薛惠琴,盧永紅,潘美娟,杭怡瓊,蔡 旋,3

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海201106;2 上海琮益科技有限公司,上海201715;3上海申豐畜牧獸醫(yī)科技有限公司,上海201106)

貓須草(Orthosiphon stamineus)又稱作“腎茶”,是一種生長(zhǎng)在熱帶和亞熱帶地區(qū)的多年生草本植物,有一定的藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值,在東南亞地區(qū)被廣泛種植,我國(guó)廣西和云南也有人工種植[1-2]。貓須草傳統(tǒng)用途主要為利尿去濕、降血壓等[3-4]。近年研究表明,貓須草來(lái)源廣泛,成本可控[2],具有良好的抗蛋雞熱應(yīng)激作用[5],是潛在的飼料添加劑來(lái)源[2]。貓須草提取物的抗應(yīng)激作用與其抗氧化能力和腸道保護(hù)作用相關(guān)[6-7],其中以迷迭香酸為代表的酚酸和黃酮類物質(zhì)是其主要有效成分[7-8]。

在中醫(yī)藥領(lǐng)域,產(chǎn)地、氣候條件、加工方式等是藥材品質(zhì)的重要影響因素,影響著藥物的療效[9-10];在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域,早在我國(guó)古代就有“橘生淮南則為橘,生于淮北則為枳”的說(shuō)法?？梢?jiàn),地理和氣候因素對(duì)植物的次生代謝產(chǎn)物影響顯著。

目前,尚未見(jiàn)關(guān)于我國(guó)貓須草主要成分及其活性在不同采摘時(shí)間和產(chǎn)地比較的文獻(xiàn)報(bào)道。本課題組在對(duì)貓須草產(chǎn)業(yè)狀況[2]、副產(chǎn)物提取方式[11]、不同部位的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和抗氧化活力[6,12]以及保存條件[13]進(jìn)行充分研究后,擬進(jìn)一步研究貓須草的采摘時(shí)間和產(chǎn)地對(duì)其主要成分及活性的影響。因此,本試驗(yàn)對(duì)我國(guó)貓須草主產(chǎn)區(qū)廣西玉林及云南西雙版納不同季節(jié)采摘的6個(gè)貓須草樣品的主要有效成分含量及抗氧化能力進(jìn)行分析比較,以期為貓須草作為飼料添加劑研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

廣西地區(qū)貓須草分別于2016年5月(夏)、11月(秋)和2017年5月(夏)、 11月(秋)在玉林市福綿區(qū)成均鎮(zhèn)現(xiàn)場(chǎng)采摘;云南地區(qū)貓須草分別于2017年5月(夏)和11月(秋)委托當(dāng)?shù)胤N植戶在西雙版納傣族自治州采摘。玉林市位于110°14′E,22°64′N,屬南亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū),丘陵地貌;西雙版納地區(qū)位于100°80′E,22°02′N,為北熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣侯,屬浸蝕山地。所有樣品至少采摘3 份,采摘的整株貓須草于通風(fēng)處陰干48 h 后,輕拍除去泥土,收集葉片,采用多功能中藥粉碎機(jī)粉碎,通過(guò)孔徑為0.425 mm 的篩網(wǎng),粉末于干燥器中保存。貓須草樣品信息見(jiàn)表1。

表1 貓須草樣品信息Table 1 Sample information of Orthosiphon stamineus

1.2 提取物的制備

貓須草葉提取物的制備參考之前的研究[6,11],略有改動(dòng),具體如下:10 g 貓須草樣品浸入350 mL 50%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙醇中,50 ℃、300 W 超聲波輔助提取15 min,濾液兩次通過(guò)中速定性濾紙;合并濾渣并加入新的350 mL 50%乙醇,再次50 ℃、300 W 超聲波輔助提取15 min,濾液兩次通過(guò)中速定性濾紙;合并兩次濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至體積小于30 mL,采用冷凍干燥機(jī)凍干處理。每個(gè)樣品至少重復(fù)提取3 次,凍干品于-20 ℃保存待測(cè)。

1.3 基本營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

貓須草葉粉末采用小托盤65 ℃風(fēng)干至恒重,室內(nèi)回潮24 h,作為風(fēng)干樣。風(fēng)干樣的干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分含量分別依照國(guó)標(biāo)GB∕T 6435—2014、GB∕T 6432—2018、GB∕T 6433—2006、GB∕T 6434—2006 及GB∕T 6438—2007 測(cè)定。貓須草葉中無(wú)氮浸出物含量=100 -(水分含量+粗灰分含量+粗蛋白質(zhì)含量+粗脂肪含量+粗脂肪含量),各物質(zhì)含量均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)。

1.4 多糖、蛋白、總多酚含量和總黃酮含量的測(cè)定

貓須草葉提取物多糖含量采用苯酚硫酸法測(cè)定[14];蛋白含量采用Bradford 法測(cè)定;總多酚含量采用福林酚法測(cè)定,以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品;總黃酮含量的測(cè)定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法,以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.5 迷迭香酸含量的測(cè)定

貓須草葉提取物的迷迭香酸含量采用Agilent 1260 HPLC 高效液相色譜法測(cè)定,標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司,用甲醇溶解。色譜條件:色譜柱Waters Symmetry? C18(4.6 mm ×250 mm,5 μm),柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm。流動(dòng)相比例和流速:A 相為0.2%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液,B 相為乙腈,C 相為甲醇,梯度見(jiàn)表2。

表2 流動(dòng)相梯度Table 2 Gradient of mobile phase

1.6 抗氧化能力的測(cè)定

貓須草葉提取物抗氧化能力通過(guò)測(cè)定其鐵離子還原能力、超氧陰離子自由基清除能力以及氮自由基清除能力評(píng)估。鐵離子還原能力表示為吸光值,以維生素C 為陽(yáng)性參照物;超氧陰離子自由基清除能力表示為自由基清除率,以蘆丁為陽(yáng)性參照物;氮自由基清除能力表示為DPPH 自由基清除率,以維生素C為陽(yáng)性參照物。以上指標(biāo)均采用上海琮益科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。

1.7 數(shù)據(jù)分析

除非特別說(shuō)明,數(shù)據(jù)均采用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析,P＜0.05為差異顯著。采用Origin 8.0 軟件進(jìn)行曲線擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采摘季節(jié)及產(chǎn)地貓須草葉的基本營(yíng)養(yǎng)成分

如表3 所示,不同采摘季節(jié)及產(chǎn)地貓須草葉的基本營(yíng)養(yǎng)成分存在顯著差異。玉林地區(qū)采摘的1、2、3號(hào)樣品的干物質(zhì)、粗蛋白、粗灰分含量相對(duì)接近;4 號(hào)樣品的粗蛋白、粗灰分、粗脂肪含量(除6 號(hào)樣)顯著低于其他樣品,粗纖維及無(wú)氮浸出物含量較高。夏季(2、4、5 號(hào)樣品)和秋季(1、3、6 號(hào)樣品)采摘的樣品間基本營(yíng)養(yǎng)成分存在差異,但無(wú)明顯規(guī)律。

表3 不同采摘季節(jié)及產(chǎn)地貓須草葉的基本營(yíng)養(yǎng)成分(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 3 The basic nutrient components(air dried basis) of Orthosiphon stamineus leaves picked in different seasons and producing areas %

2.2 不同采摘季節(jié)及產(chǎn)地貓須草葉提取物中多糖、蛋白、總多酚含量及總黃酮含量

如表4 所示,多糖是貓須草葉提取物中主要成分之一,不同采摘季節(jié)和地區(qū)間各樣品多糖含量差異不明顯;蛋白含量在提取物中均不足0.015%,可以忽略。多酚和黃酮是植物次生代謝產(chǎn)物中的主要抗氧化物質(zhì),貓須草葉提取物中總多酚和總黃酮含量較高,不同產(chǎn)地樣品總多酚及總黃酮含量存在顯著差異。總體而言,同一產(chǎn)地夏季采摘的貓須草葉提取物中總多酚和總黃酮含量均顯著高于秋季采摘樣品,但不同產(chǎn)地同一季節(jié)采摘的貓須草葉提取物中的總多酚和總黃酮含量差異無(wú)明顯規(guī)律。

表4 不同采摘季節(jié)及產(chǎn)地貓須草葉提取物的多糖、蛋白、總多酚含量及總黃酮含量Table 4 The content of polysaccharide,protein,total polyphenols and total flavones(air dry basis) in the extracts of Orthosiphon stamineus leaves picked in different seasons and producing areas

2.3 不同采摘季節(jié)及產(chǎn)地貓須草葉提取物中迷迭香酸的含量

迷迭香酸是貓須草葉提取物的主要有效成分。如圖1 所示,不同季節(jié)及產(chǎn)地采摘的貓須草葉提取物中迷迭香酸含量存在一定差異,其中4 號(hào)樣品(玉林地區(qū)2017年夏季采摘)迷迭香酸含量最高,6 號(hào)樣品(西雙版納地區(qū)2017年秋季采摘)迷迭香酸含量最低。

圖1 不同采摘季節(jié)及產(chǎn)地貓須草葉提取物中迷迭香酸的含量Fig.1 The rosmarinic acid content in the extracts of Orthosiphon stamineus leaves picked in different seasons and producing areas

2.4 不同采摘季節(jié)及產(chǎn)地貓須草葉提取物的抗氧化能力

如圖2 所示,不同采摘季節(jié)及產(chǎn)地貓須草葉提取物對(duì)氮自由基(DPPH 自由基)、氧自由基(超氧陰離子自由基)均有較好的清除效果,也具有較強(qiáng)的鐵離子還原能力,但不同采摘季節(jié)及產(chǎn)地貓須草葉提取物的自由基清除能力和鐵離子還原能力有較大差異。為方便比較,采用origin 軟件四參數(shù)logistic 模型對(duì)圖2a、b 進(jìn)行非線性擬合,圖2c 采用線性擬合,擬合曲線相關(guān)系數(shù)均高于0.99,并依據(jù)曲線計(jì)算貓須草葉提取物的DPPH 自由基和超氧陰離子自由基清除半數(shù)有效劑量(EC50)以及鐵離子還原能力的斜率。EC50越小表示自由基清除能力越強(qiáng),斜率越大表明還原能力越強(qiáng)。如圖2 和表5 所示,2 號(hào)和4 號(hào)樣品(玉林地區(qū)夏季采摘)的DPPH 自由基清除能力高于秋季采摘樣品(1 號(hào)和3 號(hào)),超氧陰離子自由基清除能力及還原力也處于較高水平。云南西雙版納地區(qū)采摘的樣品也表現(xiàn)同樣規(guī)律,但不同地區(qū)間無(wú)規(guī)律可循。

圖2 不同采摘季節(jié)及產(chǎn)地貓須草葉提取物的抗氧化能力Fig.2 Antioxidant capacity of extracts from Orthosiphon stamineus leaves picked in different seasons and producing areas

表5 貓須草葉提取物清除自由基的半數(shù)抑制率及還原能力斜率Table 5 Half inhibition rate and reduction ability slope of extracts from Orthosiphon stamineus leaves for scavenging free radicals

2.5 貓須草主要成分與其抗氧化能力的相關(guān)分析

由表6 可知,樣品提取物中迷迭香酸與總多酚含量呈極顯著正相關(guān),提取物的DPPH 自由基清除能力(自由基清除能力以EC50代入計(jì)算,EC50與清除能力負(fù)相關(guān),因此顯示為負(fù)值)和還原能力均與迷迭香酸、總多酚含量呈顯著正相關(guān),但超氧陰離子自由基清除能力與各主要成分之間的關(guān)系均不顯著。

表6 貓須草葉提取物含量與其抗氧化能力間的相關(guān)關(guān)系Table 6 Correlation between the extracts content from Orthosiphon stamineus leaves and its antioxidant capacity

3 討論

貓須草在我國(guó)海南[15]、云南、四川[16]、福建、廣西、廣東[17]等省均有分布,但海南、四川、福建、廣東均未見(jiàn)大規(guī)模種植報(bào)道。前期產(chǎn)業(yè)調(diào)研顯示,我國(guó)產(chǎn)業(yè)化貓須草產(chǎn)地主要集中在廣西玉林地區(qū)和云南西雙版納地區(qū)[2]。貓須草有白花和紫花兩類[2],廣西玉林地區(qū)和云南西雙版納地區(qū)量產(chǎn)貓須草均為白花,因此本研究選取廣西玉林地區(qū)和云南西雙版納地區(qū)白花貓須草為研究對(duì)象。

1999年,高增平等[18]對(duì)四川涼山、四川米易和云南紅河產(chǎn)貓須草進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)四川產(chǎn)貓須草含生物堿,而云南產(chǎn)貓須草不含生物堿,且其熊果酸含量差異巨大;2004年,Akowuah 等[19]對(duì)馬來(lái)西亞產(chǎn)12 份貓須草葉甲醇提取物的多酚含量及自由基清除能力進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)雖然不同地區(qū)的貓須草多酚含量及自由基清除能力有一定差異,但其酚類組成較為一致;2014年,辛雪等[20]研究了云南、福建、海南、廣西、廣東等地貓須草19個(gè)樣品酚類物質(zhì)的含量,發(fā)現(xiàn)不同品種和產(chǎn)地間貓須草酚酸含量差別較大,且不同品種間有較明顯規(guī)律,而產(chǎn)地間的規(guī)律性不明顯;2019年,尹文鳳等[21]對(duì)云南地區(qū)貓須草的成分進(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究,確定了貓須草的質(zhì)量控制成分。之前的研究均表明地理位置對(duì)貓須草酚酸含量有一定影響,但不同地區(qū)間的差別不明確,本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)論,并發(fā)現(xiàn)不同采摘季節(jié)對(duì)貓須草葉提取物中總多酚、總黃酮含量和迷迭香酸含量及抗氧化能力有顯著影響,夏季采摘的貓須草抗氧化物質(zhì)含量顯著高于秋季采摘。貓須草一般一年采摘兩次,夏季采摘時(shí)間在5月底至6月,秋季采摘時(shí)間在10月底至11月,夏季采摘的貓須草生長(zhǎng)期(約6個(gè)半月)較秋季采摘的貓須草(約5個(gè)半月)更長(zhǎng),但貓須草抗氧化物質(zhì)含量是否與生長(zhǎng)時(shí)間相關(guān)還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

目前,有關(guān)多糖、多酚、黃酮、蛋白類物質(zhì)的抗氧化能力均有大量報(bào)道,已有不少研究證實(shí)貓須草提取物具有良好的抗氧化效果[6-7,11,19],但少有研究論證貓須草中主要成分與抗氧化能力的相關(guān)性。本研究表明,貓須草葉提取物中影響其抗氧化能力的主要物質(zhì)是多酚類化合物,其中迷迭香酸含量與抗氧化能力顯著相關(guān);但不同抗氧化成分間存在協(xié)同或者拮抗作用,不能簡(jiǎn)單地認(rèn)為抗氧化作用是其中幾種成分的加和[22]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)表明,不同采摘季節(jié)及產(chǎn)地對(duì)貓須草主要成分和抗氧化能力均有影響;其中多酚類物質(zhì)是其主要的抗氧化有效成分,迷迭香酸是貓須草葉提取物中含量最高的一類酚類物質(zhì),其含量與抗氧化能力呈顯著正相關(guān)。一般而言,同一地區(qū)夏季采摘的貓須草葉提取物中多酚含量及抗氧化能力高于秋季采摘的,而地域差異規(guī)律不明顯。本研究提示在運(yùn)用貓須草時(shí)應(yīng)注意不同采摘時(shí)間對(duì)其總多酚含量的影響。