国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

利用基因編輯技術(shù)進(jìn)行豬異種器官移植及人類疾病模型研究的進(jìn)展

2021-11-28 07:11:00陸新章婁顏坤馬育芳李大力
關(guān)鍵詞:異種轉(zhuǎn)基因基因組

陸新章,張 梅,婁顏坤,馬育芳,李大力

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,上海201403;2 上海市調(diào)控生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生命醫(yī)學(xué)研究所,上海200241)

豬作為一種重要的模式動(dòng)物,具有其他模式動(dòng)物無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。相對(duì)于應(yīng)用最為廣泛的鼠類,豬在器官大小、解剖、生理、新陳代謝、神經(jīng)生物學(xué)和基因組等方面和人類具有很高的相似性,從而能夠更加精確地模擬許多人類疾病的表型[1];豬疾病模型的合適尺寸以及長壽命還有助于在臨床條件下進(jìn)行手術(shù)操作,并且在臨床相關(guān)時(shí)間范圍內(nèi)對(duì)治療藥物進(jìn)行長期跟蹤和評(píng)估。而與人類相似度更高的靈長類動(dòng)物相比,豬產(chǎn)仔量多、后代生長快,因此僅需要較低的維持成本,也不容易引發(fā)倫理問題?;诖?豬在構(gòu)建人類疾病模型、生產(chǎn)人類藥用蛋白和器官移植等方面有著巨大的應(yīng)用空間。

出于這些研究目的,科學(xué)家們采用基因打靶等技術(shù)對(duì)豬進(jìn)行特異的遺傳改造。然而,由于缺乏胚胎干細(xì)胞,科學(xué)家們需要在體細(xì)胞中通過同源重組引入靶向修飾,再通過體細(xì)胞核移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬。大動(dòng)物體細(xì)胞中同源重組的效率極低,因此傳統(tǒng)的基因打靶往往只能引入雜合突變,具有純合突變的動(dòng)物需要通過后續(xù)的連續(xù)打靶或者幾輪育種步驟獲得。這些操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力且造價(jià)昂貴,在很大程度上限制了該領(lǐng)域的發(fā)展。

直到人工內(nèi)切核酸酶的出現(xiàn),它不僅顯著提高了打靶效率,還能夠通過在受精卵或者體細(xì)胞中直接注射工程化內(nèi)切核酸酶,在胚胎發(fā)生過程中同時(shí)突變多個(gè)基因[2]。這使得以往制備基因敲除動(dòng)物低效、技術(shù)難度大等缺點(diǎn)得到了徹底的改變,同時(shí)標(biāo)志著基因定點(diǎn)敲除進(jìn)入了基因組編輯的時(shí)代。

1 基因組編輯

基因組編輯是指通過人工核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)。其原理是通過人工核酸內(nèi)切酶在靶位點(diǎn)切斷DNA,產(chǎn)生DNA 雙鏈斷裂(Double-strand break,DSB),進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的DNA 修復(fù)系統(tǒng)進(jìn)行非同源末端連接(Nonhomologous end joining,NHEJ)和同源重組修復(fù)(Homologous recombination,HR),進(jìn)而實(shí)現(xiàn)在基因特定位點(diǎn)的基因敲除(通過NHEJ)或者敲入(通過HR)[3]。

最早出現(xiàn)的人工核酸內(nèi)切酶包括鋅指核酸酶(Zinc-Finger Nucleases,ZFNs)[4]和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALENs)[5]。ZFNs 和TALENs 具有類似的結(jié)構(gòu),都是由以模塊形式構(gòu)建的序列特異的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ZFNs 為鋅指蛋白,TALENs 為TALE 蛋白)與DNA核酸內(nèi)切酶FokI 組成。在具體操作中,通過設(shè)計(jì)不同的蛋白模塊對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行識(shí)別,并引導(dǎo)FokI 核酸內(nèi)切酶在該區(qū)域切斷DNA,形成雙鏈切口。高效的打靶效率促進(jìn)了ZFNs 和TALENs 技術(shù)的廣泛應(yīng)用。采用這兩種技術(shù),科學(xué)家們已經(jīng)在多個(gè)物種中實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因組的精細(xì)修飾[6]。

2012年,一種基于細(xì)菌和古細(xì)菌靶向切割外源DNA 的防御機(jī)制改造而來的全新的人工核酸內(nèi)切酶——成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)∕CRISPR 相關(guān)蛋白9(Clustered regularly inter-spaced short palindromic repeats∕Cas9,CRISPR∕Cas9)系統(tǒng)出現(xiàn)[7]。該系統(tǒng)使用Cas9 核酸酶和短引導(dǎo)RNA(gRNA)的組合來靶向特定的DNA 序列以進(jìn)行切割。位于PAM 序列(NGG)5’端的與目標(biāo)DNA 互補(bǔ)的20個(gè)核苷酸的gRNA,將Cas9 引導(dǎo)至靶DNA 并介導(dǎo)雙鏈DNA 的切割以形成DSB[8]。介于此,CRISPR∕Cas9 可以在任何N20-NGG位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)基因打靶。通過對(duì)該系統(tǒng)的不斷優(yōu)化,CRISPR∕Cas9 已經(jīng)適用于精確DNA∕RNA 打靶,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和胚胎中顯示出很高的效率。與ZFNs 和TALENs 相比,CRISPR∕Cas9 系統(tǒng)更易于構(gòu)建,所需時(shí)間和成本也大幅降低。這些特性都賦予了CRISPR∕Cas9 系統(tǒng)更高的靈活性和適用性,從而顯著推動(dòng)了生物醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)等許多領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

2 基因修飾豬克服豬器官移植問題的研究進(jìn)展

大量可移植器官的替代研究是目前醫(yī)學(xué)上亟待解決的難題。創(chuàng)造具有靶向遺傳修飾豬的推動(dòng)之一來自于解決移植到人類的器官極其短缺的需要。目前普遍認(rèn)為,豬的器官和人的器官在大小和功能上均有非常相似的地方,并且可以大量獲取,所以豬的器官被認(rèn)為是異種器官移植最好的來源。然而,由于先天免疫和獲得性免疫的激活、炎癥反應(yīng)、凝血系統(tǒng)紊亂,以及豬器官本身攜帶病毒的危害性等問題,使得豬器官移植到人體的臨床應(yīng)用舉步維艱。為了緩解器官供應(yīng)不足的現(xiàn)狀,解決豬器官移植風(fēng)險(xiǎn)的難題,近些年來研究人員應(yīng)用基因編輯技術(shù)做出了巨大的努力,使得豬器官移植邁上了新的臺(tái)階。盡管這些豬在臨床前非人、靈長類動(dòng)物模型中作為供體的研究還非常有限,在細(xì)胞水平的體外分析結(jié)果已為克服異種器官移植中的障礙帶來了無限希望。

2.1 對(duì)豬進(jìn)行基因編輯以降低異種移植免疫排斥

供體和受體之間的高免疫不相容性是異種移植的主要障礙。異種移植的免疫障礙主要包括超急性排斥、延遲異種移植排斥、急性細(xì)胞排斥和慢性排斥等[9]。宿主通常通過超急性免疫排斥在數(shù)分鐘或數(shù)小時(shí)內(nèi)破壞異種移植物,導(dǎo)致移植失敗。研究人員發(fā)現(xiàn)豬器官的血管內(nèi)皮細(xì)胞存在大量的半乳糖α1,3-半乳糖(Galα1,3-Gal)抗原,會(huì)被人免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗半乳糖α1,3 半乳糖抗體所識(shí)別而產(chǎn)生免疫排斥。Galα1,3-Gal 的合成由α1,3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶(GGTA1)催化,該酶存在于豬中但在人體中不存在。雖然有研究人員通過靜脈注射適量的寡聚糖來減少抗體的含量,但是這樣的方法卻是收效甚微?;蚓庉嫾夹g(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展使得從根本上解決免疫排斥的問題向前跨了一大步。

早在2002年,Dai[10]和Lai 等[11]使用同源重組獲得了具有雜合敲除GGTA1 的豬,并通過進(jìn)一步篩選來自雜合豬的純合敲除細(xì)胞來生產(chǎn)純合GGTA1 敲除(GTKO)仔豬[12-13]。將GTKO 豬的心臟移植到免疫抑制的狒狒體中,異種移植物存活期最長達(dá)179 d[14]。GTKO 豬的產(chǎn)生表明超急性異種移植物排斥已在很大程度上得到克服。通過使用基因組編輯工具,研究者們又先后建立了一系列具有不同遺傳背景的GTKO 豬。此外,科學(xué)家還鑒定出其他能夠引起超急性免疫排斥的異種反應(yīng)性抗原,包括由胞苷一磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶(CMAH)催化的Neu5Gc 抗原(N-羥乙酰神經(jīng)氨酸)和由β1,4-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶(B4GALNT2) 產(chǎn)生的聚糖[15-16],相應(yīng)的具有雙重(GGTA1∕ CMAH) 和三重(GGTA1∕ CMAH∕B4GALNT2)基因失活的轉(zhuǎn)基因豬也已成功獲得,通過移植實(shí)驗(yàn)顯示相較于GTKO 豬其免疫排斥表現(xiàn)出進(jìn)一步的降低[17-18]。

除此之外,研究者們還對(duì)豬進(jìn)行了許多其他單轉(zhuǎn)基因或組合轉(zhuǎn)基因遺傳修飾,包括CD46、CD55、CD59、CD39、Thrombomodulin、Hemeoxygenase 1、A20、HLA-E 以及CD47 等,以達(dá)到抑制補(bǔ)體活性、延遲異種移植排斥或∕和急性細(xì)胞排斥的目的[19]。在多組不同轉(zhuǎn)基因背景的“器官豬”移植(受體為非人類靈長類動(dòng)物)研究中,異種移植物存活時(shí)間最長被延至945 d[20]。在這個(gè)過程中,雖然對(duì)豬的轉(zhuǎn)基因改造起到了去除免疫抗原的作用,通過免疫抑制藥物的使用來降低受體對(duì)移植物的排斥同樣不可或缺。在沒有持續(xù)免疫抑制的情況下,長期的異種移植物存活仍然難以實(shí)現(xiàn)。為了解決這個(gè)問題,Nottle 等[21]嘗試采用具有更高保真度的FokI-dCas9 將編碼抗CD2 單克隆抗體(mAb)的7.1 kb 轉(zhuǎn)基因整合到GGTA1 位點(diǎn)中,通過在引入免疫調(diào)節(jié)分子的同時(shí)消除與超急性排斥相關(guān)的基因,生產(chǎn)出第一例用于異種移植的基因敲入豬。經(jīng)檢測,這些豬均發(fā)生了預(yù)期的aGal 的缺失,同時(shí)在血清中表達(dá)對(duì)人和非人靈長類CD2 特異但不結(jié)合豬T 細(xì)胞的mAb。雖然作者尚未證實(shí)CD2 mAb 的敲入是否能夠?yàn)樨i異種移植物提供局部免疫保護(hù),但這無疑為生產(chǎn)具有更高免疫抑制性的異種器官移植供體提供了一條新思路。Reyes 等[22]則獲得了I 類MHC 基因敲除豬,可作為研究異種移植物排斥的重要材料。I 類MHC,又稱為豬白細(xì)胞抗原(Swine Leukocyte Antigens,SLA),對(duì)免疫系統(tǒng)在健康和疾病中的作用至關(guān)重要,尤其在感染和移植排斥方面。通過CRISPR∕Cas9 技術(shù)生產(chǎn)的克隆豬表現(xiàn)出細(xì)胞表面I 類MHC 蛋白的完全喪失,同時(shí)外周血中CD4-CD8+T 細(xì)胞水平有所降低。

2.2 敲除豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒

在豬器官移植研究上另一個(gè)受關(guān)注的問題,就是豬器官所攜帶的病毒和微生物對(duì)移植宿主存在潛在的危害性。比如巨細(xì)胞病毒、EB 病毒,甚至有時(shí)候豬器官也可能攜帶HIV、西尼羅病毒或是狂犬病毒,移植到宿主后會(huì)使得宿主感染并傳播相應(yīng)的病毒。當(dāng)然,這一些病毒都可以通過改善豬的飼養(yǎng)條件,定期做相應(yīng)安全監(jiān)測等措施來緩解,避免或是完全消除移植的豬器官攜帶相應(yīng)的病毒。然而,和人體內(nèi)存在一些非致病性內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒一樣,豬體內(nèi)同樣存在一些豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERVs)。這是一種無活性的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒,是豬基因組的組成部分,對(duì)豬本身并無危害,卻可能會(huì)被某些因素或環(huán)境變化重新激活,具有在受體中變得具有致病性和感染性的可能。由于PERV 整合在基因組多個(gè)位置,無論是采用RNA 干涉、ZFN 或者TALEN 技術(shù),同時(shí)完全消除豬基因組中的所有PERV 都難度巨大。隨著CRISPR∕Cas9 技術(shù)的出現(xiàn),科學(xué)家通過設(shè)計(jì)靶向sgRNA 在永生豬細(xì)胞系PK15 中同時(shí)敲除了所有62個(gè)拷貝的PERV 基因,同時(shí)證明了PERV 向人細(xì)胞傳遞的減少超過1000 倍[23]。在后續(xù)的研究中,該團(tuán)隊(duì)采用體細(xì)胞核移植技術(shù)構(gòu)建出PERV 滅活轉(zhuǎn)基因豬,成功破解了PERV 跨物種傳播給異種器官移植所帶來的安全問題[24]。此外,CRIPSR 工具同時(shí)靶向數(shù)十個(gè)基因組位點(diǎn)的強(qiáng)大能力為創(chuàng)造具有復(fù)雜修飾的動(dòng)物提供了無限可能。

2.3 嵌合體動(dòng)物

除了對(duì)豬進(jìn)行遺傳修飾以作為器官供體之外,科學(xué)家們還嘗試采用異種生成(Xeno-generation)技術(shù)(即在豬中生長人體器官)來緩解器官短缺的矛盾。與直接修飾豬作為器官供體相比,異種生成采用跨種囊胚互補(bǔ)(Interspecies blastocyst complementation),結(jié)合人源供體多能干細(xì)胞和器官生成障礙受體豬,允許在靶器官中富集供體細(xì)胞以形成攜帶人源化靶器官的嵌合動(dòng)物,并最終可用于移植[25]。Matsunari 等[26]證明了在豬中使用囊胚互補(bǔ)產(chǎn)生同基因器官的可行性。通過在Pdx1-Hes1 胰腺發(fā)育障礙豬克隆囊胚中注入正常豬胚胎的卵裂球,生產(chǎn)出的豬具有正常構(gòu)型和功能的胰腺,并能夠存活至成年。Wu 等[27]報(bào)道了一種種間嵌合體,人類多能干細(xì)胞可以在豬胚胎中整合和分化,這是向異種器官生成邁出的一大步。獲得器官生成障礙的受體是使用這項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵之一。當(dāng)鑒定出控制靶器官發(fā)育的基因時(shí),就可以通過基因組編輯簡單地實(shí)現(xiàn)器官發(fā)生障礙的豬。Wu 等[28]和Wang 等[29]采用CRISPR∕Cas9 技術(shù)分別敲除PDX1和SIX1∕SIX4 基因來抑制豬的胰腺和腎臟的發(fā)育,為在豬中實(shí)現(xiàn)人體器官的發(fā)生創(chuàng)造了合適的平臺(tái)。

Yang 等[30]采用CRISPR 結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)出表達(dá)人胰島素的轉(zhuǎn)基因豬??茖W(xué)家們期望來源于該種INS-人源化豬的胰島素對(duì)于治療糖尿病患者具有更好的效果,同時(shí)也將提供更理想的異種胰島來源以克服由豬和人之間的胰島素差異引起的風(fēng)險(xiǎn)。

3 人類疾病模型豬的構(gòu)建

基因組編輯技術(shù)自發(fā)現(xiàn)至今已經(jīng)廣泛且深入地促進(jìn)了豬作為人類疾病模型的應(yīng)用。雖然科學(xué)家們利用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)(包括原核注射、精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、基因打靶等)已經(jīng)創(chuàng)造出多種疾病模型,然而使用基因組編輯工具,編輯效率不僅有了很高的提升,基因組變化也能夠從單等位基因直接擴(kuò)展到多個(gè)基因,從而為類似于人類的大型動(dòng)物模型中的復(fù)雜多基因遺傳疾病的模擬和破譯鋪平了道路。

3.1 心血管疾病

心血管疾病是全球范圍內(nèi)造成死亡和殘疾的頭號(hào)病因。作為最常用的模式生物,小鼠已經(jīng)幫助科學(xué)家們?cè)谛难芗膊⊙芯款I(lǐng)域取得了很多進(jìn)展。然而小鼠心臟和人類差異巨大,通常不能準(zhǔn)確地模擬人類心血管系統(tǒng)的生理學(xué)和病理學(xué)。相比之下,豬的心臟在解剖結(jié)構(gòu)、血管系統(tǒng)、膽固醇代謝方式等方面和人都極其相似,在豬體內(nèi)模擬人類相關(guān)心血管疾病的發(fā)生和疾病治療具有更實(shí)際的意義。

動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病的罪魁禍?zhǔn)?主要是由LDL 受體基因(LDLR)中發(fā)生功能喪失性突變或編碼載脂蛋白B(APOB)的基因突變引起。使用傳統(tǒng)同源重組生產(chǎn)的LDLR 敲除豬已被證實(shí)具有明顯的模型效果,使科學(xué)家們能夠在短時(shí)間內(nèi)模擬人類家族性高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生,以及進(jìn)行藥物或者治療方法的臨床前評(píng)估。2012年,Carlson 等[31]報(bào)道了TALEN 技術(shù)介導(dǎo)的LDLR 基因敲除豬的獲得,打靶效率較傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)有了大幅提升(針對(duì)不同目的基因的單等位和雙等位基因敲除效率最高達(dá)54%和17%)。近期,通過使用CRISPR∕Cas9 技術(shù),Huang 等[32]在廣西Bama 小型豬中成功將ApoE 和LDLR 同時(shí)敲除。這些豬在早期(2月齡)即開始出現(xiàn)并維持與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的異常脂質(zhì)代謝,LDL 膽固醇、總膽固醇以及載脂蛋白E 水平均出現(xiàn)顯著升高。

采用基因編輯技術(shù),科學(xué)家們還創(chuàng)建出其他心血管疾病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因豬模型。噻唑烷二酮(TZD)是一類用于治療二型糖尿病的藥物,能夠介導(dǎo)PPARγ 受體的活化。PPAR-γ 受體是配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子,通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)來增加外周組織中的胰島素敏感性,進(jìn)而降低血糖。但在實(shí)際治療過程中,有報(bào)道TZD 具有顯著增加糖尿病患者心血管不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。Yang 等[33]通過ZFN 技術(shù)構(gòu)建出了PPARγ 雜合敲除體細(xì)胞克隆豬,以期用來研究PPARγ 基因在心血管疾病中的具體功能。NPC1L1(Niemann-Pick C1-Like 1)是一個(gè)在膳食膽固醇吸收和膽汁膽固醇重吸收中起關(guān)鍵作用的基因。Wang等[34]通過向早期胚胎中共注射cas9 mRNA 和sgRNA,獲得Npc1l1 基因敲除Bama 小型豬,用于研究Npc1l1 基因在心血管和代謝疾病的發(fā)生中的作用。

3.2 神經(jīng)退行性疾病

神經(jīng)退行性疾病越來越成為老年化人群中常見的一類疾病,嚴(yán)重影響了老年人群的生活質(zhì)量甚至生命健康。利用具有相應(yīng)遺傳修飾的轉(zhuǎn)基因豬可以協(xié)助科學(xué)家們了解此類疾病的病理發(fā)生發(fā)展,從而解決目前神經(jīng)退行性疾病治療方法及其匱缺的窘境。

帕金森病(PD)是第二大類神經(jīng)退行性疾病,臨床表現(xiàn)包括運(yùn)動(dòng)功能障礙,如運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫、僵硬和體位不穩(wěn),還伴有自主神經(jīng)功能和認(rèn)知障礙等。在多種類型的帕金森病例中,大約10%已被確認(rèn)是由單基因控制,包括SCNA、LRRK2、Parkin、Pink1、DJ-1 等[35]。Yao 等[36]通過將DJ-1 特異的TALENs 和一條單鏈寡核苷酸共轉(zhuǎn)染大白豬成纖維細(xì)胞,成功地將該短片段插入DJ-1 位點(diǎn),再經(jīng)體細(xì)胞核移植獲得DJ-1 基因敲除的轉(zhuǎn)基因豬。Western blot 結(jié)果顯示基因敲除豬中DJ-1 基因的表達(dá)被成功破壞。Zhou等[37]報(bào)道了使用CRISPR∕Cas9 技術(shù)通過一步轉(zhuǎn)染和核移植獲得PARK2 和PINK1 純合雙敲豬模型,敲除效率高達(dá)38.1%。免疫熒光檢測顯示克隆豬的大腦中并無Pink1 和Parkin 蛋白的表達(dá)。Wang 等[38]通過共注射Cas9 mRNA 和分別靶向Parkin、DJ-1 和PINK1 基因的混合sgRNAs 至一細(xì)胞期廣西Bama 小型豬胚胎中,成功將這三個(gè)PD 相關(guān)基因同時(shí)敲除。近期,Zhu 等[39]采用Crispr∕Cas9 技術(shù),成功在廣西Bama小型豬中引入了三個(gè)導(dǎo)致遺傳性PD 的α-突觸核蛋白(SCAN)基因的錯(cuò)義單等位基因突變(E46K,H50Q和G51D)。DNA 測序確認(rèn)這些小型豬在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)了突變形式的α-突觸核蛋白。雖然在這幾個(gè)帕金森疾病模型豬中暫時(shí)都未發(fā)現(xiàn)PD 相關(guān)的表型變化,考慮到PD 是一種進(jìn)行性疾病,人類平均發(fā)病年齡約為60 歲,研究者們預(yù)計(jì)這些豬會(huì)在生長晚期逐漸出現(xiàn)疾病特征。

亨廷頓氏病(HD)是一種致命的常染色體顯性遺傳性神經(jīng)退行性疾病,由亨廷頓蛋白(HTT)單基因突變引起。HTT 基因的外顯子1 中的CAG 重復(fù)增加( >36個(gè)CAG)導(dǎo)致一種異常的多聚谷氨酰胺(polyQ)重復(fù),導(dǎo)致HTT 在腦中錯(cuò)誤折疊和聚集。Yan 等[40]報(bào)道了人亨廷頓蛋白(HTT)敲入豬作為亨廷頓病模型。研究者利用CRISPR∕Cas9 技術(shù)將含有150-CAG 重復(fù)的人HTT 外顯子1 替換了含有18個(gè)CAG 重復(fù)的豬HTT 外顯子1。與年齡和性別匹配的野生型豬相比,克隆的HTT 敲入豬顯示較少的體重增加以及HD 樣癥狀,包括通常在HD 患者中觀察到的運(yùn)動(dòng)功能和呼吸困難。形態(tài)學(xué)分析顯示,轉(zhuǎn)基因豬在腦部具有顯著的神經(jīng)元退行性特征,紋狀體帶刺神經(jīng)元明顯退化,很好的模擬了人類亨廷頓氏病的病理特征,為亨廷頓氏病的病理研究和治療提供了良好的模型基礎(chǔ)。

3.3 新陳代謝疾病

糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是全世界范圍內(nèi)最常見的慢性代謝疾病。其特征在于葡萄糖穩(wěn)態(tài)失衡,具體表現(xiàn)為高血糖水平、多尿、煩渴和體重減輕等。長期血糖異常還容易引發(fā)多種嚴(yán)重并發(fā)癥,如心血管疾病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、腎病和神經(jīng)病變等,進(jìn)而導(dǎo)致大量器官衰竭,對(duì)人體健康危害極大。

豬是研究人類糖尿病理想的動(dòng)物模型:兩者都屬于雜食類生物;豬胰腺在大小、形狀和血液供應(yīng)方面類似于人胰腺,豬的內(nèi)分泌細(xì)胞類型與胰島大小和比例也與人類相近。臨床上,糖尿病是由胰島β 細(xì)胞的胰島素產(chǎn)生或者分泌的異常,或者血液循環(huán)中的胰島素的敏感性降低而引起。Cho 等[41]采用CRISPR∕Cas9 技術(shù)成功獲得了胰島素基因(INS)敲除體細(xì)胞核移植豬。由于完全缺失了胰腺胰島素的表達(dá),INS敲除仔豬表現(xiàn)出預(yù)期的高血糖水平,同時(shí)在尿液中檢測到葡萄糖;喂食后,豬血清中的胰島素和c-肽水平保持不變。胰島素缺失豬模型對(duì)于糖尿病研究中的諸多領(lǐng)域,例如胰島細(xì)胞移植、新藥有效性以及安全性測試等是非常珍貴的材料。Sheets 等[42]利用CRISPR∕Cas9 技術(shù)率先在豬中敲除了胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)節(jié)基因GRB10(Growth-hormone receptor binding protein-10)。生長激素受體結(jié)合蛋白10(GRB10)是一種adaptor 蛋白,能夠結(jié)合并直接抑制胰島素樣生長因子1∕2 和胰島素受體,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)功能。在小鼠中,基因敲除和過表達(dá)研究都證實(shí)了GBR10 作為生長抑制因子的作用。然而,由于小鼠和人類之間GRB10 基因的印記狀態(tài)存在差異,因此GRB10 基因敲除豬對(duì)于研究該基因在糖尿病中對(duì)胰島素抵抗和肥胖的作用具有更實(shí)際的意義。

對(duì)于糖尿病的治療,將體外分化的胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞以及能夠產(chǎn)生功能性胰島素的原代細(xì)胞誘導(dǎo)成具有正常功能的β 細(xì)胞進(jìn)行替代治療給糖尿病患者帶來了新的希望。完全了解胰腺發(fā)育過程中調(diào)節(jié)因子的功能是控制體外分化過程中發(fā)育程序的關(guān)鍵,對(duì)于產(chǎn)生功能性β 細(xì)胞至關(guān)重要。通過在小鼠中進(jìn)行基因敲除的研究,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)PDX-1、NGN3 等基因與胰腺的發(fā)育以及功能至關(guān)重要[43]。NEUROGENIN 3(NGN3)基因敲除小鼠表現(xiàn)為內(nèi)分泌胰腺發(fā)育的喪失。人胰腺內(nèi)分泌發(fā)育的研究中,也有多項(xiàng)證據(jù)支持NGN3 在人類胎兒祖細(xì)胞的細(xì)胞重編程、細(xì)胞分化和維持中的作用。然而,Jennings 等[44]還同時(shí)闡明了人類和小鼠胰腺發(fā)育之間存在差異,特別是Ngn3 的時(shí)間表達(dá)模式需要在豬等生理上和系統(tǒng)發(fā)育上更接近人類的非嚙齒動(dòng)物模型中進(jìn)行研究。Sheets 等[45]將靶向NGN3 的Cas9 核糖核蛋白注入體內(nèi)培養(yǎng)的豬胚胎中,成功獲得三頭NGN3 基因敲除豬。初生仔豬能夠接受初乳和正常哺乳,但在24—36 h 內(nèi)經(jīng)歷了極端的體重減輕,胰島素、胰高血糖素和生長抑素等胰腺內(nèi)分泌激素均無表達(dá),從而支持了NGN3 在豬內(nèi)分泌胰腺發(fā)育中的關(guān)鍵作用。PDX-1 是胎兒期胰腺發(fā)育的關(guān)鍵基因。在小鼠中,完全缺失PDX-1 導(dǎo)致胰腺發(fā)育不全,而PDX-1 單等位基因失活的小鼠雖然能形成胰腺,胰腺β-細(xì)胞的胰島素分泌卻顯著減少,該結(jié)果與2 型糖尿病患者的癥狀類似。此外還有報(bào)道某些2 型糖尿病患者攜帶PDX-1 突變。因此,PDX-1 雜合缺失豬可作為2 型糖尿病理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)P?。Tanihara 等[46]探索了一種新的方法,將Cas9 蛋白和靶向PDX-1 基因的sgRNA 通過電轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)入豬胚胎中,獲得的囊胚打靶效率最高達(dá)94.1%。

Laron 綜合征是一種比較罕見的常染色體代謝類疾病,主要特征包括身材矮小、額葉突起、小中面、中度肥胖等,患者通常表現(xiàn)出極高水平的循環(huán)生長激素(GH)和嚴(yán)重的胰島素樣生長因子I(IGF-I)缺乏。造成Laron 綜合征的病因在于生長激素受體(GHR)的突變:大多數(shù)Laron 患者中發(fā)現(xiàn)的突變發(fā)生在GHR蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域,導(dǎo)致其無法與GH 結(jié)合;其他突變則會(huì)導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能喪失。迄今為止,Laron綜合征只能通過重組IGF-I 進(jìn)行治療,但是會(huì)給患者帶來多種副作用,包括低血糖、胸腺肥大、低血壓等。

為了對(duì)Laron 綜合征的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究,進(jìn)而開發(fā)新的治療策略,科學(xué)家們?cè)陔u和小鼠中構(gòu)建了相應(yīng)的疾病模型,在一定程度上表現(xiàn)出了相應(yīng)的疾病特征。然而由于Laron 綜合征屬于代謝類疾病,又有不同的課題組先后在與人類激素代謝通路更為接近的豬中對(duì)其進(jìn)行了研究。采用ZFN 和CRISPR∕Cas9 技術(shù)獲得的GHR 基因敲除個(gè)體均表現(xiàn)出與Laron 綜合征相一致的表型:IGF-1 水平顯著降低、血清GH 水平顯著升高、(發(fā)育一段時(shí)間后)個(gè)體體型和體重明顯偏低,同時(shí)還伴有低血糖、脂肪含量增多等[47-48],為該疾病的病理研究以及進(jìn)一步評(píng)估患者健康狀況和預(yù)期壽命提供了理想的素材。

3.4 癌癥

近幾十年來,人類對(duì)癌癥的理解取得了革命性的進(jìn)展,許多癌癥的分子機(jī)制通過小鼠模型被闡明。其中獲得性突變是癌癥的最常見原因,基因組的不穩(wěn)定性、原癌基因的激活和抑癌基因的失活都可導(dǎo)致不同類型的癌癥。Wang 等[49]通過CRIPSR∕Cas9 介導(dǎo)的基因敲入建立了具有Cre 依賴性誘導(dǎo)型Cas9 表達(dá)豬,以實(shí)現(xiàn)組織和時(shí)間特異性方式誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的目的。在該研究中,為了模擬非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)致癌融合基因EML4-ALK,兩種靶向EML4 和ALK 的gRNA 通過慢病毒被引入豬成纖維細(xì)胞中,再經(jīng)由CRISPR∕Cas9 介導(dǎo)的基因組倒位即能夠產(chǎn)生具有致癌EML4-ALK 融合基因的成纖維細(xì)胞。此外,該研究還通過鼻內(nèi)遞送靶向腫瘤抑制基因TP53、PTEN、APC、BRCA1 和BRCA2 以及癌基因KRAS 的多重gRNA 檢驗(yàn)了體內(nèi)誘導(dǎo)肺癌的可行性。gRNA 給藥3個(gè)月后,Cre 依賴性Cas9 表達(dá)豬出現(xiàn)肺病的跡象,肺組織的形態(tài)學(xué)分析顯示出與人類腺癌相似的病理特征。

TP53(編碼p53)是重要的腫瘤抑制基因,其在保護(hù)細(xì)胞免于致癌轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用,是癌癥中最常見的突變基因之一。Shen 等[50]采用TALENs 技術(shù)獲得了P53 基因敲除豬,該基因mRNA 的表達(dá)在各組織中均顯著降低。共聚焦顯微鏡和Western Blotting 分析進(jìn)一步表明,P53 雙等位基因敲除豬的成纖維細(xì)胞在介導(dǎo)DNA 損傷修復(fù)方面存在缺陷。近期,Tanihara 等[51]報(bào)道通過基因編輯引起的突變成功誘導(dǎo)了TP53 嵌合和雙等位基因突變豬的腫瘤表型。在這項(xiàng)研究中,靶向TP53 外顯子3 和內(nèi)含子4 的sgRNA連同Cas9 蛋白通過電轉(zhuǎn)染的方式被轉(zhuǎn)入受精卵中。在9 頭出生存活的仔豬中,6 只攜帶TP53 突變(2 只發(fā)生雙等位基因突變,剩余4 頭為單等位基因突變)。對(duì)這些基因敲除豬連續(xù)監(jiān)測16個(gè)月后,三頭(50%)表現(xiàn)出不同的腫瘤表型:兩頭雙等位基因突變豬發(fā)展出下頜骨肉瘤和腎母細(xì)胞瘤;在兩個(gè)sgRNA靶位點(diǎn)均出現(xiàn)缺失的單等位基因突變豬則表現(xiàn)出惡性纖維組織細(xì)胞瘤。

除了這兩例在體內(nèi)成功誘導(dǎo)腫瘤的轉(zhuǎn)基因豬模型之外,其他課題組還先后生產(chǎn)出了敲除APC 基因(結(jié)腸癌相關(guān))[52]、MITF 基因(黑色素瘤相關(guān))[53]以及RUNX3 基因(胃癌相關(guān))[54]的基因編輯轉(zhuǎn)基因豬。這些動(dòng)物的致癌表型還需要進(jìn)一步的觀察和研究。

3.5 免疫缺陷

具有嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(Severe Combined Immunodeficient,SCID)的動(dòng)物不僅能夠模擬人類疾病,還能成為癌癥、干細(xì)胞、細(xì)胞療法和器官移植等研究領(lǐng)域的有力工具。通過將人免疫和∕或癌細(xì)胞系一起植入SCID 小鼠進(jìn)行研究,科學(xué)家已獲得了許多重要的成果。然而,小鼠模型的諸多局限,包括與人類在尺寸和代謝上的差異、模擬人類腫瘤異質(zhì)性的困難等,限制了這些成果在人類疾病研究上更精確的轉(zhuǎn)化。豬與人類的免疫相關(guān)基因具有很高的同源性,研究者們采用基因編輯技術(shù)對(duì)IL2RG、RAG1∕2 等基因進(jìn)行修飾,已生產(chǎn)出多例SCID 豬模型,以用來彌合人類和小鼠之間的差異[55]。

在人和小鼠中,白細(xì)胞介素-2 受體γ(Interleukin-2 Receptor Gamma chain,IL2Rγ)亞基是IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15 和IL-21 信號(hào)傳導(dǎo)所必需的。由于正常淋巴發(fā)育需要IL-2 等細(xì)胞因子的參與,因此IL2Rγ 亞基的缺失會(huì)破壞T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞發(fā)育,對(duì)B 細(xì)胞也有一定程度影響。IL2RG 基因位于哺乳動(dòng)物的X 染色體上,受體在淋巴細(xì)胞上表達(dá)。IL2RG 基因的缺失或突變將導(dǎo)致與X 染色體相關(guān)的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷。采用同源重組或者基因編輯技術(shù)獲得的IL2RG 基因缺失的轉(zhuǎn)基因豬均表現(xiàn)出胸腺缺失,T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞數(shù)量明顯下降[56-57]。

重組激活基因RAG1 和RAG2 是常染色體中的兩個(gè)相鄰基因,編碼的酶參與T 和B 細(xì)胞受體(分別為TCR 和BCR)生成所需的VDJ 重組,促進(jìn)B 和T 細(xì)胞成熟發(fā)育。如果兩個(gè)基因中的任一個(gè)被破壞,V(D)J 重組無法啟動(dòng),T 和B 細(xì)胞發(fā)育停滯在不成熟狀態(tài)。Huang 等[58]利用TALEN 技術(shù)獲得RAG1 或RAG2 敲除的轉(zhuǎn)基因豬,RAG1 或RAG2 敲除的豬表現(xiàn)出成熟的B 淋巴細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞缺失,以及失去V(D)J 重排的功能。建立了無成熟B 和T 淋巴細(xì)胞的SCID 豬模型。隨后,Lee 等[59]同樣利用TALEN 技術(shù)獲得RAG2 單等位基因和雙等位基因突變的轉(zhuǎn)基因豬。在4 只雙等位基因突變的豬中,3 只缺失胸腺,1 只胸腺發(fā)育不正常。將人誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞注射到這些SCID 豬中,能夠快速形成代表多種人體組織的畸胎瘤。2016年,Lei 等[2]應(yīng)用CRISPR∕Cas9 技術(shù)在豬胚胎中同時(shí)敲除RAG2∕IL2RG 基因,獲得RAG2∕IL2RG 雙敲的基因修飾豬,表現(xiàn)出嚴(yán)重的免疫缺陷。與野生型豬相比,該模型在病毒感染實(shí)驗(yàn)中顯示出感染增加且感染時(shí)間更長,同時(shí)由于缺乏淋巴細(xì)胞,血液中及腸組織中病毒滴度更高。

在另一項(xiàng)研究中,Chen[60]的課題組通過應(yīng)用CRISPR∕Cas9 技術(shù)靶向敲除IgM 重鏈基因,生產(chǎn)出B 細(xì)胞缺陷型豬。IgM 是重鏈和輕鏈重排后第一個(gè)表達(dá)的isotype,對(duì)B 細(xì)胞的發(fā)育和分化中至關(guān)重要。B 細(xì)胞缺陷型豬表現(xiàn)出血液中B 細(xì)胞和抗體的缺失,因此可用于模擬人B 細(xì)胞缺陷,同時(shí)為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)在豬中大規(guī)模生產(chǎn)病原體特異性和高滴度人類多克隆抗體奠定了基礎(chǔ)。

近期,Zhang 等[61]報(bào)道采用CRISPR∕Cas9 技術(shù)獲得缺失補(bǔ)體蛋白C3 的豬。補(bǔ)體系統(tǒng)是先天免疫的重要機(jī)制,在細(xì)菌溶解、炎癥反應(yīng)以及體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮重要功能。作為補(bǔ)體系統(tǒng)的中心組分,C3 蛋白已被證明在免疫激活和多種生物功能中具有關(guān)鍵作用。C3 敲除豬為在大動(dòng)物中進(jìn)一步闡明該基因的功能以及研究C3 相關(guān)疾病提供了寶貴資源。

3.6 其他疾病模型

除了上述幾種類別的疾病模型,科學(xué)家采用基因編輯技術(shù)還對(duì)血友病、哈金森-吉爾福德早衰綜合征(HGPS)等其他疾病模型進(jìn)行了嘗試。Hai 等[62]通過向受精卵中注射靶向干涉豬vWF基因的sgRNA 和Cas9 mRNA,成功獲得6 只vWF雙等位基因突變仔豬和5 只單等位基因突變仔豬。對(duì)vWF 抗原水平、凝血因子FVIII 活性以及出血時(shí)長等與血友病相關(guān)指標(biāo)的檢測結(jié)果則進(jìn)一步表明vWF雙等位基因突變體豬表現(xiàn)出人類血友病相類似的表型。HGPS 哈金森-吉爾福德早衰綜合征(HGPS)是一種極為罕見的遺傳性疾病,疾病特征主要表現(xiàn)為由于心血管并發(fā)癥而引起青春期早衰及死亡,至今無有效的治療方法。大多數(shù)HGPS 患者攜帶雜合的LMNA c.1824C >T 突變,進(jìn)而表達(dá)一種稱為progerin 的顯性失活突變蛋白。由于在HGPS 小鼠模型中的有效療法在HGPS 臨床試驗(yàn)中收效甚微,Dorado 等[63]通過CRISPR-Cas9 基因編輯生產(chǎn)了HGPS 的第一個(gè)大型動(dòng)物模型,一種敲入雜合LMNA c.1824C >T 突變的Yucatan 小型豬。與HGPS 患者一樣,HGPS 小型豬內(nèi)源性共表達(dá)Progerin 和正常的核纖層蛋白A∕C,并表現(xiàn)出嚴(yán)重的生長遲緩、脂肪代謝障礙、皮膚和骨骼改變、心血管疾病以及早期死亡。作者同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了由于微血管損傷和心肌間質(zhì)纖維化導(dǎo)致的心肌灌注減少。這些之前未發(fā)現(xiàn)的表象很可能可作為對(duì)患者疾病進(jìn)展監(jiān)測的指標(biāo)。HGPS 小型豬為研究者提供了一個(gè)合適的模型,能夠在臨床前階段用于測試治療設(shè)備并優(yōu)化候選療法,從而加速對(duì)HGPS 患者有效應(yīng)用的開發(fā)。

4 結(jié)論

隨著基因組編輯工具的廣泛應(yīng)用,具有特異遺傳修飾的大型動(dòng)物模型出現(xiàn)速度得到了大幅提升。一方面表現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因效率上,由于可以同時(shí)在多個(gè)位點(diǎn)對(duì)個(gè)體進(jìn)行編輯,以往需要至少幾年時(shí)間才能獲得的大型動(dòng)物模型現(xiàn)在僅需要幾個(gè)月;另一方面,生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的途徑也不僅局限于體細(xì)胞核移植,通過受精卵注射相應(yīng)人工核酸酶的方法同樣高效。相信在科學(xué)家們的不懈努力下,對(duì)現(xiàn)有基因編輯工具的優(yōu)化以及新技術(shù)的出現(xiàn)將進(jìn)一步拓寬其應(yīng)用,從而促進(jìn)建立農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)中所需基因型的優(yōu)良動(dòng)物模型。

猜你喜歡
異種轉(zhuǎn)基因基因組
探秘轉(zhuǎn)基因
轉(zhuǎn)基因,你吃了嗎?
牛參考基因組中發(fā)現(xiàn)被忽視基因
異種部門
異種部門
異種部門
異種部門
天然的轉(zhuǎn)基因天然的轉(zhuǎn)基因“工程師”及其對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的意蘊(yùn)
基因組DNA甲基化及組蛋白甲基化
遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:58:49
有趣的植物基因組
东阿县| 鄄城县| 呼和浩特市| 烟台市| 阿克| 铜梁县| 西丰县| 汉阴县| 梅州市| 灵丘县| 卫辉市| 达孜县| 余庆县| 桃园市| 甘谷县| 东城区| 余姚市| 凌源市| 和龙市| 望江县| 高密市| 保德县| 吐鲁番市| 纳雍县| 海盐县| 三穗县| 荣成市| 句容市| 吐鲁番市| 巴塘县| 朝阳市| 宁明县| 临沭县| 裕民县| 大连市| 邹平县| 玉林市| 广安市| 宾川县| 沙湾县| 小金县|