張 毅， 馮康倪， 陳鑒濤， 梁孟亞

（中山大學附屬第一醫(yī)院心臟外科，廣東廣州510080）

腦卒中（stroke）是導致成年人殘疾和死亡的第二大病因，缺血性腦卒中約占所有腦卒中病例的87%［1］，成為了現(xiàn)代社會健康和生活質(zhì)量的主要威脅。缺血性腦卒中（ischemic stroke）由于腦血流量嚴重減少，腦組織缺乏血液和氧氣供應(yīng)，最終導致神經(jīng)元細胞死亡和腦梗死［2］。目前臨床上常用的治療缺血性腦卒中的方法是及時恢復大腦的血液供應(yīng)，然而部分病人恢復大腦血供后不僅不能減輕腦缺血引發(fā)的神經(jīng)功能障礙，反而加重腦缺血癥狀，表現(xiàn)出復雜的病理生理變化，即發(fā)生腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）。大腦血液的中斷能夠激活小膠質(zhì)細胞等炎癥細胞以及促使其釋放炎癥因子，誘導組織炎癥反應(yīng)，破壞細胞內(nèi)蛋白和細胞膜。此外，無氧代謝成為了缺血性腦卒中過程中細胞ATP 合成的重要來源，提高了細胞內(nèi)自由基水平和誘發(fā)細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，加之由于缺血造成了細胞外微環(huán)境的改變，激活細胞的自噬反應(yīng)。腦組織發(fā)生缺血缺氧、炎癥、氧化應(yīng)激和自噬反應(yīng)均能極大地促進細胞的凋亡和壞死，而大腦血管內(nèi)皮細胞的過度凋亡可使血腦屏障的通透性增加，提高腦缺血性腦卒中后腦水腫和繼發(fā)性神經(jīng)功能損傷的發(fā)生率。然而，隨后大腦血液的恢復則可能進一步加重上述病理損傷機制。因此，CIRI 的病理過程主要包括細胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、自噬、血腦屏障破壞等，并最終導致大腦神經(jīng)元大量死亡和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙［3］。目前對缺血性腦卒中的治療主要受到幾種因素的限制，包括缺血后腦損傷的快速發(fā)展、細胞信號通路之間的復雜相互作用以及較窄的治療窗口［4］。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）廣泛存在于細胞核和細胞質(zhì)中［5］，參與RNA 轉(zhuǎn)錄、翻譯、剪接、細胞內(nèi)外轉(zhuǎn)運等多種生物學過程［6］。微小RNA（mi?croRNA，miRNA，miR）已被證明在炎癥性疾病、腫瘤性疾病和心腦血管疾病的發(fā)病機制中起著重要作用［7］。隨著對缺血再灌注損傷重視程度的提高和研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)包括lncRNA 與miRNA在內(nèi)的非編碼RNA 在缺血再灌注損傷的機制中發(fā)揮重要作用。已有研究報道大鼠大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型血清中l(wèi)ncRNA 的水平存在顯著差異［8］，此外在腦卒中患者血液中，根據(jù)腦卒中亞型分類的不同，miRNA 的表達也存在顯著差異［9］，提示了lncRNA 和miRNA可能參與腦卒中的發(fā)生發(fā)展過程，但詳細的作用機制仍需進一步深入研究。本文主要就非編碼RNA在CIRI 中的相關(guān)分子機制作一綜述，旨在為CIRI的機制研究提供新思路。

1 非編碼RNA概述

全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association studies，GWAS）顯示，在人類基因組中，約有98%以上的基因組被轉(zhuǎn)錄，但能夠編碼蛋白質(zhì)的基因僅占總基因組的約3%，絕大多數(shù)基因沒有編碼潛力。人們以往將大量非編碼蛋白質(zhì)的基因稱為“噪音”或“垃圾“DNA，然而越來越多的研究表明，這種非編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本有很大一部分能夠作為RNA 分子，在細胞分子層面發(fā)揮重要的作用。非編碼RNA 可以分為小非編碼RNA（＜200 nt），即miRNA、轉(zhuǎn)移RNA（transfer RNA）和小核仁RNA（small nucleolar RNA），以及較長的非編碼RNA（＞200 nt），包括核糖體RNA（ribosomal RNA）、天然反義轉(zhuǎn)錄本（natural antisense transcripts）和lncRNA［10］。其中l(wèi)ncRNA 與miRNA 被認為是執(zhí)行功能最為重要及研究較多的兩類非編碼RNA。

lncRNA 是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA。目前研究認為，lncRNA 可以通過各種分子機制在多種生物學過程中擔任重要角色，如細胞周期、細胞增殖、凋亡和分化等［11］。lncRNA 能在不同水平上干擾基因的表達，如表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控［12］。在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控階段，lncRNA 主要有以下幾種功 能：（1）lncRNA 結(jié) 合 前體 信使RNA（premRNA），干擾RNA 剪接體與目標序列的結(jié)合，從而導致剪接變異體的形成；（2）lncRNA 能夠直接結(jié)合mRNA 并影響其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和翻譯過程；（3）作為miRNA 的 宿主基因，控制著miRNA 的形成；（4）lncRNA 含有與某些miRNA 的互補結(jié)合位點，能夠直接結(jié)合目標miRNA。因此，lncRNA 可以作為“分子海綿”“吸附”一些特定的miRNA，消除其對下游目標mRNA 的抑制作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)了lncRNA 能夠作為mRNA 的競爭性內(nèi)源RNA（competitive en?dogenous RNA，ceRNA），調(diào)控細胞內(nèi)多種分子機制過程。

miRNA 是一類普遍存在的、保守的、內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，長度通常為19～25 個核苷酸，可通過互補序列特異性識別目標靶向mRNA 的3'-非翻譯區(qū)域（untranslated region，UTR）以及引導RNA 誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）與靶向mRNA 結(jié)合，促進mRNA 降解和翻譯抑制，在基因的轉(zhuǎn)錄后階段充當調(diào)控因子［2，13］。據(jù)報道，miRNA 參與了許多生物學事件，包括細胞增殖、分化、凋亡、激素分泌和個體發(fā)育［14］。多項研究顯示，通過合成miRNA 模擬物或者抑制劑寡核苷酸改變miRNA 的水平，在實驗細胞和動物模型中能顯著減輕CIRI［15］，提示miRNA 干預可能在CIRI 中有很好的神經(jīng)保護作用。然而miRNA 在CIRI 中的具體作用機制仍需進一步闡明。

2 在CIRI中非編碼RNA對細胞凋亡的作用

細胞凋亡是由基因控制的程序性細胞死亡（pro?grammed cell death，PCD），在正常細胞周轉(zhuǎn)、免疫系統(tǒng)發(fā)育和功能、胚胎發(fā)育和化學誘導的細胞死亡中起著至關(guān)重要的作用，然而細胞凋亡不足可引起自身免疫疾病或癌癥［16］，腦缺血再灌注后細胞凋亡加速則可引起大腦繼發(fā)性缺血性損傷或神經(jīng)退行性病變。

2.1 lncRNA 在細胞凋亡中的作用 Tian 等［17］在體外氧-葡萄糖剝奪/再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）細胞模型研究發(fā)現(xiàn)，OGD 后細胞中l(wèi)ncRNA NR_120420 的表達顯著升高，促進了細胞的凋亡，敲除NR_120420 后核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65蛋白的磷酸化顯著降低，細胞凋亡率顯著下降，初步證明lncRNA NR_120420 的升高與CIRI 后細胞凋亡的加重密切相關(guān)。Xu 等［18］發(fā)現(xiàn)lncRNA CAMK2D 相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（CAMK2D-associ?ated transcript 1，C2DAT1）通過上調(diào)鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶IIδ（calcium/calmodulin-dependent pro?tein kinase II δ，CaMKIIδ）水平以及促進NF-κB 抑制劑激酶α/β（inhibitor of NF-κB kinase α/β，IKKα/β）磷酸化，降低了缺氧誘導的神經(jīng)細胞死亡。Yan等［19］在體內(nèi)外缺血再灌注模型中均發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3的表達上調(diào)，敲除MEG3 后細胞凋亡率降低。進一步的研究表明，MEG3 過表達激活了p53 的轉(zhuǎn)錄活性，促進了神經(jīng)元的死亡。此外，亦有研究報道在大鼠腦缺血再灌注模型中l(wèi)ncRNA MEG3 可能通過WNT/β-catenin 信號通路負調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）水平，提高神經(jīng)元的死亡率［20］。

除了調(diào)節(jié)下游靶點調(diào)節(jié)細胞的凋亡，lncRNA 也能通過調(diào)節(jié)miRNA 參與細胞的凋亡。Zhong 等［21］的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAINK4基因座中反義非編碼RNA（antisense noncoding RNA in theINK4locus，ANRIL）可以通過直接負調(diào)控miR-199a-5p 來提高陷窩蛋白1（caveolin-1，CAV-1）的表達，進而激活MEK和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated ki?nase，ERK）磷酸化，促進OGD 誘導的N2a（Neuro-2a）細胞的抗凋亡作用。此外，Liu 等［22］報道ANRIL能夠直接抑制miR-127 水平，促進了髓系細胞白血病1（myeloid cell leukemia-1，MCL-1）基因的表達，增加細胞活力和減少細胞的凋亡。Gao 等［23］的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA GAS5 在體內(nèi)深低溫停循環(huán)（deep hy?pothermic circulatory arrest，DHCA）大鼠模型中高表達，通過“分子海綿”機制直接結(jié)合并下調(diào)了miR-23a的表達，從而提高了PTEN 和Bax 蛋白的水平，降低了Bcl-2 和蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）磷酸化水 平，誘 導 細 胞 的 凋 亡。Wei 等［24］報 道lncRNA AK038897 能 作為miR-26a-5p 的ceRNA，抑制miR-26a-5p 表達，提高下游靶向mRNA DAPK1 的表達水平，加重腦缺血再灌注后神經(jīng)元的死亡和神經(jīng)功能障礙。

2.2 miRNA 在細胞凋亡中的作用 彭志鋒等［25］利用體外OGD/R 細胞模型研究發(fā)現(xiàn)，miR-181b過表達能夠靶向抑制自噬相關(guān)蛋白5（autophagy-related protein 5，Atg5）的表達，顯著提高了神經(jīng)元的凋亡率，而miR-181b 拮抗劑則能夠顯著上調(diào)Atg5 的表達水平，減輕神經(jīng)元凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。Chen 等［26］發(fā)現(xiàn)，miR-1306-5p 在體外OGD/R 模型中表達下調(diào)，而過表達miR-1306-5p可以抑制胱天蛋白酶3（caspase-3）激活和細胞凋亡，顯著提高細胞活力。雙重熒光素酶報告實驗證明，miR-1306-5p 與BIK（Bcl-2-interacting killer）的mRNA 直接結(jié)合。提高BIK 的表達能夠增加乳酸脫氫酶（lactate dehydro?genase，LDH）的釋放，提高caspase-3 的活性，從而逆轉(zhuǎn)miR-1306-5p 對OGD/R 處理的保護作用。Fang等［27利用缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-128能夠負調(diào)節(jié)靶向Wnt1 mRNA，提高Bcl-2、降低Bax的水平，從而減輕腦組織損傷程度并提高小鼠的學習 和 記 憶 能力］。Yao 等［28］在SH-SY5Y 細 胞系 的OGD/R 模型中觀察到BCL2L14基因的表達上調(diào)；BCL2L14是Bcl-2 家族的促凋亡成員，敲除BCL2L14降低了細胞的死亡率；進一步研究證實BCL2L14是miR-496 的潛在靶點，miR-496 通過直接下調(diào)BCL2L14來抑制細胞凋亡，在CIRI中發(fā)揮保護作用。因此，lncRNA 和miRNA 能夠通過調(diào)控下游目標靶點參與腦缺血再灌注后細胞凋亡的機制。

3 在CIRI中非編碼RNA對炎癥損傷的作用

在正常情況下，炎癥是一種對抗入侵的病原體，恢復受損的細胞，并保護組織健康的細胞分子過程［29］。然而，在腦IR 的病理條件下，過度的炎癥反應(yīng)可能會激活小膠質(zhì)細胞、趨化白細胞、釋放炎癥因子以及發(fā)生腦水腫，從而加重大腦神經(jīng)功能損傷。

3.1 lncRNA 在炎癥中的作用 Feng 等［30］通過臨床上對急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）患者和非AIS 患者的研究發(fā)現(xiàn)，AIS 患者中l(wèi)n?cRNA ANRIL 的表達低于對照組；使用美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（the National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）評估后發(fā)現(xiàn)，ANRIL 的表達與AIS 患者的疾病嚴重程度呈負相關(guān)；ANRIL 的表達與 超 敏C 反 應(yīng) 蛋白（hypersensitive C-reactive pro?tein，HSCRP）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis fac?tor α，TNF-α）和白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）的水平呈負相關(guān)，而與IL-10 的水平呈正相關(guān)關(guān)系，這些結(jié)果表明lncRNA ANRIL 作為一種抗炎基因參與AIS 的進展，其表達水平的下調(diào)與AIS 患者腦卒中風險增加、疾病嚴重程度升高和炎癥升高有關(guān)。Zhang 等［31］在大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞（brain micro?vascular endothelial cells，BMECs）的OGD 模型中發(fā)現(xiàn)，lncRNA 人肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）的表達是下降的；進一步的研究證實，MALAT1 能夠通過抑制促炎癥因子IL-6、單核細胞趨 化 蛋 白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）和E-選擇素（E-selectin）的表達發(fā)揮抗炎癥作用。此外，Qi 等［32］的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 小核仁RNA 管 家基 因14（small nucleolar RNA host gene 14，SNHG14）通過抑制miR-145-5p，提高靶向胞漿磷脂酶A2 組4A（cytosolic phospholipase A2 group IVA，PLA2G4A）mRNA 的水平，從而激活小膠質(zhì)細胞釋放TNF-α、NO 等促炎癥因子，引發(fā)更為嚴重的神經(jīng)功能損害。

3.2 miRNA 在炎癥中的作用 Tian 等［33］在大鼠MCAO 和OGD/R 模型中發(fā)現(xiàn)miR-216a 的表達下調(diào)，進一步研究證實，過表達miR-216a 可以減少靶基因Janus 酪氨酸激酶2（Janus tyrosine kinase 2，JAK2）和下游信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal trans?ducer and activator of transcription 3，STAT3）的磷酸化水平，抑制炎癥相關(guān)酶如誘導型一氧化氮合酶（in?ducible nitric oxide synthase，iNOS）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）和細胞因子TNF-α 和IL-1β 的釋放，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。Feng等［34］的研究發(fā)現(xiàn)，在抑制miR-301a的表達之后，大鼠神經(jīng)功能評分和腦梗死體積顯著降低，提示下調(diào)miR-301a 可能在腦IR 損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。隨后研究證實，抑制miR-301a 能夠上調(diào)靶基因NDRG2 的水平，從而抑制NF-κB，下調(diào)促炎癥因子TNF-α、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、IL-6 和IL-1β的表達，發(fā)揮抗炎癥反應(yīng)。亦有研究報道m(xù)iR-199a-5p通過下調(diào)DDR1基因的表達，降低NF-κb和下游促炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 的水平［35］。在體外OGD/R 模型中研究發(fā)現(xiàn)miR-127 水平顯著升高，阻止了SIRT1 的mRNA 表達，降低AMP 活化蛋白激酶α（AMP-activated protein kinase α，AMPK-α）磷酸化，提高神經(jīng)元p65 蛋白磷酸化水平，增強了神經(jīng)元的炎癥反應(yīng)［36］。一些研究報道在體內(nèi)和體外缺氧模型中，miR-145和miR-216a的表達均下調(diào)，從而提高了下游靶基因Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）的轉(zhuǎn)錄和表達，經(jīng)過NF-κB通路促進促炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 的釋放［37-38］。上述結(jié)果表明，lncRNA 和miRNA 均能在腦IR 后的炎癥反應(yīng)機制中發(fā)揮重要作用。

4 在CIRI中非編碼RNA對氧化應(yīng)激的作用

氧化應(yīng)激是由于機體內(nèi)產(chǎn)生氧自由基相關(guān)酶系統(tǒng)和清除自由基相關(guān)酶系統(tǒng)之間的不平衡而引發(fā)的一系列生物學事件。研究發(fā)現(xiàn)，局灶性腦缺血再灌注過程中產(chǎn)生的活性氧簇（reactive oxygen spe?cies，ROS）可直接對腦細胞中的DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和其他大分子造成損傷［39］。最近，越來越多的證據(jù)表明氧化應(yīng)激在腦水腫、炎癥和凋亡的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，并促進CIRI 后繼發(fā)性神經(jīng)功能缺損。

4.1 lncRNA 在氧化應(yīng)激中的作用 Yao 等［40］發(fā)現(xiàn)大鼠缺血再灌注后腦組織中l(wèi)ncRNA RIAN 的表達顯著降低，而在體外OGD 處理的N2a 細胞中miR-144-3p 的表達升高，通過RNA 免疫沉淀和RT-qPCR 證實了RIAN 能夠直接結(jié)合miR-144-3p。進一步研究表明，miR-144-3p通過負調(diào)控GATA3基因，提高細胞中Bax、caspase-3、ROS 以及降低Bcl-2 的水平，誘導氧化應(yīng)激反應(yīng)和細胞的凋亡；而過表達RIAN 和GATA3 均能減輕miR-144-3p 誘導的細胞氧化應(yīng)激以及降低細胞凋亡率，因此RIAN可能作為ceRNA吸附結(jié)合miR-144-3p，上調(diào)GATA3 的表達，延緩CIRI的進展。如前所述，RIAN/miR-144-3p/GATA3 信號可能是一種新的、潛在有效的CIRI治療方法。然而，目前對于lncRNA 在神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激中的作用機制仍需進一步闡明。

4.2 miRNA在氧化應(yīng)激中的作用 Zhang等［41］在體外OGD/R 細胞中研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF15 基因能夠誘導糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase3β，GSK-3β）表達失活，提高核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）表達和激活Nrf2/抗氧化反應(yīng)原件（antioxidant response element，ARE）信號通路，減輕ROS的產(chǎn)生，減緩氧化應(yīng)激反應(yīng)和減少神經(jīng)元凋亡。進一步的研究表明，miR-302b-3p 作為FGF15 的上游miRNA，負向調(diào)節(jié)FGF15，干擾FGF15對神經(jīng)元的積極保護作用。亦有研究發(fā)現(xiàn)miR-29能夠靶向抑制KEAP1（Kelch-like ECH-associated protein 1）的表達水平，提高Nrf2的表達，從而抑制細胞內(nèi)ROS 水平發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用［42］。Huang 等［43］利用H2O2誘導B35 細胞氧化損傷模型研究發(fā)現(xiàn)，miR-34b亦可通過下調(diào)KEAP1的表達，激活下游Nrf2信號蛋白的表達，影響NO、3-硝基酪氨酸（3-nitroty?rosine，3-NT）、超 氧 化 物 歧 化 酶（superoxide dis?mutase，SOD）和錳超氧化物歧化酶（manganese su?peroxide dismutase，MnSOD）水平，改善H2O2誘導的氧化應(yīng)激損傷。然而，Liang 等［44］發(fā)現(xiàn)，OGD/R 處理的PC12 細胞中miR-125b 的表達顯著升高；miR-125b 通過下調(diào)CH2α，誘導NADPH 氧化酶（NADPH oxidase，NOX）2 和NOX4 活化，提高ROS 水平，促進了細胞凋亡。

5 在CIRI中非編碼RNA對自噬的作用

自噬是細胞在應(yīng)激或者缺乏營養(yǎng)的狀態(tài)下進行自我分解的過程［45］。作為一種溶酶體依賴的降解途徑，自噬廣泛存在于細胞正常的生理過程中，通過降解衰老、損傷細胞器維持細胞穩(wěn)態(tài)以及通過吞噬細胞內(nèi)微生物病原體行使天然免疫功能，然而自噬過度或自噬不足都可能導致細胞死亡（II 型PCD）［46］。事實上，細胞自噬功能障礙參與了多種疾病的發(fā)生機制，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷［47］。目前研究發(fā)現(xiàn)，抑制自噬可以減輕或加重腦損傷，但人們對于自噬在腦IR損傷中的具體機制還未十分清楚。

5.1 lncRNA 在細胞自噬中的作用 Li 等［48］研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1通過負調(diào)控miR-26b的表達和功能，參與OGD/R 條件下BMECs 的自噬過程。在缺氧條件下，miR-26b 的過表達抑制BMECs 的自噬和提高其凋亡率，而MALAT1則逆轉(zhuǎn)了miR-26b的消極作用。以往的研究報道ULK2 參與了由mTOR 啟動以及自噬相關(guān)基因（autophagy-related genes，ATG）相關(guān)的自噬過程［49］。在此研究中研究者發(fā)現(xiàn)BMECs 中ULK2的轉(zhuǎn)錄和表達升高，雙重熒光素酶報告實驗證實了ULK2 是miR-26b 的直接靶點，因此該研究提示MALAT1/miR-26b/ULK2調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能參與了細胞的自噬過程。然而，Guo 等［50］的研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)外缺血再灌注模型中MALAT1 的表達顯著升高，過表達MALAT1 負向調(diào)控miR-30a 的功能，減弱了miR-30a對其靶向mRNA beclin-1 的抑制作用，提高了beclin-1依賴的自噬過程，促進神經(jīng)元死亡和加重缺血性腦梗死。而下調(diào)MALAT1 的水平通過miR-30a抑制be?clin-1依賴的自噬途徑，減輕神經(jīng)元細胞死亡。

5.2 miRNA 在細胞自噬中的作用 Sun 等［51］的研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-298 抑制了NF-κB 激活因子1（NF-κB activator 1，Act1）的表達，增加了下游c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和Bcl-2 的 磷 酸 化 及beclin-1 的 水 平，降 低 了NF-κB 和mTOR的磷酸化水平，而NF-κB的磷酸化可以通過調(diào)節(jié)mTOR 信號通路抑制自噬，因此過表達miR-298可能通過直接調(diào)節(jié)Act1/JNK/NF-κB 通路，激活細胞的自噬過程，促進了缺血性腦卒中后的神經(jīng)元死亡。該團隊的另一研究報道，miR-215 可以通過抑制Act1 蛋白的表達發(fā)揮神經(jīng)保護作用，在大鼠MCAO模型中，miR-215的表達顯著下降，伴隨著Act1、白細胞介 素17 受 體A（interleukin-17 receptor A，IL-17RA）、JNK、p-Bcl-2 和beclin-1 水平的增加，導致自噬過程被激活。這些結(jié)果表明miR-215 通過負調(diào)節(jié)Act1/IL-17RA 和 抑 制JNK/p-Bcl-2/beclin-1 通 路 來 抑制自噬［52］。此外，在CIRI 后，大鼠腦海馬CA1 區(qū)的miR-138 表達下 調(diào)，其 下游SIRT1 的mRNA 表 達上調(diào)，導致beclin-1 和LC3-II 的水平升高，從而激活細胞的自噬過程，發(fā)揮其神經(jīng)保護作用［53］。因此，雖然已有研究表明lncRNA 和miRNA 均能夠參與細胞自噬過程，但其在CIRI 中的作用機制仍存在較大的爭議。

6 miRNA在血腦屏障中的作用

血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）是由具有緊密連接（tight junction，TJ）結(jié)構(gòu)的大腦血管內(nèi)皮細胞構(gòu)成。TJ蛋白破壞、內(nèi)皮細胞死亡、TJ蛋白與細胞骨架偶聯(lián)減少，都可能破壞血腦屏障的完整性，促使大量的炎癥因子進入缺血損傷區(qū)，加重細胞的死亡和大腦神經(jīng)功能障礙［54］。

Wu 等［55］通過共培養(yǎng)大鼠BMECs 和星形膠質(zhì)細胞在體外建立了模擬BBB 模型，研究發(fā)現(xiàn)miR-9-5p的上調(diào)可以減輕大鼠BBB 損傷和炎癥反應(yīng)。過表達miR-9-5p 通過下調(diào)PTCH-1 來提高血腦屏障緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白ZO-1、occludin 和claudin 5 水平。此外，過表達miR-9-5p通過激活Hedgehog 通路促進NF-κB和Akt/GSK3β 通路，降低細胞中MMP-9、IL-1β、IL-6和TNF-α 的水平，從而降低BMECs 的凋亡和BBB 的通透性。亦有研究報道，miR-539 能夠抑制MMP-9基因的表達，提高血腦屏障的通透性［56］。Armulik等［57］的研究發(fā)現(xiàn)，MCAO 大鼠的大腦缺血邊界區(qū)（ischemic boundary zone，IBZ）中miR-149-5p 的表達降低，而S1PR2 的表達顯著增加。周細胞能夠促進內(nèi)皮細胞之間緊密連接，其與BMECs 的相互支持對于血腦屏障的形成和維持維持血腦屏障的完整性至關(guān)重要。進一步研究發(fā)現(xiàn)，血管周細胞中的S1PR2的升高能夠誘導周細胞的遷移和抑制N-鈣黏附蛋白（N-cadherin）的表達，從而導致BBB 通透性升高。隨后研究證實S1PR2 是miR-149-5p 的直接靶點，過表達miR-149-5p 可顯著抑制周細胞遷移，增加N-cad?herin 的表達，改善缺血性腦卒中后BBB 的通透性［58］。

7 在CIRI中非編碼RNA對血管生成的作用

血管生成是指在已有的毛細血管基礎(chǔ)上形成的新的血管，在大腦發(fā)生缺血缺氧性損傷后，血管生成可為大腦提供血液營養(yǎng)和氧氣，減輕腦缺血缺氧狀態(tài)，從而加速大腦損傷組織的恢復，最終促進神經(jīng)功能的恢復［59］。因此，促進血管生成可作為治療缺血性腦卒中的一種可靠的臨床策略。

7.1 lncRNA 在血管生成中的作用 Liu 等［60］的研究報道，大鼠MCAO 模型后lncRNA MEG3 的表達下調(diào)，刺激Notch 和Notch 通路靶基因HES-1 和HEY-1的表達，促進了血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和血管形成，而過表達lncRNA MEG3 則抑制了上述過程，延緩了腦卒中后神經(jīng)功能的恢復。Wang 等［61］發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG1 通過下調(diào)miR-199a 來提高低氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達，促進了血管形成；在體外OGD/R條件下，過表達lncRNA SNHG1 促進了BMECs 的增殖遷移和毛細血管管腔樣結(jié)構(gòu)的形成，這闡明了SNHG1在OGD 損傷后血管形成的作用和機制。Zhou 等［62］在體外實驗中研究表明，lncRNA NEAT1 可直接靶向下調(diào)miR-377 的表達，提高BMECs 的活力和血管生成；miR-377通過下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子A（vascu?lar endothelial growth factor A，VEGFA）、SIRT1和bclxl基因的表達，從而抑制OGD 后BMECs 的細胞活力，而NEAT1 則抵消了miR-377 的抑制作用，因此，lncRNA NEAT1 可能作為一種ceRNA 參與腦缺血損傷的過程。

7.2 miRNA 在血管生成中的作用 Du 等［63］發(fā)現(xiàn)AIS 患者血漿中miR-191 的水平升高，隨后在體內(nèi)和體外OGD/R研究中證實了這一觀點。在人臍靜脈內(nèi)皮 細 胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中過表達的miR-191 直接抑制Vezf1，導致Vezf1靶向的包括內(nèi)皮素1（endothelin 1，EDN1）、MMP1 和STMN1（stathmin 1）在內(nèi)的血管生成相關(guān)基因的表達下調(diào)，影響HUVECs 的增殖、遷移和血管形成。Liang 等［64］研究團隊證實在體外OGD/R 模型中，miR-26a 高表達通過PI3K/AKT 和MAPK/ERK 信號通路調(diào)節(jié)HIF-lα 和VEGF 的表達，促進了BMECs的增殖和管腔形成。Qu 等［65］發(fā)現(xiàn)在大鼠MCAO 后，過表達miRNA-126有助于大腦血管形成和神經(jīng)功能的恢復。隨后體外實驗證實，過表達miRNA-126 通過下調(diào)PTPN9 及激活AKT 和ERK 通路，提高了HUVECs 的增殖、遷移和管腔形成。除此之外，miR-126 還增加了血管長度和血管直徑，提示miR-126 有利于促進血管重塑，對缺血性腦卒中的治療和神經(jīng)功能的整體恢復具有重要的生物學意義。

如前所述，lncRNA 和miRNA 均參與了大腦缺血損傷后血管生成的一系列機制過程，為臨床上通過促進血管生成來改善損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的恢復提供了一定的理論基礎(chǔ)。

8 總結(jié)與展望

綜上所述，越來越多的研究證實了以lncRNA 和miRNA 為代表的非編碼RNA 在CIRI 中所扮演的角色和其重要的功能。lncRNA 和miRNA 通過調(diào)控下游靶分子的表達，參與了腦IR 損傷中的細胞凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激、自噬、血管生成等生物學過程（表1）。

然而，由于lncRNA和miRNA結(jié)構(gòu)和功能的多樣性、時間空間上的多態(tài)性以及在物種之間的保守性差，阻礙了人們探索其詳細的生物學作用機制和功能，因此目前人們對于lncRNA和miRNA在缺血性腦卒中的具體作用機制尚未完全清楚。隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展，未來將會識別出更多的與腦缺血損傷相關(guān)的lncRNA 和miRNA，闡明它們之間的相互作用機制，將有助于今后為缺血性腦卒中提供新的診斷依據(jù)、防治方法和判斷預后提供新的理論數(shù)據(jù)支持。因此，lncRNA 和miRNA 未來有望成為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的診治的特異性標志物和新藥作用靶點，具有廣闊的應(yīng)用前景。

表1 參與腦缺血再灌注損傷病理機制的lncRNAs和miRNAsTable 1. The lncRNAs and miRNAs involved in the pathogene?sis of cerebral ischemia-reperfusion injury