(100 mg/L)和乙烯抑制劑硫代硫酸銀(STS，600 mg/L，由硝酸銀和硫代硫酸鈉溶液配制而成)。配制STS時，以銀離子濃度為準(zhǔn)，將配制好的硝酸銀緩慢倒入配制好的硫代硫酸鈉溶液中，混勻，溶液由蒸餾水配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料的種植 選用飽滿無病蟲的南瓜種子進行浸種催芽。露白后移至28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽，待芽生長至0.2～0.4 cm時，將南瓜播種于直徑為34 cm的塑料栽培盆中，每個自交系種植15株，生長期間不同自交系植株保持相同田間管理。待南瓜長至幼苗期3～4片真葉展開時(南瓜花性別分化的決定時期)，對生長點分別進行乙烯利和STS處理。

1.2.2 乙烯利和STS的處理及指標(biāo)測定 分別用乙烯利(100 mg/L)、STS(600 mg/L)和0.1% Tween-20(對照)噴施南瓜植株生長點，每個處理重復(fù)5次，處理濃度參照楊曉霞等[23]的方法。噴施時，使生長點濕潤且不滴液為止，每隔2 d噴施1次，共噴施3次。處理后觀察其對幼苗表型的影響，并在開花結(jié)瓜期調(diào)查南瓜主莖20節(jié)以內(nèi)的雌花數(shù)量、雄花數(shù)量、第一雌花節(jié)位以及雌雄花器官結(jié)構(gòu)的變化，以確定乙烯對南瓜花性別分化及發(fā)育的影響。

1.2.3 葉片乙烯相關(guān)基因ACO和ETR的表達(dá)分析 分別取乙烯利及STS處理2 h的南瓜幼苗生長點和未處理的生長點附近葉片，檢測乙烯合成酶基因ACO及乙烯受體基因ETR的表達(dá)水平。利用Primer Premier 5.0軟件進行熒光定量引物的設(shè)計，引物序列見表1。采用Takara公司的RNA提取及熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行葉片總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄。熒光定量PCR按照Takara公司的SYBR?Premix ExTaqTMⅡ熒光染料說明書進行。以南瓜β-Actin7為內(nèi)參基因。擴增反應(yīng)為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，62 ℃退火并延伸30 s，40個循環(huán)。每個樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。用 2-ΔΔCT法獲得目標(biāo)基因的相對表達(dá)量[24]。

表1 熒光定量表達(dá)分析所用引物序列Tab.1 Primer sequences used in qRT-PCR analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 乙烯利和STS對中國南瓜幼苗及花發(fā)育的影響

對乙烯利和STS處理后的南瓜幼苗進行性狀觀察，未發(fā)現(xiàn)對南瓜幼苗生長產(chǎn)生明顯影響。圖1為乙烯利和STS處理2 d的幼苗。后期對南瓜雌花、雄花器官的結(jié)構(gòu)進行觀察，也未發(fā)現(xiàn)明顯異常，說明乙烯利與STS的處理濃度比較適宜用來調(diào)控中國南瓜的花性別分化，不會對植株幼苗及花器官結(jié)構(gòu)的發(fā)育產(chǎn)生影響。

2.2 乙烯利和STS對中國南瓜花性別表達(dá)的影響

通過對乙烯利及STS處理后3個南瓜自交系的第一雌花節(jié)位以及20節(jié)內(nèi)的雌花數(shù)量及雄花數(shù)量調(diào)查發(fā)現(xiàn)，乙烯利處理后，3個自交系的第一雌花節(jié)位都顯著降低；雌花數(shù)量都有所增加，除自交系6-10增加不顯著外，自交系336和229-1都達(dá)到顯著水平；6-10雄花數(shù)量顯著減少，336和229-1乙烯利處理后雄花數(shù)量沒有顯著變化(表2)。說明乙烯利處理可以顯著降低第一雌花節(jié)位，增加雌花數(shù)量，而對雄花數(shù)量的影響在不同自交系中存在差異，或顯著減少雄花數(shù)量或?qū)π刍〝?shù)量無顯著影響。STS處理后，3個自交系的第一雌花節(jié)位都顯著升高，即第一雌花出現(xiàn)延遲；3個自交系的雄花數(shù)量都有所增加，其中自交系366和229-1雄花數(shù)量增加顯著，6-10增加不顯著；雌花產(chǎn)生數(shù)量表現(xiàn)為明顯降低，其中自交系229-1雌花數(shù)量減少最為顯著(表2)。說明STS處理對第一雌花節(jié)位和雄花數(shù)量影響較大，可以顯著延遲第一雌花的產(chǎn)生并增加雄花數(shù)量，減少雌花數(shù)量，其對雄花數(shù)量的增加程度和雌花數(shù)量的減少程度在不同自交系間存在差異。

表2 乙烯利及STS對中國南瓜第一雌花節(jié)位及20節(jié)內(nèi)雌花數(shù)量和雄花數(shù)量的影響Tab.2 Effects of ethephon and STS on the node of first female flower and the number of female and male flowers within 20 nodes

2.3 乙烯利和STS對葉片ACO及ETR表達(dá)水平的影響

由圖2可見，乙烯利處理后，葉片乙烯合成酶基因ACO和乙烯受體基因ETR的表達(dá)水平具有相似的變化趨勢，都表現(xiàn)為乙烯利處理使其表達(dá)量增加，STS處理使其表達(dá)量降低。這說明乙烯利和乙烯抑制劑STS處理不僅能影響內(nèi)源乙烯的合成,還會影響乙烯的響應(yīng)。乙烯利處理促進了ACO和ETR的轉(zhuǎn)錄，而STS抑制了ACO和ETR的轉(zhuǎn)錄。

3 結(jié)論與討論

南瓜是典型的雌雄異花同株植物。雌花的數(shù)量和比例直接關(guān)系到瓜類作物的產(chǎn)量。研究表明，植物激素尤其乙烯在葫蘆科瓜類作物性別分化中具有重要作用[4-5,10-11,25]。乙烯利常被用來促進瓜類作物雌花的產(chǎn)生。外源乙烯或乙烯釋放劑處理可以增加雌雄同株或雄性株中雌花的數(shù)量，乙烯抑制劑硝酸銀處理可以抑制乙烯合成途徑中ACS基因的表達(dá)，乙烯合成減少，誘導(dǎo)西瓜純雌植株雄性化[11-13]。然而，在瓜類作物中乙烯合成途徑中調(diào)控雌花發(fā)育的關(guān)鍵基因ACO對外源乙烯及乙烯抑制劑處理的響應(yīng)尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，乙烯利處理南瓜幼苗生長點會使葉片中ACO表達(dá)量升高，這與朱敏等[17]和雷明等[18]的研究結(jié)果一致。關(guān)于乙烯信號響應(yīng)基因，在黃瓜中，施用外源乙烯利會使CS-ETR2和CS-ERS的轉(zhuǎn)錄水平被提高，而施用乙烯抑制劑氨基乙氧基乙烯甘氨酸(AVG)時二者的轉(zhuǎn)錄水平被抑制[6,19-22]。本研究結(jié)果顯示，乙烯利處理使乙烯接受體基因ETR表達(dá)水平上升，乙烯抑制劑STS處理使其表達(dá)水平下降，與以上黃瓜[22]中的研究結(jié)果相似。這說明乙烯利和乙烯抑制劑對乙烯合成基因和響應(yīng)基因在轉(zhuǎn)錄水平上都有一定的影響。

另外，本研究通過乙烯利和乙烯抑制劑STS處理中國南瓜發(fā)現(xiàn)，乙烯利可以顯著降低第一雌花節(jié)位，促進雌花的產(chǎn)生；STS處理延遲了第一雌花的產(chǎn)生并增加雄花數(shù)量，該研究結(jié)果與楊曉霞等[23]的研究結(jié)果一致，但本研究還進一步探究了乙烯利和STS對乙烯主要合成和響應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。研究結(jié)果暗示，乙烯利顯著降低第一雌花節(jié)位，促進雌花的產(chǎn)生可能與其誘導(dǎo)乙烯合成基因ACO及受體基因ETR的高表達(dá)有關(guān)。STS處理后植株第一雌花的產(chǎn)生表現(xiàn)延遲并增加了雄花數(shù)量，可能與其抑制了乙烯合成基因ACO及受體基因ETR的表達(dá)有關(guān)；該研究結(jié)果與ZHANG等[13]研究發(fā)現(xiàn)的乙烯抑制劑硝酸銀可以導(dǎo)致ACS基因受到抑制，從而誘導(dǎo)西瓜植株雄性化的結(jié)果相呼應(yīng)。

該研究結(jié)果從生理和分子兩方面，探究乙烯利與乙烯抑制劑處理對中國南瓜花性別分化和對乙烯合成基因和受體基因表達(dá)的影響，不僅為生產(chǎn)中調(diào)控中國南瓜的花性別分化提供了研究基礎(chǔ)，同時也為闡明外源激素及激素抑制劑誘導(dǎo)雌花、雄花的分子機制奠定了基礎(chǔ)。