高淑紅，蘇珍枝，楊琳嬌，李震宇*

1.山西藥科職業(yè)學(xué)院，山西 太原 030031

2.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006

龍葵為茄科植物龍葵Solanum nigrumL.的干燥全草，別名苦葵、水茄、老鴉酸漿草等[1]。性寒，味苦、微甘，歸肺、胃、膀胱經(jīng)，具清熱解毒、活血散瘀、利水消腫、止咳祛痰之功效，臨床廣泛用于抗炎、抗休克、抗病毒及抗腫瘤等方面[2]。

近年來(lái)對(duì)龍葵的化學(xué)成分進(jìn)行了大量研究，顯示龍葵全草中含有多種甾體生物堿，其中以澳洲茄堿和澳洲茄邊堿的含量最高[3]；此外，從龍葵全草分離得到了以薯蕷皂苷元和替告皂苷元為母核的甾體皂苷化合物，以及黃酮類(lèi)化合物、小分子有機(jī)酸類(lèi)等化合物[4-5]。另有針對(duì)龍葵果、龍葵葉等進(jìn)行化學(xué)成分研究，顯示龍葵果中含有生物堿、氨基酸、色素等化學(xué)成分[6]，葉中含有生物堿、甾體皂苷類(lèi)化合物等[7-8]。龍葵的藥用部位是全草，通過(guò)本課題組的調(diào)查分析，全草中包括龍葵莖、葉、果，其中以莖為主，占到龍葵藥材質(zhì)量的60%以上。但目前化學(xué)研究未見(jiàn)對(duì)莖化學(xué)成分的單獨(dú)報(bào)道。鑒于莖在龍葵藥材中占有較大比重，有必要對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)分析。

近年來(lái)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在中藥化學(xué)成分快速識(shí)別中得到了廣泛的應(yīng)用，如有研究采用UPLC-QTOF-MS 技術(shù)從刺梨籽中鑒定55 個(gè)化學(xué)成分[9]；運(yùn)用UHPLC-Q-Orbitrap MS 技術(shù)從紅花中鑒定出135個(gè)次生代謝物[10]。核磁共振氫譜（1H-NMR）具有重現(xiàn)性好、分析時(shí)間短、備樣方法簡(jiǎn)單、可以檢測(cè)大部分含氫化合物等優(yōu)勢(shì)，尤其適用于檢測(cè)色譜柱上不保留的強(qiáng)極性化合物，與液質(zhì)聯(lián)用分析具有互補(bǔ)性。因此本實(shí)驗(yàn)擬采用UHPLC-Q Exactive 高分辨質(zhì)譜與核磁共振氫譜（1H-NMR）結(jié)合對(duì)龍葵莖的化學(xué)成分進(jìn)行快速識(shí)別。

1 儀器與試劑

Thermo fisher U3000 超高效液相色譜儀，配置在線(xiàn)脫氣機(jī)、四元梯度泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)賽默飛世爾科技公司），ThermoScientificTMQ Exactive 組合型四極桿Orbitrap 質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；Bruker 600 MHz Avance III NMR波譜儀（德國(guó)布魯克公司），十萬(wàn)分之一天平（梅特勒?托利多儀器有限公司）；KQ5200E 超聲波清洗器，XK-80A 快速混勻器（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）。

龍葵2019年8月采集于山西省五臺(tái)縣蔣坊鄉(xiāng)，由山西藥科職業(yè)學(xué)院劉林鳳教授鑒定為茄科茄屬植物龍葵S.nigrumL.的全草。NMR 試劑重水（Norell，Landisville，美國(guó)）、氘代甲醇（99.8%，Merck，德國(guó)）、氘代三甲基硅烷丙酸鈉鹽（TSP，Cambridge Isotope Laboratories Inc，MA，美國(guó)），甲醇（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠），甲酸、乙腈（質(zhì)譜純，美國(guó)Thermo 公司），超純水由Milli-Q 純凈水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）制備。對(duì)照品澳洲茄胺（批號(hào)19121-58-5，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥94.5%）、澳洲茄堿（批號(hào)20318-30-3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%）均購(gòu)于上海安奈德化學(xué)技術(shù)中心；綠原酸（批號(hào)YJ-141004，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自江蘇永健醫(yī)藥有限公司。

2 方法

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫（0～15 min，5%～20% B；15～20 min，20%～35%B；20～30 min，35%～55% B）。柱溫為35 ℃，體積流量為0.25 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 Full MS/DD MS2（TOPN）：采用電噴霧離子源（HESI）；掃描方式采用正負(fù)離子同時(shí)掃描；毛細(xì)管溫度為320 ℃；鞘氣體積流量為241.5 kPa（35 psi），輔助氣體積流量為69 kPa（10 psi）；正離子模式下噴霧電壓為3.5 kV，負(fù)離子模式下噴霧電壓為2.5 kV，透鏡電壓為55 kPa；探頭加溫器溫度為300 ℃；最大噴霧電流為100 V；NEC：20，40，60；掃描質(zhì)量范圍為m/z80～1200，質(zhì)量分辨率為70 000。

2.2 核磁測(cè)定條件

樣品于600 MHz（25 ℃）NMR 儀（Bruker，Germany）上測(cè)定，采樣次數(shù)為64，譜寬12345.7 Hz，脈沖時(shí)間14 μs，采樣時(shí)間2.654 s，弛豫時(shí)間1.0 s，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)65 536，F(xiàn)ID 分辨率0.188 Hz，采樣間隔40.5 μs，手動(dòng)進(jìn)行相位調(diào)節(jié)、基線(xiàn)調(diào)節(jié)及峰校正。提取物核磁測(cè)定采用noesygppr1d 序列壓制水峰，內(nèi)標(biāo)為T(mén)SP。

2.3 供試品溶液的制備

取中等寬度的龍葵莖適量，粉碎，過(guò)80 目篩，精密稱(chēng)取粉末0.50 g，置于10 mL 玻璃管中，加50%甲醇水溶液6 mL，渦旋1 min，超聲提取25 min，放冷至室溫，3500 r/min 離心25 min，取上清液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，用于UPLC-Q Exactive MS分析。

精密稱(chēng)取液氮研磨后的藥材粉末0.50 g，過(guò)80目篩，置于10 mL 離心管中，加蒸餾水及甲醇各3 mL，渦旋混勻1 min，超聲提取25 min，室溫下3500 r/min 離心25 min，提取液減壓濃縮蒸干。測(cè)定前加入氘代甲醇300 μL 與氘代重水300 μL，復(fù)溶后轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，13 000 r/min 離心10 min，移取上清液500 μL于5 mm核磁管中，用于1H-NMR分析。

2.4 對(duì)照品溶液制備

稱(chēng)取澳洲茄胺和澳洲茄堿對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，轉(zhuǎn)置于5 mL 量瓶中用甲醇溶解，定容，分別配制質(zhì)量濃度為2.040、2.030 mg/mL 的母液，取適量母液，稀釋10 倍置于4 ℃冰箱，備用。

2.5 化合物結(jié)構(gòu)分析

采用Xcalibur3.2軟件對(duì)采集到的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、峰匹配分析處理。采集到的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discover 3.0 軟件中，保留時(shí)間設(shè)置在0～33 min，m/z80～1200，偏差為5×10?6，信噪比為3，保留時(shí)間偏移值為0.1 min；通過(guò)峰提取、搜索在線(xiàn)及本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)、化合物預(yù)測(cè)等數(shù)據(jù)處理，導(dǎo)出樣品名稱(chēng)、保留時(shí)間、分子式、質(zhì)荷比以及對(duì)應(yīng)的離子強(qiáng)度組成的數(shù)據(jù)集。核磁圖譜采用MestReNova（Version，8.0.1，Mestrelab Research，Santiago de Compostella，西班牙）軟件進(jìn)行處理。

3 結(jié)果

3.1 采用UHPLC-Q Exactive MS 表征龍葵莖中的化學(xué)成分

采用Xcalibur3.2 數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行分析處理，正、負(fù)模式下的總離子流圖見(jiàn)圖1，各峰獲得良好分離，從龍葵莖中共鑒定出68 個(gè)化合物（表1），包括生物堿5 個(gè)，皂苷28 個(gè)，游離氨基酸9 個(gè)，咖啡?；崴犷?lèi)、脂肪酸類(lèi)以及核苷類(lèi)等其他化合物26 個(gè)。

圖1 龍葵莖正 (A)、負(fù) (B) 離子模式下總離子流圖Fig.1 Base peak ion chromatogram of stems of S.nigrum in positive mode (A) and negative mode (B)

3.1.1 生物堿類(lèi) 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2]，龍葵中的生物堿主要為膽甾烷類(lèi)生物堿，代表性成分主要為澳洲茄胺、澳洲茄堿和次勒帕茄堿I（leptinine I）。在正離子模式下，化合物32 的保留時(shí)間為17.87 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z884.499 5 [M＋H]+，在二級(jí)質(zhì)譜中失去1 個(gè)Rha 得到m/z738.429 9 [M＋H－Rha]＋，進(jìn)一步失去2 個(gè)Hex 得到m/z414.336 8 [M＋H?Rha?2Hex]＋，再進(jìn)一步失去1 分子水和C8H15N，得到m/z271.204 8 [M＋H－Rha－2Hex－H2OC8H15N]+，最后失去1 分子H2O 得到m/z253.195 1[M＋H－Rha－2Hex－H2O－C8H15N－H2O]+，與文獻(xiàn)報(bào)道的二級(jí)碎片一致[17]，進(jìn)一步通過(guò)對(duì)照品對(duì)照，鑒定化合物32 為澳洲茄堿。澳洲茄堿的裂解途徑見(jiàn)圖2。

在正離子模式下，化合物40 的保留時(shí)間為18.51 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z868.505 3 [M＋H]＋，在二級(jí)質(zhì)譜失去1 分子H2O 得到m/z850.494 6 [M＋H－H2O]+，再失去1 個(gè)Rha 得到m/z704.441 9 [M＋H－H2O－Rha]＋，進(jìn)一步失去1 個(gè)Rha 和Hex 得到m/z396.326 2 [M＋H－H2O－Rha－Hex－Rha]+，再進(jìn)一步失去C8H15N，得到m/z271.204 8 [M＋HH2O－Rha－Hex－Rha－C8H15N]+，最后失去1 分子H2O 得到m/z253.195 1 [M＋H－H2O－Rha－Hex－Rha－C8H15N－H2O]+，與文獻(xiàn)中次勒帕茄堿I 數(shù)據(jù)一致[18]。采用類(lèi)似方法，從龍葵莖提取物中共鑒定膽甾烷類(lèi)生物堿5 個(gè)，除澳洲茄堿和次勒帕茄堿I，還包括γ-澳洲茄邊堿及其異構(gòu)體、β1-澳洲茄堿。

結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[19]分析膽甾烷類(lèi)生物堿二級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律：首先在ESI 源的轟擊下生成正離子，失去糖鏈生成母核離子澳洲茄胺或茄次堿，進(jìn)一步失去1 分子水與C8H15N，最后再失去1 分子水。因此，龍葵中膽甾烷類(lèi)生物堿特征離子有m/z414.33（C27H44NO2+）、396.32（C27H42NO+）、271.20（C19H27O+）、253.19（C19H25+），中性碎片有m/z162.05（Hex）、146.05（Rha）等。

表1 龍葵中鑒定化學(xué)成分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 1 MS results of constituents identified in S.nigrum

續(xù)表1

龍葵中膽甾烷類(lèi)生物堿母核主要為澳洲茄胺（C27H43NO2）、雙鍵被還原的澳洲茄胺（C27H45NO2），以及澳洲茄胺 C-27 位甲基被氧化成羧基（C27H41NO4）[20]，主要衍生化方式有鼠李糖基化、己糖基化（葡萄糖基化、半乳糖基化）、木糖基化等。根據(jù)龍葵中已經(jīng)報(bào)道的膽甾烷類(lèi)生物堿的結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，使用Cytoscape 對(duì)其分子式進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，建立膽甾烷類(lèi)生物堿分子網(wǎng)絡(luò)（圖3）。菱形代表文獻(xiàn)中已報(bào)道過(guò)的化合物[20-22]，橢圓形代表根據(jù)結(jié)構(gòu)特征預(yù)測(cè)的可能結(jié)構(gòu)。該分子網(wǎng)絡(luò)圖包括31 個(gè)膽甾烷類(lèi)生物堿分子式，其中文獻(xiàn)已報(bào)道的12 個(gè)，預(yù)測(cè)的19 個(gè)。將構(gòu)建的膽甾烷類(lèi)生物堿進(jìn)行母離子提取，并在二級(jí)質(zhì)譜圖中尋找二級(jí)離子碎片，根據(jù)上述分析確定的質(zhì)譜特征碎片，除了上述已經(jīng)鑒定的5 個(gè)生物堿，未篩查到其余生物堿的特征質(zhì)譜信號(hào)。在分子網(wǎng)絡(luò)圖中，藍(lán)色代表在本研究中鑒定到的化合物，粉色代表未鑒定到的化合物。

續(xù)表1

圖2 澳洲茄堿的裂解途徑Fig.2 Fragmentation pathways of solasonine

圖3 龍葵莖中生物堿 (A) 和甾體皂苷 (B) 的分子網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Structural network of alkaloids (A) and steroidal saponins (B) from stems of S.nigrum

3.1.2 甾體皂苷類(lèi) 龍葵中另一類(lèi)重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物為甾體皂苷類(lèi)[4]。在正離子模式下，化合物54 的保留時(shí)間為21.43 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z415.321 0 [M＋H]+，母離子脫去1 分子水得到m/z397.310 3 [M＋H－H2O]+，失去C8H16O2得到m/z271.205 6 [M＋H－H2O－C8H16O2]+，進(jìn)一步失去1 分子水得到m/z253.195 1 [M＋H－H2O－C8H16O2－H2O]+，與薯蕷皂苷元數(shù)據(jù)一致[16]。

化合物44：保留時(shí)間為18.69 min，在正離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰為m/z1 035.537 1 [M＋H]+，在二級(jí)質(zhì)譜中失去1 分子Hex 得到m/z873.447 4[M＋H－Hex]+，再失去1 分子X(jué)yl 得到m/z741.442 2[M＋H－Hex－Xyl]+，進(jìn)一步失去Hex 得到m/z579.390 0 [M＋H－Hex－Xyl－Hex]+，再失去1 分子Hex 得到m/z417.336 3 [M＋H－Hex－Xyl－Hex－Hex]+，最后失去C8H16O2得到m/z273.221 4 [M＋H－Hex－Xyl－Hex－Hex－C8H16O2]+，與文獻(xiàn)中去半乳糖替告皂苷數(shù)據(jù)一致[7]。它的裂解途徑見(jiàn)圖4。

圖4 去半乳糖替告皂苷的裂解途徑Fig.4 Fragmentation pathways of degalactotigon

圖5 龍葵中皂苷元的結(jié)構(gòu)Fig.5 Structures of saponin aglycone of S.nigrum

通過(guò)分析該類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及文獻(xiàn)報(bào)道[16]的二級(jí)質(zhì)譜碎片，龍葵中不同皂苷元類(lèi)型（圖5）的甾體皂苷類(lèi)化合物存在一定裂解規(guī)律：（1）首先失去糖基等中性片段，生成母核離子；（2）母核離子發(fā)生異構(gòu)化或者失去1 分子H2O；（3）異構(gòu)化的母核離子先失去C8H16O2中性碎片，并脫掉1 分子H2O；（4）母核離子脫掉1 分子H2O 后進(jìn)一步失去C8H16O2中性碎片。因此，該類(lèi)皂苷化合物共有的中性丟失碎片有 Hex（m/z162.05）、Rha（m/z146.05）、Xyl（m/z132.05）；不同母核的甾體皂苷類(lèi)化合物有不同的特征離子，薯蕷皂苷元（diosgenin，D）為母核的化合物的特征離子包括m/z397.32（C27H41O2+）、271.22（C19H27O+）、253.21（C19H25+）等；替告皂苷元（tigogenin，T）為母核的特征離子包括m/z417.33（C27H45O3+）、399.32（C27H43O2+）、273.22（C19H29O+）、255.21（C19H27+）；羥基化薯蕷皂苷元（hydroxydiosgenin，HD）[23]為母核的化合物的特征離子包括m/z415.33（C27H43O3+）、397.32（C27H41O2+）、271.22（C19H27O+）、253.21（C19H25+）等。

龍葵中皂苷類(lèi)化合物主要的苷元結(jié)構(gòu)如圖5所示，連接的糖基主要有己糖基（葡萄糖及半乳糖）、鼠李糖基以及木糖基。根據(jù)這3 種皂苷元的結(jié)構(gòu)，以及不同的糖鏈連接方式，使用Cytoscape 進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，建立皂苷結(jié)構(gòu)分子網(wǎng)絡(luò)（圖3-B）。橢圓形代表文獻(xiàn)中報(bào)道過(guò)的皂苷化合物分子式，六邊形代表根據(jù)結(jié)構(gòu)特征所預(yù)測(cè)的潛在皂苷類(lèi)分子式。該分子網(wǎng)絡(luò)包括32 個(gè)皂苷類(lèi)分子式，其中文獻(xiàn)已報(bào)道的皂苷分子式有9 個(gè)，預(yù)測(cè)的皂苷分子式23 個(gè)[17-19]。根據(jù)上述皂苷質(zhì)譜特征，對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖中的皂苷化合物進(jìn)行篩查。在正離子模式下共鑒定出17 個(gè)皂苷類(lèi)化合物，其中以薯蕷皂苷元為母核的有1 個(gè)化合物，包括D?Hex?Hex（C39H62O13）；替告皂苷元為母核的化合物有15 個(gè)，包括T?Hex（C33H54O8）及其異構(gòu)體，T?Hex?Hex（C39H64O13）及其異構(gòu)體，T?Hex?Hex?Hex（C45H74O18）、T?Hex?Hex?Rha（C45H74O17）、T?Hex?Hex?Xyl?Hex?Hex（C56H92O27）等；以及HD 苷元，即hydroxydiosgenin（C27H42O4）。圖3-B 中綠色代表在龍葵莖中鑒定的皂苷類(lèi)化合物，粉色代表未鑒定，即在龍葵莖中排除的皂苷類(lèi)化合物。

3.1.3 咖啡酰奎尼酸類(lèi) 綠原酸為常見(jiàn)的咖啡?？崴犷?lèi)化合物，其分子式為C16H18O9。在負(fù)離子模式下，化合物22 的準(zhǔn)分子離子峰為m/z353.087 8[M－H]?，保留時(shí)間為2.41 min，準(zhǔn)分子離子峰酯鍵斷裂失去C9H7O3，得到m/z191.056 0 [M－C9H7O3－H]?，進(jìn)一步失去1 分子H2O 得到m/z173.048 8 [MC9H7O3－H2O－H]?，另外還有脫掉奎尼酸產(chǎn)生的m/z179.035 4 [M－C7H11O5－H]?碎片峰，推測(cè)化合物22 為綠原酸[12]?；衔?5 在正離子模式下產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰m/z355.102 3 [M＋H]+，保留時(shí)間為1.50 min，二級(jí)質(zhì)譜離子包括：準(zhǔn)分子離子峰失去C9H7O3，得到m/z192.039 4 [M－C9H7O3＋H]+，進(jìn)一步失去H2O 得到m/z177.016 2 [M－C9H7O3－H2O＋H]?，推測(cè)化合物15 可能是綠原酸的單咖啡?？崴岙悩?gòu)體[24]。

3.1.4 氨基酸類(lèi) 龍葵莖中還鑒定到氨基酸類(lèi)化合物。如化合物1 在正離子模式下產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰m/z175.119 8 [M＋H]+，二級(jí)碎片有m/z116.170 9[M－CH4N3＋H]+、m/z71.069 0 [M－COOHCH4N3＋H]+、m/z70.065 8 [M－CO2－H2OCH4N3＋H]+、m/z60.056 3 [M－NH3－COOHC4H5＋H]+，通過(guò)文獻(xiàn)對(duì)照[24]確定為精氨酸。龍葵莖中鑒定的其他氨基酸還包括纈氨酸、焦谷氨酸、色氨酸、組氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等。

3.1.5 脂肪酸類(lèi) 龍葵中鑒定到2 種脂肪酸，分別為亞麻酸和棕櫚酸?；衔?1 在正離子模式下，保留時(shí)間為28.09 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z257.247 2[M＋H]+，二級(jí)碎片含有m/z239.178 9 [M－H2O＋H]+、m/z199.148 2 [M－C4H9＋H]+、m/z155.085 3[M－COOH－C4H8＋H]+、m/z117.070 5 [M－COOHC10H9＋H]+，鑒定為棕櫚酸[11]。

3.1.6 核苷類(lèi) 文獻(xiàn)報(bào)道龍葵中含有少量的核苷類(lèi)化合物[5]，本研究在正離子模式下共鑒定出5 個(gè)核苷類(lèi)化合物，主要包括腺苷、尿苷、腺嘌呤和次黃嘌呤等。以化合物56 為例，在正離子模式下，保留時(shí)間為22.39 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z268.104 2[M＋H]+，失去1 分子C5H8O4得到m/z136.062 5[M＋H－C5H8O4]+，然后失去1 分子NH3得到m/z119.049 4 [M＋H－C5H8O4－NH3]+，參照文獻(xiàn)報(bào)道[11]鑒定其為腺苷。

3.1.7 Compound Discover 3.0 鑒定 將樣品和空白溶劑的譜圖導(dǎo)入Compound Discover 3.0 軟件，設(shè)置預(yù)測(cè)化合物的分子組成為C、H、O、N，將化合物碎片匹配值設(shè)置在50%以上，通過(guò)CD 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行自動(dòng)結(jié)構(gòu)指認(rèn)，導(dǎo)出345 個(gè)可能的化合物，手動(dòng)去除非天然產(chǎn)物、未提取到準(zhǔn)分子離子峰的化合物、匹配度低于70%的化合物且沒(méi)有二級(jí)質(zhì)譜圖的化合物，經(jīng)過(guò)二級(jí)質(zhì)譜碎片信息核對(duì)，共指認(rèn)14 個(gè)化合物，其中包括上述鑒定的化合物12 個(gè)，新鑒定化合物2 個(gè)，包括吲哚-3-丙烯酸和6-羥基木犀草素-7-槐糖苷。

3.2 1H-NMR 結(jié)果與分析

通過(guò)與文獻(xiàn)報(bào)道、BMRB 數(shù)據(jù)庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)圖譜對(duì)照，并對(duì)1H-NMR 圖進(jìn)行分析（圖6），共指認(rèn)出27 個(gè)化合物（表2）。1H-NMR 圖譜可以分為3個(gè)區(qū)域：高場(chǎng)區(qū)（δ0.00～3.56）主要包括有機(jī)酸、氨基酸，如乳酸δ1.35 (d,J=6.0 Hz)、丙氨酸δ1.48(d,J=7.2 Hz)，異亮氨酸δ1.02 (d,J=6.6 Hz)、δ0.94(t,J=7.2 Hz)，亮氨酸δ0.96 (d,J=6.0 Hz)、δ0.98(d,J=6.0 Hz) 等；碳水化合物區(qū) (δ3.56～5.50) 主要為糖基，包括α-葡萄糖基δ5.21 (d,J=3.6 Hz)、β-葡萄糖基δ4.59 (d,J=7.8 Hz)、蔗糖基δ5.41 (d,J=4.2 Hz)；低場(chǎng)區(qū) (δ5.50～9.16) 指認(rèn)的化合物主要含氮或芳香類(lèi)化合物，如葫蘆巴堿δ9.16 (s),8.10 (t,J=6.6 Hz),8.87 (t,J=8.4 Hz)，尿嘧啶δ5.75 (d,J=7.8 Hz),7.52 (d,J=7.8 Hz)，尿苷δ5.85 (d,J=4.2 Hz),5.91 (d,J=4.8 Hz),7.93 (d,J=8.4 Hz) 等。通過(guò)核磁共振鑒定的27 個(gè)化合物中，有6 個(gè)化合物（精氨酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、尿苷和腺苷）已在質(zhì)譜中鑒定，另外21 個(gè)化合物僅在核磁分析中鑒定。

4 討論

本研究采用高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)龍葵莖進(jìn)行了化學(xué)成分分析。從龍葵莖中共鑒定到化合物89 個(gè)，包括甾體生物堿5 個(gè)、甾體皂苷28 個(gè)、游離氨基酸16 個(gè)、咖啡酰基奎尼酸類(lèi)、脂肪酸類(lèi)以及核苷類(lèi)等其他化合物40 個(gè)。其中，有54 個(gè)化合物在龍葵中首次報(bào)道。

甾體生物堿和甾體皂苷是龍葵的特征成分，通過(guò)分析已報(bào)道的甾體生物堿和甾體皂苷結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，本研究分別構(gòu)建了這兩類(lèi)成分的分子網(wǎng)絡(luò)，并預(yù)測(cè)了龍葵莖中可能存在的甾體生物堿和甾體皂苷。通過(guò)對(duì)預(yù)測(cè)化合物的質(zhì)譜篩查和碎片特征分析，雖然未檢測(cè)到新的生物堿，但篩查到新的甾體皂苷分子式6 個(gè)，由于皂苷糖鏈可有多種連接方式，這些皂苷分子式對(duì)應(yīng)潛在的皂苷類(lèi)化合物16 個(gè)。這些皂苷類(lèi)可能都是未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的新化合物，但需要進(jìn)一步通過(guò)植物化學(xué)分離鑒定手段進(jìn)行驗(yàn)證。

圖6 龍葵莖提取物的1H-NMR 圖譜Fig.6 1H-NMR spectra of extracts from stems of S.nigrum

表2 龍葵中鑒定化合物1H-NMR 數(shù)據(jù)歸屬Table 2 1H-NMR assignments of identified compounds from stems of S.nigrum

此外，本研究使用的核磁共振分析是一種非選擇性檢測(cè)技術(shù)，不受液質(zhì)分析中化合物是否容易離子化和在色譜柱上保留強(qiáng)弱的影響。因此，在中藥復(fù)雜體系鑒定中，核磁共振與液質(zhì)聯(lián)用分析具有互補(bǔ)性。本研究通過(guò)核磁圖譜分析，進(jìn)一步鑒定了龍葵莖中27 個(gè)化合物，不僅驗(yàn)證了已經(jīng)在質(zhì)譜中鑒定的6 個(gè)化合物，而且還鑒定21 個(gè)未在質(zhì)譜中鑒定的化合物。核磁共振與液質(zhì)聯(lián)用的整合分析，進(jìn)一步豐富了我們對(duì)龍葵莖的化學(xué)認(rèn)識(shí)。甾體生物堿是龍葵的特征成分，然而本研究?jī)H在莖中檢測(cè)到生物堿5 個(gè)，說(shuō)明莖中生物堿的多樣性明顯低于龍葵果。鑒于龍葵莖在龍葵藥材中占有較大的比重，今后的研究還應(yīng)對(duì)龍葵莖的生物活性進(jìn)一步分析。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突