陸 英， 袁 青， 鄺麗華， 趙才翰， 張祥忠

（中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 1輸血科，2血液科，廣東廣州510630）

血小板輸注用于預(yù)防和治療因血小板數(shù)量減少或者功能異常導(dǎo)致的出血，是臨床上挽救生命的重要治療手段之一。目前血小板普遍采用在血小板震蕩儀于室溫（20～24℃）中保存，保存期為3～7 d 不等，我國血小板的室溫保存期為5 d［1］。由于血小板的保存時間短，因此臨床上時常存在血小板供不應(yīng)求的情況。那么如何延長血小板的保存期是大家長期以來研究的科學(xué)問題。4℃和冷凍保存法是研究比較多的2種方法［2-4］。

比較不同溫度儲存血小板功能的實驗，比如體外灌注法研究血小板血栓的形成［5］，實時觀察血小板在體內(nèi)止血過程等［6］，通常需要先用熒光標記物標記好血小板，然后再在熒光顯微鏡下觀察并拍攝圖像，最終通過計算機分析圖像的熒光強度來比較不同溫度儲存下血小板功能的差異。由于熒光強度是分析結(jié)果的依據(jù)，因此必須保證實驗所用的熒光標記物對不同溫度下保存的血小板具有相似的標記效果。本研究比較5-氯甲基熒光素二乙酸酯（5-chloromethylfluorescein diacetate，CMDFA）、碘代3，3'-二己氧基羰花青［3，3′-dihexyloxacarbocyanine io?dide，DiOC6（3）］及抗血小板膜糖蛋白（glycoprotein，GP）Ibβ抗體衍生物（anti-GPIbβ derivative）標記不同溫度下儲存的血小板的效果，以期找出一種受溫度因素影響較小的血小板熒光標記物。

材料和方法

1 試劑

Annexin V-Alexa Fluor 647 購自Biolegend；兔抗小鼠CD62P抗體購自BD；Cell TrackerTMCMFDA Dye購 自Thermo Fisher Scientific；DiOC6（3）Dye 購 自AAT Bioquest；抗GPIbβ抗體衍生物購自Emfret。

2 血小板的獲取和保存

C57 小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。眼眶靜脈取血法獲取15 只C57 小鼠的全血，300 ×g 離心7 min，分離出上層的富血小板血漿，計數(shù)血小板，調(diào)整血小板濃度為1×1012/L。室溫組置于20～24℃的血小板震蕩儀保存，震蕩的速率為每分鐘60次。4℃組置于4℃冰箱（無震蕩）保存。冷凍組血小板加入6%的DMSO 置于-80℃冰箱保存。3 組血小板保存24 h后用于染色實驗。

3 實驗方法

3.1 血小板凋亡和活化率的檢測 冷凍組血小板在37℃水浴箱中解凍。室溫和4℃存儲的血小板及解凍后的血小板采用800×g 離心8 min，去上清，用PIPES 緩沖液重懸。分別從3 組中取適量血小板加入200 μL 的PIPES 液，使血小板的終濃度為1×109/L，加入Annexin V 或者抗CD62P 抗體，孵育20 min，置于流式細胞儀（BD，LSR FortessaX-20）上機檢測

3.2 CMFDA、DiOC6（3）及抗GPIbβ抗體衍生物對血小板染色效果的檢測 PIPES 液重懸的每組血小板各分為3 等份，分別加入CMFDA、DiOC6（3）及抗GPIbβ 抗體衍生物染色，使終濃度分別為5 μmol/L、2 μmol/L 和2 μmol/L。染色30 min 后離心、洗滌，從各組血小板取適量用PIPES 液重懸，使血小板濃度為1×109/L，于流式細胞儀上機檢測。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)分析采用軟件SPSS 17.0 完成。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（mean±SD）進行描述，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行多組間比較，并用Bonferron 法進行多重比較。假設(shè)檢驗均為雙側(cè)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CMFDA和DiOC6（3）的對血小板的標記效果

CMFDA 對室溫、4℃和冷凍血小板的標記陽性率 分 別 為（97.67±1.56）% 、（98.33±1.85）% 和（69.43±6.35）%，DiOC6（3）的陽性率則分別為（98.67±1.53）%、（99.40±0.53）%和（83.63±10.01）%；室溫、4℃和冷凍血小板CMFDA 的平均熒光強度（mean flu?orescence intensity，MFI）分別為8 405±1 350、8 342±1 256 和1 398±167，DiOC6（3）的MFI 則 分 別 為45 346±3 766、43 999±3 229 和5 187±201，見圖1。與前兩組相比，冷凍血小板CMFDA 和DiOC6（3）染色的陽性率及MFI 均顯著降低（P＜0.05），表明CMFDA和DiOC6（3）對冷凍血小板的標記效果差于室溫組和4℃組。

2 室溫、4℃和冷凍血小板的凋亡以及活化率

室溫、4℃和冷凍組血小板凋亡率分別為（2.463±1.320）% 、（2.317±1.412）% 和（54.700±9.042）%，與前兩組相比，冷凍組血小板的凋亡率顯著增加（P＜0.01）；3 組血小板CD62P 的陽性率分別為（8.158±3.582）%、（8.070±4.478）%和（31.950±12.380）%，冷凍組血小板CD62P 的陽性率大于室溫和4℃組（P＜0.01）。3 組血小板CD62P 的MFI 則分別為298±10.75、294.3±14.64 和428.8±45.07，冷凍血小板CD62P 的MFI 明顯大于前兩者（P＜0.01），見圖2。上述結(jié)果表明，冷凍血小板的凋亡和活化率顯著高于室溫和4℃組。

Figure 1. Positive percentage and mean fluorescence intensity（MFI）of CMFDA and DiOC6（3）in the platelets preserved in room temperature（RT），4℃and frozen state. A：positive percentage of CMFDA；B：positive percentage of DiOC6（3）；C：MFI of CMFDA and DiOC6（3）. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs frozen group.圖1 CMFDA和DiOC6（3）對室溫、4℃和冷凍血小板標記的陽性率和MFI的比較

3 抗GPIbβ抗體衍生物的標記效果

抗GPIbβ 抗體衍生物對室溫、4℃和冷凍血小板標 記 的 陽 性 率 分 別 為（95.30±3.23）%、（95.30±3.28）%和（95.17±3.45）%；MFI 則分別為5 247±423、4 938±785和4 867±662，3組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05），見圖3。上述結(jié)果表明，抗GPIbβ抗體衍生物對3組血小板的標記效果相似。

討 論

22℃震蕩保存是目前臨床上普遍應(yīng)用的血小板保存方法，然而其保存期只有幾天。為延長保存期，許多實驗致力于4℃和冷凍血小板存儲的研究。血小板在儲存過程中會出現(xiàn)血小板儲存損傷（platelet storage lesion，PSL），表現(xiàn)為細胞形態(tài)改變、細胞表面抗原減少、細胞器功能受損、細胞內(nèi)代謝水平變化等［7-8］。不同儲存溫度下血小板的PSL 程度不一，凋亡和活化是血小板PSL 的重要表現(xiàn)，血小板內(nèi)部的一些細胞器例如線粒體、各種酶類的功能會隨著凋亡和活化程度的增加而降低。

在比較不同溫度保存的血小板的止血功能時，最好的途徑是能實時觀察血小板在體內(nèi)的止血過程。而臨床上往往只是通過觀察患者出血情況的變化來判斷止血功能的，很難實時觀察患者體內(nèi)的止血過程，因此目前研究血小板體內(nèi)止血的實驗主要在動物體內(nèi)實施［6］，此研究需要有效的血小板的標記方法。標記血小板的最常用方法包括基因工程技術(shù)導(dǎo)入熒光基因以及熒光染料標記血小板；后者又可以分為兩類：一是血小板特異性熒光染料，即帶有熒光染料的血小板抗體，另外一類是血小板非特異性染料，包括多種熒光素，它們能與多種細胞結(jié)合。熒光基因標記法操作比較繁瑣，實驗要求較高，而且有研究表明轉(zhuǎn)染熒光基因的動物的血小板功能有不同程度的變化［9］。

Figure 2. Apoptosis and activation of platelets preserved in room temperature（RT），4℃and frozen state. A：positive percentage of Annexin V；B：positive percentage of CD62P；C：mean fluorescence intensity（MFI）of CD62P. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs frozen group.圖2 室溫、4℃和冷凍存儲下血小板凋亡和活化程度的比較

本研究試圖為室溫、4℃及冷凍存儲的血小板尋找出一種合適的熒光標記物，此標記物必須對3 種溫度保存的血小板標記效果相似，因此，血小板特異性熒光染料應(yīng)該是針對基本不受溫度影響的血小板表面抗原，而血小板非特異性染料也應(yīng)該是針對受溫度影響很小的細胞器、蛋白基團和酶類等等。本研究比較了CMDFA 和DiOC6（3）兩種血小板非特異性熒光染料和抗GPIbβ 抗體衍生物血小板特異性熒光染料的標記效果。

CMDFA 含有能與硫醇反應(yīng)的氯甲基，在細胞內(nèi)通過酶的作用轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袩晒獾奈镔|(zhì)，此產(chǎn)物能經(jīng)過細胞分裂傳遞給子細胞，但是不能轉(zhuǎn)移到相鄰細胞。CMFDA 染色細胞是目前常用的細胞評價方法，具有方便、準確、靈敏等優(yōu)點［10］。許多實驗研究用CMFDA 標記各種類型的細胞，例如果蠅精子、血小板、紅細胞、內(nèi)皮細胞、腫瘤細胞的研究［11-12］。CMFDA 無細胞毒性，不影響細胞的活力和增殖［13］。DiOC6（3）是一種陽離子親脂性熒光染料，可用于線粒體、細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和囊泡膜的熒光標記，其信號可以通過熒光顯微鏡或流式細胞術(shù)進行監(jiān)測［14］。DiOC6（3）可應(yīng)用于多種細胞的熒光標記，比如淋巴細胞、血小板和肺癌細胞，未見其相關(guān)細胞毒性的報道［15-16］。當(dāng)線粒體功能受損導(dǎo)致其線粒體膜電位降低時，細胞對DiOC6（3）的攝入就會減弱，表現(xiàn)為熒光強度降低［16］?？笹PIb 抗體衍生物是抗小鼠血小板/巨核細胞表面GPIb-V-IX 復(fù)合物上的亞單位——GPIbβ 的抗體衍生物。與一般抗GPIb 抗體相比，該抗體經(jīng)過修飾改良，能夠穩(wěn)定標記體內(nèi)循環(huán)血小板，而且在推薦劑量范圍內(nèi)，抗GPIbβ 衍生物沒有毒性，不干擾體內(nèi)血小板黏附和聚集，用于分析體內(nèi)循環(huán)血小板的功能［6，17］。

Figure 3. Positive percentage and mean fluorescence intensity（MFI）of anti-GPIbβ derivative in platelets preserved in room tempera?ture（RT），4℃and frozen state. A：positive percentage of anti-GPIbβ derivative；B：MFI of anti-GPIbβ derivative.Mean±SD. n=3.圖3 抗GPIbβ抗體衍生物對室溫、4℃和冷凍血小板標記的陽性率和MFI的比較

本研究中，熒光染料標記結(jié)果顯示CMFDA 和DiOC6（3）兩種染料對冷凍組血小板的標記效果明顯差于室溫組和4℃組。CMFDA 本身無熒光，進入細胞后可能通過一種叫谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的酶類的作用而轉(zhuǎn)變?yōu)橛袩晒獾奈镔|(zhì)，所以CMFDA 熒光的強度可以反映細胞的活力［12，18］。我們實驗結(jié)果表明冷凍血小板的CD62P 以及Annexin V 陽性率分別高達（31.95±12.38）%和（54.70±9.04）%，說明血小板活化率以及凋亡率很高［19］，這種狀態(tài)下血小板的活力大大降低，因而，其對CMFDA 的著色能力也大大降低。這與Wang 等［10］的研究的相似，他們發(fā)現(xiàn)室溫儲存的血小板，隨著保存時間的延長，血小板的凋亡以及活化率增加，CMFDA 的著色效果則逐漸降低。DiOC6（3）是主要用于線粒體染色的熒光染料，隨著凋亡程度的增加其熒光強度減弱，冷凍血小板的凋亡率很高，因此可表現(xiàn)為對DiOC6（3）的著色效果明顯低于液態(tài)保存的血小板。

血小板在活化的過程中可以出現(xiàn)多種蛋白的脫落，其中GPIbα 和GPVI 的脫落就是非常典型的例子［20］。Fong 等［21］從活化的血小板上清液中鑒定出1 048種蛋白，其中69種為帶有一個或者多個跨膜域或者一個糖基磷脂酰肌醇I 錨定的血小板膜蛋白。GPIbβ 是血小板糖蛋白GPIb 的組成亞基之一，2 個GPIbβ和1個GPIbα構(gòu)成了GPIb，有研究報道冷凍血小板表面的GPIbα 顯著減少［22］，這與冷凍血小板活化增加導(dǎo)致GPIbα 脫落有關(guān)。我們的實驗發(fā)現(xiàn)，盡管冷凍組血小板的活化率增高，抗GPIbβ 抗體衍生物對室溫、4℃和冷凍組的染色效果相似，說明溫度對血小板表面GPIbβ 的影響很小。因此，抗GPIbβ抗體衍生物可考慮作為熒光標記物應(yīng)用于比較室溫、4℃和冷凍保存血小板功能的相關(guān)實驗。