王文杰,葛 雷,張樹山,吳彩風(fēng),戴建軍,張德福

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物遺傳工程研究室,上海201106)

自玻璃化冷凍保存技術(shù)在小鼠8 細(xì)胞期胚胎成功應(yīng)用以來[1],因其方便、快捷和高效,得到了飛速發(fā)展,使哺乳動(dòng)物種質(zhì)資源保存成為現(xiàn)實(shí)。該技術(shù)在牛羊等家畜的胚胎冷凍中應(yīng)用成熟,并在實(shí)際生產(chǎn)中得到了商業(yè)化應(yīng)用[2]。由于豬的胚胎對(duì)低溫非常敏感,容易受到低溫?fù)p傷,導(dǎo)致其冷凍保存研究進(jìn)展仍比較緩慢。我國直到2005年才成功獲得豬胚胎超低溫冷凍保存后代[3],但相關(guān)技術(shù)離實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用仍有一定差距,需進(jìn)一步對(duì)冷凍保護(hù)劑和冷凍方法進(jìn)行優(yōu)化。凍后氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是影響胚胎進(jìn)一步發(fā)育的主要因素[4-5]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)極其重要的細(xì)胞器,是ATP 的主要供給來源。研究表明,冷凍可破壞卵母細(xì)胞或胚胎內(nèi)的線粒體結(jié)構(gòu),造成線粒體功能障礙,直接影響其體外發(fā)育能力[6-8]。MitoQ是一種新型線粒體靶向抗氧化劑,可降低線粒體受到的氧化損傷。在人類精子冷凍保存中,劉麗等[9]發(fā)現(xiàn)MitoQ 能夠明顯降低精子氧化損傷,并顯著提高其抗凍能力。本試驗(yàn)在豬卵母細(xì)胞體外成熟、胚胎培養(yǎng)及玻璃化冷凍與解凍過程中全程添加200 nmol∕L MitoQ,通過檢測(cè)其線粒體膜電位、氧化應(yīng)激水平、凋亡狀態(tài)、發(fā)育能力和相關(guān)基因表達(dá)水平,探究MitoQ 對(duì)豬孤雌激活囊胚冷凍保存的影響。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑

本研究所用常規(guī)生化試劑除特殊說明外均購自美國Sigma 公司,培養(yǎng)液購自美國Gibco 公司,培養(yǎng)所用耗材購于丹麥Nunc 公司。

1.2 卵母細(xì)胞的采集和體外成熟

從上海嘉定五豐屠宰場(chǎng)采集豬新鮮卵巢,保存于含200 IU∕mL 雙抗的37 ℃生理鹽水中,2 h 內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。抽取卵巢表面直徑為2—6 mm 的卵泡液,靜置15 min 后于顯微鏡下挑選結(jié)構(gòu)完整、胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus-oocyte complexes,COCs),用TCM-199 清洗3 次,每60 枚COCs 置于500 μL 體外成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)44 h。體外成熟培養(yǎng)液由TCM-199 加10%豬卵泡液(實(shí)驗(yàn)室自制)、10 IU∕mL孕馬血清促性腺激素(寧波第三激素制品有限公司)、10%胎牛血清、10 IU∕mL 雙抗、0.1 mg∕mL 的L-半胱氨酸和10 ng∕mL 表皮生長因子組成。培養(yǎng)條件為38.5 ℃、5% CO2及飽和濕度。試驗(yàn)組成熟過程中添加MitoQ,其終濃度為200 nmol∕L,對(duì)照組不添加MitoQ。

1.3 卵母細(xì)胞孤雌激活及體外培養(yǎng)

成熟培養(yǎng)44 h 后的COCs 用0.1%透明質(zhì)酸酶消化以去除顆粒細(xì)胞,TCM-199 洗滌3 次后,選擇形態(tài)均一且排出第一極體的成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活。使用電激活液(50 μmol∕L CaCl2、0.3 mol∕L 甘露醇和0.1 mmol∕L MgCl2)洗滌卵母細(xì)胞3 次,移入電激活槽,電激活參數(shù)為1.2 kV∕cm、30 μs、1 次激活。激活后的卵母細(xì)胞經(jīng)PZM-3 清洗3 次后置于38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7 d。試驗(yàn)組培養(yǎng)液(PZM-3)中添加終濃度為200 nmol∕L 的MitoQ,對(duì)照組不添加MitoQ。

1.4 囊胚玻璃化冷凍解凍

囊胚的冷凍與解凍均在38.5 ℃熱臺(tái)上進(jìn)行,將培養(yǎng)所得囊胚在冷凍平衡液(PZM-3 含7.5% EG、7.5% DMSO、20% FBS)中處理3—5 min,轉(zhuǎn)移至冷凍保護(hù)液(PZM-3 含15% EG、15% DMSO、20% FBS、0.4 mol∕L 蔗糖)中處理15 s,之后用OPS 管裝載,迅速投入液氮中保存。解凍時(shí),將OPS 管從液氮中取出,迅速置于解凍I 液(含0.5 mmol∕L 蔗糖的培養(yǎng)液)中,吹出囊胚,處理3—5 min 后轉(zhuǎn)移至解凍II 液(含0.25 mmol∕L 蔗糖的培養(yǎng)液)中繼續(xù)作用3—5 min,之后囊胚用PZM-3 洗滌3 次,并在PZM-3 中培養(yǎng)24 h備用。MitoQ 處理組解凍囊胚在含有200 nmol∕L MitoQ 的PZM-3 中培養(yǎng),對(duì)照組培養(yǎng)液中不含MitoQ。

1.5 線粒體膜電位檢測(cè)

線粒體膜電位ΔΨm用JC-1 試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行檢測(cè)。囊胚在JC-1 染液(含800 μL TCM-199 和200 μL 5×染色液緩沖液)中38.5 ℃條件下避光孵育20 min,4 ℃染色緩沖液洗3 次,置于共聚焦顯微鏡(LSCM,Nikon,日本)下觀察拍照。使用Image-Pro Plus 6.0 軟件分別記錄綠色和紅色熒光信號(hào)強(qiáng)度,每個(gè)囊胚紅色(RITC)和綠色(FITC)熒光強(qiáng)度的比值即為ΔΨm。每組重復(fù)3 次,每次約20 枚囊胚。

1.6 Pan-Caspase 染色

Pan-Caspase 原位熒光染色采用美國Promega 公司試劑盒進(jìn)行染色。將FITC-VAD-FMK 用TCM-199按照1∶500 稀釋配成染色液,處理好的囊胚置于染色液中孵育20 min,PZM-3 洗3 次,熒光顯微鏡下觀察拍照。用Image-Pro Plus 6.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析熒光強(qiáng)度值。每組重復(fù)3 次,每次約20 枚囊胚。

1.7 TUNEL 凋亡染色

用一步法TUNEL 檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。解凍好的囊胚在4%多聚甲醛中固定1 h,在含有0.1% Triton X-100 的PBS 中冰浴2 min,之后移入50 μL TUNEL 檢測(cè)液(2 μL TdT 酶+ 48 μL 熒光標(biāo)記液)中37 ℃避光孵育1 h。在5 μg∕mL 的Hoechst 33342 染色液中避光孵育10 min進(jìn)行細(xì)胞核染色,PBS 洗3 次后置于載玻片上壓片,顯微鏡下觀察。記錄囊胚細(xì)胞數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)。每組重復(fù)3 次,每次約20 枚囊胚。

1.8 活性氧檢測(cè)

用活性氧檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)活性氧水平。處理好的囊胚移入含有10 μmol∕L DCFH-DA 的TCM-199 中,37 ℃作用20 min。清洗3 次后于熒光顯微鏡下觀察拍照,Image-Pro Plus 6.0 分析熒光強(qiáng)度。每組重復(fù)3 次,每次約20 枚囊胚。

1.9 脂質(zhì)氧化檢測(cè)

脂質(zhì)氧化(MDA)水平采用試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行檢測(cè)。處理好的囊胚加入150 μL 細(xì)胞裂解液,待裂解后,1600g離心10 min,取100 μL 上清,加入200 μL MDA 檢測(cè)工作液,混勻,沸水浴15 min,冷卻至室溫,1000g離心10 min。取200 μL 上清于96 孔板中,532 nm 下測(cè)定吸光度。MDA 濃度值以nmol∕mg 表示。每組重復(fù)3 次,每次約60 枚囊胚。

1.10 凋亡相關(guān)基因表達(dá)

用一步法cDNA 提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取試驗(yàn)組和對(duì)照組囊胚(各120 枚)cDNA。引物信息參見表1,用SYBR GreenⅠ進(jìn)行熒光定量Real-time PCR。PCR 體系為:1 μL cDNA 模板,0.4 μL Forward Primer(10 μmol∕L),0.4 μL Reverse Primer(10 μmol∕L),10 μL 2 × TransStart Top Green qPCR SuperMix,8.2 μL ddH2O;PCR 程序?yàn)?94 ℃30 s;94 ℃5 s,60 ℃(參照各引物最佳退火溫度而定)30 s,45個(gè)循環(huán);95 ℃10 s,65 ℃60 s,97 ℃15 s;37 ℃5 min。所有樣品均3 次重復(fù)。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算比較。

表1 qRT-PCR 所用引物Table 1 Primers for qRT-PCR

1.11 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行Student’st-test 處理。結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,以P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 MitoQ 添加對(duì)豬卵母細(xì)胞孤雌激活囊胚線粒體膜電位和凋亡水平的影響

紅色熒光與綠色熒光比值為線粒體膜電位,橙色熒光強(qiáng)度越高表明線粒體膜電位越高。由圖1 可知,MitoQ 處理組線粒體膜電位(0.83)相比對(duì)照組(0.52)顯著升高。

熒光強(qiáng)度越高表示Pan-Caspase 活性越高。MitoQ 組凍后囊胚總Caspase 凋亡蛋白熒光強(qiáng)度值(20.65)相比對(duì)照組(42.47)顯著下降(圖2)。TUNEL 凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示,MitoQ 組囊胚中細(xì)胞的凋亡比例(22.36%)顯著低于對(duì)照組(36.42%)。

圖1 囊胚線粒體膜電位Fig.1 Mitochondrial membrane potential of vitrified blastocysts

2.2 MitoQ 添加對(duì)豬卵母細(xì)胞孤雌激活囊胚氧化應(yīng)激水平的影響

ROS 含量越高,綠色熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。如圖3 所示,添加MitoQ 處理囊胚的ROS 水平(26.32)相比對(duì)照組(35.70)顯著下降。凍后MitoQ 處理囊胚M(jìn)DA 含量(37.64 nmol∕L)與對(duì)照組(49.83 nmol∕L)相比亦顯著降低。

圖2 囊胚總Caspase 活性Fig.2 Pan-Caspase activities of vitrified blastocysts

圖3 囊胚活性氧水平Fig.3 Effect of ROS level of vitrified blastocysts

2.3 線粒體功能和凋亡相關(guān)基因表達(dá)

如圖4 所示,凍后添加MitoQ 處理的卵母細(xì)胞與對(duì)照組卵母細(xì)胞相比,線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)基因CuZnSOD相對(duì)表達(dá)量顯著提升;線粒體功能相關(guān)基因(DNM1、MFN2)相對(duì)表達(dá)量也顯著提升;凋亡相關(guān)基因TNF-α、Bax相對(duì)表達(dá)量顯著下降,Bcl-2 相對(duì)表達(dá)量顯著升高。

圖4 MitoQ 對(duì)豬孤雌激活囊胚冷凍后相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of MitoQ related gene expression in vitrified blastocysts

3 討論

氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡是影響凍后細(xì)胞損傷的重要因素。細(xì)胞內(nèi)ROS 水平增加可使細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激,造成線粒體功能損傷,激活細(xì)胞凋亡[10-11]。本試驗(yàn)表明,200 nmol∕L MitoQ 處理孤雌激活囊胚,解凍后顯著降低了胚胎的ROS 水平,提高了線粒體膜電位值,說明MitoQ 能降低冷凍對(duì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激,改善線粒體功能。這與陳亞寧等[12]將白藜蘆醇作為抗氧化劑在豬孤雌激活囊胚抗凍研究中結(jié)果一致,也與明少鵬等[13]用MitoQ 在大鼠海馬神經(jīng)元中改善線粒體功能的研究結(jié)果相符。

細(xì)胞受到冷凍損傷后會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)ROS 含量升高,誘發(fā)氧化應(yīng)激[14],而氧化應(yīng)激會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生過量的脂質(zhì)過氧化物MDA,破壞細(xì)胞的生物膜活性,誘導(dǎo)大分子氧化變性,抑制蛋白質(zhì)功能,誘發(fā)細(xì)胞凋亡[15]。本試驗(yàn)表明,冷凍豬孤雌激活囊胚后添加200 nmol∕L MitoQ 能夠明顯降低囊胚的MDA 水平,并減少凍后囊胚中的細(xì)胞凋亡比例。該結(jié)果與Mitchell 等[16]用MitoQ 在腎臟低溫保存中降低細(xì)胞氧化應(yīng)激結(jié)果類似,說明MitoQ 能夠緩解豬孤雌激活囊胚冷凍后的氧化損傷,并通過降低MDA 水平減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生比例,從而提高其抗凍能力。

哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和早期胚胎在發(fā)育中最重要的凋亡途徑為線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑和死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑[17]。TNF-α參與了死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑[18],MFN2、DNM1、Bcl-2、CuZnSOD和Bax則參與了線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑[19]。本試驗(yàn)中,添加200 nmol∕L MitoQ 的凍后豬孤雌激活囊胚與對(duì)照組相比,促凋亡相關(guān)基因Bax、TNF-α表達(dá)水平顯著降低,抑制凋亡相關(guān)基因Bcl-2、CuZnSOD顯著升高,表明MitoQ 能夠降低細(xì)胞凍后凋亡水平,這與Niu 等[20]在豬卵母細(xì)胞冷凍研究中的結(jié)果相符。MitoQ添加后TNF-α表達(dá)水平降低,表明死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑可能參與了MitoQ 對(duì)孤雌激活囊胚抗凍能力的調(diào)節(jié);CuZnSOD表達(dá)水平的提高表明MitoQ 可引起囊胚內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)的增加,從而提高M(jìn)FN2、DNM1 的表達(dá)水平,改善凍后胚胎的線粒體功能,有效降低線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平。該結(jié)果與霍甜甜等[23]用線粒體靶向抗氧化肽SS31 在小鼠神經(jīng)研究中的結(jié)果相符。本研究結(jié)果初步表明了MitoQ能同時(shí)通過改善囊胚細(xì)胞內(nèi)死亡受體介導(dǎo)的和線粒體介導(dǎo)的凋亡水平,提高胚胎的抗凍能力。

綜上所述,200 nmol∕L MitoQ 處理豬孤雌激活囊胚,冷凍后能緩解其細(xì)胞氧化損傷,提高其線粒體功能,從而達(dá)到降低細(xì)胞凋亡水平、提高胚胎抗凍能力的效果。