周紅梅，丁海艷，方全，方理剛，林雪

左心室心肌致密化不全（left ventricular noncompaction，LVNC）為胚胎期心外膜向心內(nèi)膜致密化過程的失敗，導致的心肌組織形成無功能的肌小梁和致密層心肌變薄的疾病。LVNC 的臨床表現(xiàn)從無癥狀到難治性心力衰竭、猝死和血栓事件[1-3]。我們認為LVNC 患者心肌致密化層的組織學改變，尤其是纖維化程度，在此基礎上導致或者合并心肌重構(gòu)，可能是LVNC 患者臨床表現(xiàn)不同的原因。在臨床中尋找與心肌重構(gòu)相關(guān)的方便可靠的、可反映致密層心肌組織改變的指標，有助于在具有LVNC 表型患者中篩查出預后不良患者。

近年來研究顯示，心臟核磁共振（CMR）Native T1 mapping 可以有效早期檢測并定量心肌纖維化[4-5]。但對于LVNC 患者致密層心肌Native T1 mapping 定量檢測是否存在異常鮮有研究。我們前期研究顯示，致密層Native T1 值與QTc 間期有顯著的相關(guān)性；QTc 間期越長，Native T1 值越高，且預后較差[6]。

此外，基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）是臨床研究中常用的與組織重構(gòu)相關(guān)的指標，在心肌纖維化的進程發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，尤其在終末期心力衰竭中MMP-9 顯著增加，與病理性心肌重構(gòu)密切相關(guān)[7-8]。在本探索性研究中，我們探討了LVNC 患者致密層心肌Native T1 mapping 定量數(shù)值與心肌重構(gòu)指標MMP-9 之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

研究納入2008 年12 月至2014 年6 月期間在北京協(xié)和醫(yī)院就診，經(jīng)兩名資深的心內(nèi)科醫(yī)師通過超聲心動圖學檢查確診的32 例LVNC 患者，排除禁忌證后進行CMR 掃描。1 例患者因核磁圖像質(zhì)量不佳被剔除，最終31 例LVNC 患者納入LVNC 組，其中男性17 例，女性14 例，年齡16～65 歲，平均年齡（42.1±15.2）歲。納入標準：經(jīng)臨床確診為LVNC、NYHA 心功能Ⅰ～Ⅲ級。排除標準：LVNC患者NYHA 心功能Ⅳ級、植入心臟起搏器或金屬置入體內(nèi)者、幽閉恐懼癥者及妊娠女性。另招募性別和年齡相匹配的健康志愿者（均為LVNC 患者家屬）10 名為健康對照組。健康對照組入組標準：無心血管疾病危險因素，包括無吸煙史、高血壓、高血脂、糖尿病等疾病病史；無長期服藥史，無幽閉恐懼癥，無釓對比劑過敏，無金屬置入體內(nèi)者，常規(guī)十二導聯(lián)心電圖、超聲心動圖、血常規(guī)、肝功能、腎功能及血脂檢查均正常。本研究經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試對象均簽署知情同意書。

1.2 心臟核磁共振掃描方法

采用荷蘭Achieva TX,Philips 3.0 T 超導型磁共振儀，梯度場強45 mT/m，切換率每秒200 T/m。采用胸前置32 通道心臟線圈（InVivo,Gainesville,Florida,美國），心電門控R 波觸發(fā)成像。所有受試者均行心臟電影成像（CINE）序列：門控導航的穩(wěn)態(tài)自由進動梯度回波電影序列（bSSFP）掃描參數(shù)：TR 270 ms、TE 1.3 ms、體系（voxel）大小1.8 mm3×1.5 mm3×8.0 mm3，反轉(zhuǎn)角35°、層厚8 mm、層間空隙2 mm。MOLLI序列：在圖像采集過程中要求患者屏氣，通過兩個反轉(zhuǎn)脈沖，在11 個心臟周期中共采集8 幅具有不同翻轉(zhuǎn)時間的T1 權(quán)重的圖像。圖像來自左心室中部的短軸位，共采集三層，層間隔為20 mm，全部圖像可以覆蓋心臟中部的50 mm 以內(nèi)范圍。詳細的成像參數(shù)為:bSSFP 單次激發(fā)數(shù)據(jù)采集方式，TR/TE=2.5/1.1 ms，F(xiàn)OV:300 mm× 150 mm，voxel 大?。?.5 mm3× 1.5 mm3× 10.0 mm3，35°翻轉(zhuǎn)角。

1.3 CINE 圖像分析

由兩名有經(jīng)驗的心內(nèi)科及磁共振診斷醫(yī)師閱片。依據(jù)美國心臟協(xié)會（AHA）標準17 節(jié)段分段法[9]，在CINE 圖像上統(tǒng)計每例LVNC 患者非致密層心?。∟C）的部位和數(shù)量。在左心室舒張末期長軸位測量致密層心?。–）厚度、NC 厚度。統(tǒng)計NC 的最大厚度及相對應的C 值，并計算相應的NC/C值。在CINE 圖像上定量分析左心室舒張末期容積（LVEDV）、左心室收縮末期容積（LVESV）、左心室射血分數(shù)（LVEF）和左心室致密層心肌質(zhì)量（LVCM），測量分析LVCM 時未包括乳頭肌質(zhì)量。另外，由于NC 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與心腔內(nèi)血液相通，在分析時很難區(qū)分血液信號和NC 信號，故未計算NC質(zhì)量。以上分析有兩名核磁圖像分析超過2 年的研究者在MATLAB（MathWorks,Natick,Massachusetts，美國）平臺上進行，手工測量每個心動周期從心尖到基底部的每個相位的圖像。

1.4 外周血MMP-9 實時PCR 和蛋白表達檢測

LVNC 組患者及健康對照組受試者均在空腹時靜脈采血2 ml。血樣放入1.5 mg/ml 的乙二胺四乙酸（EDTA）試管中，離心10 min（3 000 轉(zhuǎn)/min）。提取信使RNA（mRNA）主要應用試劑有Trizol 裂解液（Sigma 公司，美國），紫外分光光度計上測定RNA 的吸光光度值。mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA（cDNA）主要應用試劑有Easy Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。實時PCR 引物MMP-9 Forward:TGTACCGCTATGGTTACACTCG，MMP-9，Reverse:GGCAGGGACAGTTGCTTCT，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GRAPH）引物Forward:5'-TCAACGGATTTGGTCGTATT-3',Reverse:5'-CTGTGGTCATGAGTCCTTCC-3'。RNeasy Mini Kit總RNA 提取試劑盒（QIAGEN 公司，德國）、cDNA Archive Kit（Applied Biosystems 公司，美國）；GRAPH 試劑盒（Thermo Scientific 公司，美國）。外周血MMP-9 含量采用ELISA 試劑盒（R&D 公司，美國）測定，具體操作步驟根據(jù)操作指南進行。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析。所有連續(xù)變量值用均數(shù)±標準差表示。組間比較采用非參數(shù)Mann-Whitney 檢驗。采用Spearman 非參數(shù)檢驗分析外周血MMP-9 蛋白與Native T1 值之間的關(guān)系。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LVNC 組與健康對照組的臨床基本資料比較（表1）

LVNC 組與健康對照組的性別、年齡、體表面積的差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），除高血壓外，兩組的其他心血管危險因素的差異也均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。LVNC 組患者中有9 例（29.0%）有LVNC 家族史，24 例（77.4%）患者有胸痛/胸悶癥狀，10 例（32.3%）患者有心悸，2 例（6.5%）患者有系統(tǒng)性血栓，23 例（74.2%）存在心電圖異常。

表1 LVNC 組與健康對照組的臨床基本資料比較[例（%）]

2.2 LVNC 組與健康對照組的CMR 的CINE 結(jié)果比較（表2）

LVNC 患者CMR 顯示網(wǎng)狀樣的非致密化心肌顯著增多（圖1）。在校正體表面積后，兩組的左心室舒張末期容積指數(shù)（LVEDVI）、左心室收縮末期容積指數(shù)（LVESVI）及LVEF 差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.001）。

2.3 LVNC 組與健康對照組的致密層心肌Native T1值比較

健康對照組1 例受試者和LVNC 組1 例患者的Native T1 maps 圖像見圖2。數(shù)據(jù)分析顯示，LVNC 組患者Native T1 值高于健康對照組[（1 159.0±47.4）ms vs.（1 096.0±41.5）ms，P＜0.001]。

2.4 外周血MMP-9 mRNA 水平及MMP-9 蛋白水平（圖3）

LVNC 組MMP-9 mRNA 水平顯著高于健康對照組（19.59±17.76 vs.1.76±0.72，P=0.003）。LVNC組MMP-9 蛋白水平顯著高于健康對照組[（92.44±62.26）ng/ml vs.（58.32± 28.19）ng/ml，P=0.025]。

2.5 外周血MMP-9 蛋白與Native T1 值的相關(guān)性分析（圖4）

Spearman 非參數(shù)檢驗結(jié)果顯示，LVNC 患者外周血MMP-9 蛋白水平與Native T 值呈顯著正相關(guān)（r=0.40，P=0.044）。

表2 兩組心臟核磁共振成像參數(shù)比較（±s）

表2 兩組心臟核磁共振成像參數(shù)比較（±s）

注：LVNC：左心室心肌致密化不全

圖1 一例LVNC 患者的心臟核磁共振成像檢查結(jié)果

圖2 健康對照組和LVNC 組患者的Native T1 maps 圖像

圖3 兩組外周血MMP-9 mRNA 水平及MMP-9 蛋白水平比較

圖4 Spearman 非參數(shù)檢驗結(jié)果

3 討論

本組研究中發(fā)現(xiàn)，LVNC 患者致密層心肌的Native T1 值、MMP-9 mRNA 水平及蛋白水平的表達均顯著高于健康對照組，且外周血MMP-9 的濃度與Native T1 值呈正相關(guān)。

根據(jù)既往的臨床工作積累推測，LVNC 患者已經(jīng)存在的致密層心肌纖維化，并在此基礎上出現(xiàn)心臟重構(gòu)，可能是導致疾病進展的使動因素。LVNC的臨床表現(xiàn)多樣，預后不同，可能因為目前多種診斷標準主要基于不同心臟平面非致密化心肌與致密化心肌的厚度之比來進行形態(tài)學診斷，但這些診斷標準無心肌組織特征，無運動功能評價，無生物學診斷內(nèi)容[10]，Kohli 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在無心臟疾病的受試者中有8%的人群滿足目前LVNC 的超聲心動圖診斷標準。在影像學表現(xiàn)類似的患者中，致密層的組織學改變尤其應該受到重視。LVNC 患者多數(shù)存在致密層厚度減少，但是鮮有研究探索致密層的組織學改變。本研究結(jié)果中LVNC 患者致密層心肌的Native T1 值顯著高于健康對照組，提示致密層心肌存在纖維化，這與既往研究一致[12]。

心肌Native T1 值可以直觀反映心肌組織病變異常程度，Native T1 mapping 是近些年新發(fā)展起來的用于評估心肌組織特征的一項新技術(shù)，可以提高疾病的診斷水平、判斷疾病的受累程度及潛在的預后。Native T1 參數(shù)是指組織的T1 常數(shù)經(jīng)過展縮編碼到對應的圖像區(qū)域的灰度值中，用來衡量組織成分的變化[4-5]。它不需要釓對比劑，適用于腎功能異常及對比劑過敏的患者[13]。目前Native T1 mapping 已被應用于擴張型心肌病[14]、肥厚型心肌病[15]和急性心肌梗死[16-17]等疾病中，用于評價心肌纖維化病變程度，并且有研究發(fā)現(xiàn)在評價心肌纖維化方面優(yōu)于釓對比劑延遲強化（LGE）技術(shù)，Native T1 mapping 在檢測心肌纖維化方面與心肌活檢有較高的一致性。同時有研究顯示Native T1 mapping 作為一種可量化的技術(shù)，可以用于疾病活動的分級、監(jiān)測進展和指導治療。Native T1 mapping 彌補了LGE 對彌漫性心肌纖維化識別不足的缺點，比LGE 更加敏感，能早期發(fā)現(xiàn)心肌病變。盡管心肌活檢是目前檢測心肌纖維化的“金標準”，但為有創(chuàng)檢查，并發(fā)癥風險較大，且受標本取材的局域性影響，患者難以接受等，不能作為臨床工作中的常規(guī)檢查，因此目前Native T1 mapping 被認為是比心肌活檢更為優(yōu)越的無創(chuàng)檢測心肌纖維化的方法。

為探索致密層心肌的組織學改變是否會伴隨一定程度的心肌重構(gòu)，本研究對LVNC 患者外周血MMP-9 的水平進行了定量分析，發(fā)現(xiàn)LVNC 患者的MMP-9 mRNA 水平及蛋白水平均顯著高于健康對照組，與既往很多研究結(jié)果一致[18-19]。MMP-9 在許多心血管疾病中參與了心肌重構(gòu)的過程，MMP-9 上調(diào)導致了與內(nèi)源性MMP 抑制物失衡，造成了細胞外基質(zhì)合成與降解的動態(tài)平衡被打破，細胞外基質(zhì)沉積，進一步導致炎癥細胞的聚集，炎癥細胞分泌一些細胞因子及生長因子，從而又加劇了心肌重構(gòu)的進程[20]。

同時本組研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MMP-9 蛋白水平與致密層心肌Native T1 值正相關(guān)，意味著在致密心肌出現(xiàn)纖維化的同時，已經(jīng)伴隨出現(xiàn)了心肌重構(gòu)。心肌重構(gòu)的原因一方面可能來自于先天的心肌發(fā)育障礙，但同時也有可能是因為合并了導致或者加重心肌重構(gòu)的伴隨因素。在臨床中我們也觀察到不少具有LVNC 表型的患者，在一定的誘因情況下出現(xiàn)嚴重的心力衰竭甚至心室內(nèi)血栓形成，尤其在具有家族史的患者中更為明顯，經(jīng)過積極治療后這些患者的心功能可以全部或者部分恢復，這意味著LVNC 患者更容易受到誘因影響，導致心力衰竭，因此對于具有LVNC 表型的患者控制心血管危險因素如高血壓、糖尿病、容量負荷過重和病毒感染等非常重要，而這些危險因素往往也是導致心室重構(gòu)的重原因。

本研究是一個小樣本的探索性研究，樣本量雖小，初步證實了LVNC 患者致密層心肌改變可能與心肌重構(gòu)指標相關(guān)，需在更大規(guī)模和長期隨訪中進一步明確致密層T1 mapping 數(shù)值評估預后的閾值。Native T1 mapping 也有一定局限性，例如易受一些參數(shù)的影響，如機器方面，不同廠家、不同型號的機器標準值均不一樣，同時標準值受磁場影響也較大；另外，Native T1 值也受患者的自身生理參數(shù)如心率、紅細胞壓積等因素影響[5]。未來將進一步研究，采用細胞外容積比（ECV）方法減輕其局限性。

總之，LVNC 患者致密層心肌Native T1 值顯著增高，且與血清中MMP-9 的表達有較高的一致性，提示LVNC 患者致密層心肌的組織學改變與心肌重構(gòu)可能有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突