黃柳娟,馮 博,劉海燕,周昌艷,2,白 冰,邵 毅,2

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所;2 上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點實驗室,上海201403)

因冷鮮雞肉與熱鮮肉、冷凍肉相比,有著營養(yǎng)價值高、口感風(fēng)味佳等優(yōu)點,所以成為我國雞肉消費的主要模式之一[1]。在屠宰、分割、剔骨、包裝、運輸、貯藏到銷售過程中,冷鮮雞肉可能受到羽毛、腳、腸道微生物以及環(huán)境微生物的污染,可能染上病原微生物和其他有害菌;并因冷藏條件不嚴(yán)格而發(fā)生細菌的增殖,從而影響雞肉產(chǎn)品的品質(zhì)及安全性[2]。由于冷鮮雞肉表面接觸的污染源多且復(fù)雜,又在冷藏過程中受存儲溫度、含氧量等原因的影響,因此,冷鮮雞肉表面和內(nèi)部微生物的種類、數(shù)量和增殖情況可能不同[3]。雖然我國對生肉的微生物檢驗明確了取樣部位為深層肌肉[4],但目前對于冷鮮雞肉微生物的研究大多仍將肉塊看作一個整體,較少考慮內(nèi)源和外源細菌的差異[5-6]。

近年來,高通量測序[7]、變性梯度凝膠電泳(DGGE)[8]和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)[9]等技術(shù)的發(fā)展實現(xiàn)了樣本中細菌的高通量分離和鑒定。其中,高通量測序技術(shù)因其不依賴于細菌的培養(yǎng)、快速高通量、可以定量分析等優(yōu)點而越來越多地用于樣品的菌群多樣性分析研究。本試驗基于高通量測序技術(shù),分別對冷藏0 d 和3 d 的冷鮮雞肉表面及內(nèi)部細菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性和增殖趨勢進行分析,旨在為冷鮮雞肉微生物安全的精細控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2 份冷鮮整雞和3 份雞胸肉共5 份冷鮮雞肉樣品于2019年2月隨機采自上海市閔行區(qū)和浦東新區(qū)的5個大型超市。樣品均為塑封包裝,生產(chǎn)或包裝日期為采樣當(dāng)天。將樣品裝入無菌袋,低溫條件(約4 ℃)下3 h 內(nèi)運回實驗室。

1.2 儀器與試劑

儀器:BAGMIXER400 型均質(zhì)機(法國Interscience 公司);Mini-Sub cell GT 型水平核酸電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司);Criterion Stain Free 型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司);NanoDrop 2000c 型超微量分光光度計(美國Thermo 公司);BCD-649WE 型冰箱(中國青島海爾股份有限公司);1384 型生物安全柜(美國Thermo 公司);5424 型離心機(德國Eppendorf 公司);SX-500 型高壓滅菌鍋(日本TOMY 公司)。

試劑:生理鹽水由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn);醫(yī)用酒精購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;細菌基因組提取試劑盒購自德國QIAGEN 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

每份樣品都平均分為2 份:1 份直接分離表面的外源細菌及內(nèi)部的內(nèi)源細菌,命名為E0 組和I0 組;另1 份在4 ℃±1 ℃條件下貯藏3 d,再分別分離外源及內(nèi)源細菌,命名為E3 組和I3 組。

1.3.2 冷鮮雞內(nèi)源和外源細菌的分離和基因組提取

冷鮮雞外源細菌的分離:無菌條件下將雞肉樣品表面(深度不超過5 mm)的組織剪碎,混勻。準(zhǔn)確稱量25 g 于帶濾膜的無菌袋中,加入75 mL 滅菌生理鹽水,均質(zhì)機均質(zhì)2 min,吸取上清,獲得冷鮮雞外源細菌的均質(zhì)液。

冷鮮雞內(nèi)源細菌的分離:用醫(yī)用酒精對雞肉進行表面消毒,在沸水內(nèi)燙3—5 s[4],再用無菌剪刀剪取深層雞肉,剪碎后準(zhǔn)確稱量25 g,同外源細菌的分離步驟,獲得冷鮮雞內(nèi)源細菌的均質(zhì)液。

細菌基因組提取:取50 mL 細菌均質(zhì)液,12000 r∕min 離心,棄上清,用試劑盒提取細菌基因組,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸定量儀測定,確定所提細菌總DNA 的質(zhì)量后,委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行細菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性分析。

1.3.3 細菌菌群的高通量測序及數(shù)據(jù)分析

用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)擴增16S rDNA 的V3-V4 區(qū)。上游引物序列為5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’,下游引序列為5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’。擴增結(jié)束后,用2%瓊脂糖凝膠電泳和核酸定量儀檢測PCR 產(chǎn)物的質(zhì)量,基于IonS5TMXL 測序平臺,利用單端測序(Single-End)的方法,對構(gòu)建的小片段文庫進行高通量測序。

將下機數(shù)據(jù)導(dǎo)出fastq 文件,根據(jù)barcode 序列區(qū)分各樣本的數(shù)據(jù),并進行嵌合體過濾,得到用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)(Clean reads)。以97% 的一致性對所有樣本進行操作分類單元(OTUs,Operational Taxonomic Units)聚類和物種分類分析。用Qiime 軟件(Version 1.9.1)計算α多樣性指數(shù),包括反映菌群豐富度的超指數(shù)(Chao1)和ACE 指數(shù),反映菌群多樣性的香農(nóng)指數(shù)(Shannon)和辛普森指數(shù)(Simpon),以及指示測序深度的菌群覆蓋度指數(shù)(Good’s Coverage),以評估四個處理組內(nèi)物種豐富度和均勻度;同時用R 軟件(Version 2.15.3)的WGCNA、stats 和ggplot2 軟件包,基于Unifrac 距離[10]、選取貢獻率最大的主坐標(biāo)繪制帶有95%置信區(qū)間的置信圈的主坐標(biāo)分析(PCoA,Principal co-ordinates analysis)圖,以初步評估4個處理組之間的菌群差異。

用SILVA132(http:∕∕www.arb-silva.de∕)的SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫在界(Kingdom)、門(Phylum)、綱(Class)、目(Order)、科(Family)、屬(Genus)和種(Species)7個水平對每個OTU 的序列做物種注釋分析,得到對應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況;基于R 軟件用MetaStat 統(tǒng)計分析方法對各組樣本的物種組成和群落結(jié)構(gòu)進行差異顯著性檢驗,對組間的物種豐度數(shù)據(jù)進行假設(shè)檢驗得到P值,根據(jù)P值篩選出分組樣本間屬水平上具有顯著性差異的物種,對每一個物種的相對豐度進行標(biāo)準(zhǔn)化處理得到Z值,并據(jù)此繪制MetaStat 熱圖。

1.4 統(tǒng)計分析

用SPSS 16.0 軟件對4 組樣品的α 多樣性指數(shù)進行單因素方差分析(ANOVA),當(dāng)P＜0.05 時則差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷鮮雞表面和內(nèi)部組織中細菌菌群結(jié)構(gòu)的多樣性分析

對4 組樣品進行α多樣性分析,Good’s Coverage 指數(shù)為0.993—0.997,表明測序深度已基本覆蓋樣品中所有物種,測序結(jié)果能反映不同處理下5個冷鮮雞樣品中細菌菌群的組成情況。4個α多樣性指數(shù)的方差分析結(jié)果均表明,冷鮮雞肉冷藏初期(0 d)表面(E0)和內(nèi)部(I0)的菌群多樣性無顯著差異;冷藏3 d 后,樣品表面(E3)和內(nèi)部(I3)的菌群多樣性也無顯著差異(表1)。因此,用α多樣性分析評估雞肉表面和內(nèi)部組織中細菌菌群的豐富度和多樣性時,在冷藏過程中的2個取樣時間點上,內(nèi)部和表面的細菌菌群無顯著性差異。

表1 冷藏初期和冷藏3 d 時雞肉產(chǎn)品表面及內(nèi)部組織中細菌的α 多樣性指數(shù)Table 1 The α diversity indices of bacterial community isolated from surface and internal of cold storage chicken samples at the 0 and 3rd day

進而用β多樣性分析評價樣品間的微生物組成差異度,不同樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)組成越相似,則樣品間的距離越近。從不同分組間的聚散程度來看,I0 組和E0 組相比,95%置信橢圓范圍更大,說明冷鮮雞肉在冷藏初期,內(nèi)部組織中細菌的菌群結(jié)構(gòu)差異比表面細菌菌群要大;冷藏3 d 后,E3 組的5個樣品間的距離較為接近,95%置信橢圓的范圍小于I3 組的置信橢圓范圍(圖1),說明冷藏3 d后5個雞肉樣品表面細菌的群落結(jié)構(gòu)趨于一致,而內(nèi)部組織的細菌群落仍有差異。因此,用β多樣性分析法比較雞肉表面和內(nèi)部組織中細菌菌群的組成時,在兩個取樣時間點上均存在差異。

圖1 冷藏期間冷鮮雞肉表面和內(nèi)部菌群的PCoA 分析Fig.1 The principle co-ordinates analysis for bacterial community isolated from surface and internal of cold storage chicken samples

2.2 冷鮮雞表面和內(nèi)部組織中細菌菌群結(jié)構(gòu)的差異

在菌屬水平上對菌群結(jié)構(gòu)進行分析,結(jié)果表明,I0、E0、I3 和E3 組各注釋出456、363、457 和169個屬。假單胞菌屬(Pseudomonasspp.)、發(fā)光桿菌屬(Photobacteriumspp.)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacterspp.)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonasspp.)、弓形桿菌屬(Arcobacterspp.)、乳桿菌屬(Lactobacillusspp.)、不動桿菌屬(Acinetobacterspp.)、擬桿菌屬(Bacteroidesspp.)、羅斯氏菌屬(Roseburiaspp.)和梭桿菌屬(Fusobacteriumspp.)為主要優(yōu)勢菌屬(圖2)。其中,在冷鮮雞樣品儲藏初期內(nèi)部組織中較多存在的寡養(yǎng)單胞菌屬、弓形桿菌屬、乳桿菌屬、羅斯氏菌屬和梭桿菌屬并不在已報道的冷鮮雞表面主要菌屬[11]之列,進一步說明冷鮮雞產(chǎn)品表面細菌菌群與內(nèi)部組織中的細菌菌群組成結(jié)構(gòu)可能存在差異。

圖2 冷藏期間冷鮮雞肉表面和內(nèi)部菌群在屬水平上的分布Fig.2 Genus distribution of bacterial community isolated from surface and internal of cold storage chicken samples

進而用MetaStat 法分析各組間豐度具有差異的菌屬,發(fā)現(xiàn)I0 組菌群結(jié)構(gòu)有顯著不同的聚類,在冷藏初期,其中的假單胞屬菌(P＜0.01)和環(huán)絲菌屬(Brochothrixspp.)(P＜0.05)的相對豐度顯著低于表面菌群(E0 組),擬普雷沃菌屬(Alloprevotellaspp.)、阿克曼氏菌屬(Akkermansiaspp.)和Romboutsiaspp.的相對豐度顯著高于E0 組(P＜0.05)(圖2,E0 vs I0)。冷藏3 d 后,內(nèi)部組織細菌(I3 組)中的環(huán)絲菌屬的相對豐度顯著低于表面菌群(E3 組)(P＜0.01),而克雷伯氏菌屬(Klebsiellaspp.)(P＜0.01)、乳桿菌屬(Lactobacillusspp.)(P＜0.01)、Romboutsiaspp.(P＜0.05)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonasspp.)(P＜0.05)顯著高于表面菌群(E3 組)(圖3,E3 vs I3)。

圖3 冷鮮雞肉樣品表面和內(nèi)部菌群豐度的MetaStat 統(tǒng)計分析Fig.3 The MetaStat hotmap of bacterial community isolated from surface and internal of cold storage chicken samples

假單胞菌屬和環(huán)絲菌屬是雞肉腐敗過程中的主要污染菌屬[12-13],易在加工過程中污染肉類[14],因此在肉品表面的污染程度較內(nèi)部更嚴(yán)重。值得注意的是,假單胞菌是雞肉產(chǎn)品攜帶細菌的優(yōu)勢菌屬,在冷藏初期,其在雞肉表面和內(nèi)部的相對豐度分別為6.14%和33.12%(圖2),所以它的顯著差異會導(dǎo)致雞肉產(chǎn)品表面和內(nèi)部細菌菌群結(jié)構(gòu)的差別。乳桿菌屬細菌盡管在真空包裝的冷鮮雞中曾有分離到[15],但在冷鮮雞表面菌群的多樣性分析研究中并不屬優(yōu)勢菌屬[11,16-17]。本研究中,乳桿菌屬在I0 組中的相對豐度排名第5(圖2),成為優(yōu)勢菌屬之一,盡管在冷藏3 d 后其相對豐度有所降低,但內(nèi)部組織中的相對豐度仍顯著高于表面菌群,可能是其在有氧條件下不易生長造成的。5 種非優(yōu)勢菌群中,克雷伯氏菌屬(Klebsiellaspp.)是一種人畜共患的條件致病菌[18],本研究發(fā)現(xiàn)其在雞肉內(nèi)部組織中的相對豐度高于表面,一方面有待更多的樣本進行驗證,另一方面提示應(yīng)對雞肉產(chǎn)品充分加熱以保障其食用安全性;鞘氨醇單胞菌屬在冷藏初期內(nèi)部和外部均存在,隨著冷藏天數(shù)的增加,優(yōu)勢菌的快速繁殖,相對豐度下降,與已有的結(jié)果一致[19];此外,擬普雷沃菌屬、阿克曼氏菌屬和Romboutsia屬在雞肉中的研究較少,多報道于腸道來源[20-21],它們在雞肉表面和內(nèi)部的豐度差異是否與其生長特性有關(guān),還有待進一步研究。

2.3 冷鮮雞冷藏過程中表面和內(nèi)部細菌的變化

冷鮮雞表面和內(nèi)部菌群在冷藏3 d 后豐度發(fā)生顯著變化的菌屬分別有8 種(圖3,E0 vs E3)和3 種(圖3,I0 vs I3)。在冷藏過程中豐度顯著變化的9個細菌屬中,環(huán)絲菌屬因其能適應(yīng)低溫的環(huán)境,是冷藏雞肉中的優(yōu)勢腐敗菌[13],得以在冷藏雞肉的表面和內(nèi)部均顯著增殖;在雞肉表面和內(nèi)部均顯著減少的菌屬僅有Romboutsia屬一種,它是近幾年才開始研究的一種細菌屬,通常在人體腸道中發(fā)現(xiàn),被認為與患者的健康狀況有關(guān),是潛在的腸道生物標(biāo)志物[22]。此外,假單胞菌屬僅在雞肉內(nèi)部顯著增殖,而弓形桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬(Lactococcusspp.)、黃桿菌屬(Flavobacteriumspp.)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumspp.)和Lachnoclostridium屬僅在雞肉表面顯著降低。因此,冷藏期間冷鮮雞表面和內(nèi)部菌群豐度的變化趨勢有所不同。有報道表明:冷鮮雞冷藏過程中乳球菌屬細菌的相對豐度降低[23],與本研究結(jié)果不一致,是否由于取樣部位的不同而導(dǎo)致結(jié)果的不同,還需進一步驗證。此外,隨著冷藏時間的延長直至腐敗,雞肉表面和內(nèi)部細菌的變化差異尚需研究。

3 結(jié)論與討論

本研究用高通量測序技術(shù)比較了冷藏0 d 和3 d 的冷鮮雞表面及內(nèi)部細菌菌群結(jié)構(gòu),通過α多樣性分析未發(fā)現(xiàn)冷鮮雞表面和內(nèi)部組織中細菌菌群的多樣性有顯著差異,但β多樣性分析結(jié)果表明,在冷藏期間的兩個取樣時間點上,雞肉表面和內(nèi)部組織中細菌菌群的組成均存在差異。用MetaStat 法分析表明,優(yōu)勢菌屬中的假單胞菌屬和環(huán)絲菌屬在雞肉品表面的污染程度較內(nèi)部嚴(yán)重,而乳桿菌屬在內(nèi)部組織中的相對豐度顯著高于表面菌群;此外,克雷伯氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、擬普雷沃菌屬、阿克曼氏菌屬和Romboutsia屬等5個非優(yōu)勢菌屬的細菌在雞肉內(nèi)部組織中的相對豐度顯著高于表面。冷鮮雞不同部位的細菌菌群增殖趨勢分析結(jié)果表明,雞肉表面細菌在冷藏3 d 后僅有與腐敗相關(guān)的優(yōu)勢菌屬假單胞菌的豐度顯著升高,另有弓形桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、黃桿菌屬、慢生根瘤菌、lachnoclostridium屬和Romboutsia屬等7個屬的細菌的豐度顯著降低;雞肉內(nèi)部菌群中,與腐敗相關(guān)的假單胞菌和環(huán)絲菌屬顯著增殖,僅有Romboutsia屬1個菌屬顯著降低。

綜上,冷鮮雞肉產(chǎn)品表面和內(nèi)部組織中細菌菌群的結(jié)構(gòu)及增殖趨勢存在差異,在研究和監(jiān)測中,應(yīng)根據(jù)目標(biāo)菌的污染來源而對雞肉產(chǎn)品的表面或內(nèi)部肌肉組織加以區(qū)分采樣。