涂師運， 王 娟， 傅金鳳， 盛 鷗

（1華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州510641；2廣東省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所/農(nóng)業(yè)部南亞熱帶果樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室/廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室，廣東廣州510640）

人類胃腸道中有10～100 萬億微生物，這些微生物歸屬于9 個細菌門，其中厚壁菌門和擬桿菌門微生物占了絕大多數(shù)［1-3］。近年來，越來越多的研究證實，腸道菌群與肥胖相關疾病、心血管疾病、代謝性疾病、肝病、炎癥性腸病和結直腸癌存在聯(lián)系，并在調節(jié)胰島素敏感性、脂肪儲存和體重方面發(fā)揮關鍵作用［4-8］。在人體中，與基因相比，腸道菌群更具可塑性，其組成隨年齡和飲食等因素而變化，因此有可能通過調節(jié)腸道菌群的組成來預防和治療疾病。總的來說，腸道菌群的研究對維護人類健康具有重要意義。

由于腸道微生物數(shù)量龐大，情況復雜，因此在許多疾病中腸道微生物對疾病的驅動機制仍不清楚［9］，這對構建特定疾病的腸道菌群模型造成了阻礙。無菌鼠是進行腸道菌群研究的有效工具，無菌鼠的使用為解決該難題提供了處理方法。本文對無菌鼠（主要是無菌小鼠）在腸道菌群研究中的應用進行綜述，為相關科學研究提供參考。

1 無菌鼠的概況

1.1 無菌鼠的特點 無菌鼠是指無細菌、病毒、真菌、原生動物和其他腐生或寄生相關生命形式的鼠（大鼠或小鼠）［10］。這類鼠是在無菌條件下人工剖宮產(chǎn)獲得的子代鼠，再放在無菌隔離系統(tǒng)內用人工喂乳或無菌“奶媽”鼠代乳飼育而成［11］，其無菌性可通過需氧、厭氧糞便培養(yǎng)及糞便樣品聚合酶鏈式反應篩選16S RNA來確認［12］。

1.2 無菌鼠相對于普通動物實驗的優(yōu)勢 無菌鼠由于其自身的特殊性，可用于制造人源化小鼠或被移植特定腸道菌群，在進行特定腸道菌群特性研究、腸道菌群作用機制研究，以及功能性食品、藥品開發(fā)方面具有獨到優(yōu)勢，而普通實驗動物不具有這種優(yōu)勢。

1.3 無菌鼠實驗的要求 無菌鼠實驗自上個世紀就已經(jīng)存在。1946 年，Gustafsson 首次報道了人工飼養(yǎng)無菌鼠的情況［13］。理論上，無菌鼠模型可由任意品系鼠建立，其中較為常用的大鼠品系包括F344、Wistar 和Sprague-Dawley 等，較為常用的小鼠品系包括C57BL/6、BALB/c、Swiss Webster、Kunming 和ICR等［14］。

無菌鼠需要在無菌條件下飼養(yǎng)，最初的隔離器是由不銹鋼制成的，非常沉重、昂貴而且不靈活，如今一般采用柔性薄膜隔離器。無菌鼠的食物、水和用品都需要使用高壓滅菌鋼瓶消毒，對于熱敏性藥物以及有特定補充劑的藥物則先經(jīng)輻射殺菌，經(jīng)無菌過濾到無菌試管中，再用Clidox“霧化”后導入隔離器。在操作過程中應注意：（1）徹底地計劃實驗，防止隔離器開口影響無菌環(huán)境；（2）每周監(jiān)控隔離器，防止人員違規(guī)操作，注意手套磨損和過濾器積灰；（3）將無菌鼠菌株保存在多個隔離器中，以防隔離器受到污染；（4）不在隔離器中引入設備，不讓除高壓滅菌用品外的用品進入繁殖隔離器，避免在繁殖隔離器之間傳遞動物和材料，以保護無菌環(huán)境［15］。

2 用無菌鼠實驗研究不同生理病理狀態(tài)下的腸道菌群狀況

2.1 不同年齡腸道菌群的變化 在不同的生命周期中，腸道菌群隨著宿主生命周期的變化而變化，越來越多的人意識到腸道菌群是促進機體發(fā)育和穩(wěn)態(tài)的重要生理因素［16］。在半超級百歲老人（semi-super?centenarians）的腸道微生物群中，發(fā)現(xiàn)了特別的微生物狀態(tài)，這些人群中的健康菌落——包括Akkerman?sia、Bifidobacterium和Christensenellaceae在內的數(shù)量高于常人［17］。該研究表明，老年群體的腸道中存在優(yōu)勢菌群。

Kundu 等［18］將健康的老年（24 月齡）小鼠和年輕（5～6 月齡）小鼠的腸道微生物移植到年輕（5～6 周齡）無菌小鼠中，對比二者發(fā)現(xiàn)接受老年小鼠腸道菌群的無菌小鼠顯示出許多差異，包括海馬神經(jīng)元雙皮質醇陽性水平增加，腸道表面積增加，肝臟應激抵抗力、丁酸鹽和多倍體激素成纖維細胞生長因子21表達的增加。Fransen 等［19］將腸道菌群從年輕（11～14 周齡）或老年（18 周齡）常規(guī)飼養(yǎng)小鼠移植到年輕（12～14 周齡）無菌小鼠中，四周后處死無菌小鼠，采用流式細胞術對各組進行分析，結果表明，常規(guī)飼養(yǎng)小鼠中，相對于年輕小鼠，老年小鼠脾臟中Th2 細胞的頻率更高，并且這種Th2 細胞頻率的增加可以通過將常規(guī)飼養(yǎng)老年小鼠的腸道菌群轉移到年輕無菌小鼠來誘導，而轉移常規(guī)飼養(yǎng)年輕小鼠的腸道菌群時沒有觀察到誘導效果。STRING 數(shù)據(jù)分析顯示，與常規(guī)飼養(yǎng)的年輕小鼠相比，在常規(guī)飼養(yǎng)的老年小鼠回腸中高表達的基因是一大群包括抗原處理和遞呈、補體途徑激活、微生物相關分子模式識別及B 細胞遷移功能的基因。并且，年齡影響厚壁菌門/擬桿菌門比值（Firmicutes/Bacteroidetes，F(xiàn)/B），老齡鼠體內擬桿菌門更多，厚壁菌門更少。Yang 等［20］的研究指出，由厚壁菌門增加或擬桿菌門減少引起的F/B增加被廣泛認為是腸道生物失調的標志?？梢钥闯?，機體在不同年齡段的腸道菌群組成不同，老年小鼠腸道菌群相對于年輕小鼠具有更多優(yōu)點。

2.2 肥胖與腸道菌群的關系 肥胖是指身體脂肪含量過高，導致體重增加的現(xiàn)象，許多疾病與肥胖有關［21］。自1980 年以來，70 多個國家的肥胖率翻了一番，其他大多數(shù)國家的肥胖率也在不斷上升；至2015年，全球共有1.077 億兒童和6.037 億成人肥胖。高體質量指數(shù)（body mass index，BMI）導致全球400 萬人死亡［22］。B?ckhed 等［23］將傳統(tǒng)飼養(yǎng)小鼠盲腸微生物移植到同型無菌小鼠中，在14 d 內減少了其進食量的情況下，無菌小鼠卻表現(xiàn)出體脂含量增加的現(xiàn)象，表明微生物能促進腸道對單糖的吸收，并且無菌小鼠在被移植菌群后，其空腹誘導脂肪細胞因子的作用被選擇性抑制，導致脂肪細胞中甘油三酯增加，說明腸道菌群與機體肥胖存在關聯(lián)。Ridaura 等［24］將4 對肥胖程度不一致的雙胞胎（肥胖的一方BMI＞30 m/kg2，且兩個雙胞胎常年BMI 相差≥5.5 m/kg2）的糞便樣品以經(jīng)口灌胃的方式移植到無菌小鼠中，發(fā)現(xiàn)移植了雙胞胎中肥胖一方腸道菌群的無菌小鼠脂肪質量的增大趨勢顯著大于移植了較瘦一方雙胞胎腸道菌群的無菌小鼠，表明肥胖人群的腸道菌群更有利于肥胖體質的形成。Ley 等［25-26］的研究表明，在瘦型和胖型小鼠中，擬桿菌門和厚壁菌門的比例不同；胖型小鼠擬桿菌門少而厚壁菌門多，經(jīng)低碳水化合物飲食治療后，表現(xiàn)出擬桿菌門豐度增加而厚壁菌門豐度減少。這些研究表明，肥胖機體具有特殊的腸道菌群，其腸道菌群對于肥胖體征的形成具有促進作用，通過飲食治療可以調整腸道菌群構成。

2.3 高血壓與腸道菌群的關系 有研究表明，與常規(guī)鼠相比，腸道菌群完全不存在的無菌小鼠的血壓相對較低［27］。Li 等［28］將高血壓患者的腸道菌群移植到無菌小鼠中，通過尾部套袖法測定血壓值，結果表明，與對照組相比，移植了高血壓患者腸道菌群的無菌小鼠顯示出更高的收縮壓、舒張壓和平均舒張壓。為了確定腸道微生物的變化是否與高血壓有關，他們還對41名健康對照、56名高血壓前期患者和99名原發(fā)性高血壓患者進行糞便樣品研究，通過從這些樣本中識別的基因總數(shù)來表征腸道菌群的豐富度，發(fā)現(xiàn)高血壓前期患者組和高血壓患者組的基因數(shù)量明顯減少，表明高血壓患者存在腸道菌群密度低的狀況。對Wistar Kyoto 大鼠［平均動脈壓為（108±2）mmHg］和自發(fā)性高血壓大鼠［平均動脈壓為（148±10）mmHg］從Chao 豐富度、Pielou 均勻度和Shannon多樣性進行糞便細菌群落組成分析，發(fā)現(xiàn)自發(fā)性高血壓大鼠組的F/B 比Wistar Kyoto 大鼠高約5 倍，并且微生物豐富度、均勻度和多樣性都顯著下降［20］。因此，腸道菌群與高血壓癥狀存在關聯(lián)，高血壓機體的腸道菌群存在異常。

3 腸道菌群影響疾病發(fā)生發(fā)展的作用機制

3.1 影響基因的表達 近年來，許多研究利用無菌鼠證實了腸道菌群與癌癥存在關聯(lián)［29-30］。結直腸癌（colorectal cancer，CRC）為全球發(fā)病率第3、死亡率第2 的癌癥。CRC 的發(fā)生、發(fā)展和治療與多種因素有關，其中腸道菌群紊亂可能起著一定的作用［31］。Sobhani 等［32］先將無菌小鼠分為4 組，1、2 組接受CRC 患者腸道微生物移植，3、4 組接正常人體腸道微生物移植，再讓1、3 組接受致癌物氧氮甲烷，2、4 組接受作為對照的生理鹽水。結果顯示，接受氧氮甲烷影響并移植了CRC 患者腸道菌群的無菌小鼠表現(xiàn)出比移植正常腸道微生物的無菌小鼠更低的平均體重。已知聚乙二醇可以阻斷腸道菌群定植，如果在小鼠飲水中加入聚乙二醇，則這種體重下降的現(xiàn)象消失了。同時，移植了CRC 患者腸道菌群的無菌小鼠結腸黏膜中SFRP1、SFRP2、SFRP3、PENK、NPY、ALX4、SEPT9和WIF1等基因啟動子被發(fā)現(xiàn)高度甲基化。由此可以得出結論，移植CRC 患者腸道菌群可誘導了機體CRC 相關基因啟動子的甲基化。

Manca 等［33］利用無菌小鼠研究了腸道菌群對內源性大麻素組（endocannabinoidome，eCBome）的影響。內源大麻素系統(tǒng)由天然配體N-花生四烯醇乙醇胺和2-花生四烯醇甘油、它們的生物合成和降解酶以及大麻素受體組成，是一個廣泛分布的傳輸器系統(tǒng)，通過外圍和中央控制腸道功能［34］。eCBome是一個復雜的信號系統(tǒng)，包括內源性大麻素系統(tǒng)、大約50 種受體和代謝酶，以及超過20 種具有重要生理病理功能的脂質調節(jié)劑（調節(jié)胃腸道功能），并可能介導宿主細胞的微生物通訊［33］。Manca 等［33］將12 周齡無菌小鼠隨機分為兩組，一組接受傳統(tǒng)飼養(yǎng)小鼠的糞便微生物移植（fecal microbial transplanta?tion，F(xiàn)MT），另一組以無菌PBS 灌胃，將兩者與普通無菌小鼠、傳統(tǒng)飼養(yǎng)小鼠在第4 和13 周觀察對比編碼eCBome 受體的基因Cnr1、Gpr18、Gpr55和Ppara，發(fā)現(xiàn)：第13 周時Cnr1在普通無菌小鼠回腸中的表達增加了近2 倍，而FMT 部分逆轉了這種變化；對于兩個孤G 蛋白偶聯(lián)受體Gpr18 和Gpr55，F(xiàn)MT 顯著逆轉了二者在回腸中以及Gpr55 在十二指腸中表達的降低。因此，腸道菌群能夠影響基因的表達，進而影響eCBome。以上研究表明，腸道菌群在基因表達中扮演著重要角色，它們也會參與于基因的表達。

近年有研究證實，腸道菌群的豐度變化與帕金森病相關［35-36］，無菌鼠在這方面也有應用。帕金森病是一種常見于老年的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，影響了中國250 萬人口［37］。α-突觸核蛋白的聚集被認為是一個稱為突觸核蛋白病的疾病家族的致病因素，包括帕金森病、多系統(tǒng)萎縮和路易體?。?8-40］。人類中未調節(jié)的α-突觸核蛋白表達與帕金森病的高風險相關［41］。α-突觸核蛋白過表達（α-synuclein-overex?pressing，ASO）小鼠顯示出精細、總體運動功能進行性缺陷和腸動力缺陷［42］。Sampson 等［43］通過橫梁橫移、極點下降、鼻腔黏著去除和后肢扣住反射4 個方式對ASO 小鼠、無特定病原菌野生同型小鼠、無菌同型小鼠以及無菌ASO 小鼠進行運動功能測試，發(fā)現(xiàn)與無特定病原菌野生同型小鼠相比，ASO 小鼠的測試結果顯示需要更長的時間來完成衡量移動和極點下降，且其鼻腔黏著去除和后肢扣住反射存在障礙，無菌同型小鼠和無菌ASO 小鼠完成實驗的能力相近。這說明腸道微生物參與了生物體蛋白的表達過程，能夠影響α-突觸核蛋白表達，進而影響帕金森病。

3.2 影響免疫功能 隨著腸道菌群與癌癥存在關聯(lián)的觀點出現(xiàn)，國內外涌現(xiàn)出了很多相關研究［44-45］。2018 年有960 萬人死于癌癥，全世界預計超過一半的癌癥死亡發(fā)生在亞洲［46］。癌癥免疫療法作為繼化療、手術治療和放療后的“第四種療法”，與傳統(tǒng)的癌癥療法不同，免疫治療激活或改造人體免疫系統(tǒng)抵抗腫瘤的固有功能，并使其成為攻擊癌細胞的有力武器，而這一過程會被腸道菌群影響［47-48］。因此，也有不少基于無菌鼠研究癌癥治療方法的報道。

免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibi?tors，ICIs）通過抑制腫瘤或基質細胞上T 細胞抑制受體與其同源配體的相互作用，釋放T 淋巴細胞介導的免疫反應。Routy 等［49］選取了抗程序性細胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）及其配體PD-L1（7）單克隆抗體的ICIs，將8 名非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）患者的腸道菌群移植到無菌小鼠中，其中4 名患者對ICIs有應答，4 名無應答；2 周后對無菌小鼠接種MCA-205 腫瘤細胞，5 d 后用PD-1 單克隆抗體治療無菌小鼠，移植了對ICIs 有反應的NSCLC 患者腸道菌群的無菌小鼠，其腫瘤生長延遲，顯示出抗腫瘤效果，而在移植了對ICIs 無反應的NSCLC 患者腸道菌群的無菌小鼠，抗腫瘤效果不顯著。Gopalakrishnan等［50］發(fā)現(xiàn)，腸道菌群中糞便細菌含量高的患者具有顯著更長的無進展生存時間；分別將對抗PD-1 治療無應答患者糞便微生物（NR-FMT）及有應答者糞便微生物（R-FMT）移植到無菌小鼠中，觀察到R-FMT組無菌小鼠的腫瘤與NR-FMT 組相比顯著減小，對抗PD-1 治療的應答改善，腸道菌群中糞便大腸桿菌的豐度也顯著升高；此外，NR-FMT 組無菌小鼠腫瘤中RORγT+T helper 17 細胞的比例增加，與抗PD-1 治療無應答患者腫瘤的觀察結果一致，同時該組脾臟中的調節(jié)性CD4+FoxP3+T 細胞和CD4+IL-17+T細胞的比例也較高，提示機體免疫反應受損。這些結果表明腸道菌群可以通過影響免疫功能改變機體抗腫瘤能力，并且抵抗能力可通過腸道菌群轉移給無菌鼠。

3.3 影響激素調節(jié) Collden 等［12］通過無菌小鼠研究了腸道菌群與睪酮（testosterone，T）和二氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT）這2 種激素的關系。睪丸分泌的T 是男性體循環(huán)中最豐富的雄激素。在靶組織和肝臟中，T 可以通過一些不同的階段性反應，如還原、葡萄糖醛酸化等，最終在男性生殖組織中生成DHT。他們采用氣相色譜-串聯(lián)質譜法檢測了8 周齡常規(guī)飼養(yǎng)C57BL/6 無病原體小鼠和無菌小鼠腸道和血清中葡萄糖醛酸化T 和DHT 的含量，觀察到無菌小鼠盲腸和結腸中葡萄糖醛酸化DHT 水平與無病原體小鼠相比顯著升高，而游離DHT 水平顯著降低，無菌小鼠盲腸和結腸中葡萄糖醛酸化T水平也比無病原體小鼠的相應部位高［12］。這些結果表明腸道菌群在激素調節(jié)中發(fā)揮著作用，參與了DHT 和T 的腸道代謝，對DHT 有去葡萄糖醛酸化的作用。

4 飲食對腸道菌群的影響

腸道菌群在維持機體健康方面承擔著重要任務，其組成和活性也被腸道內底物的有效性和理化條件所影響。腸道菌群生長所需的大部分底物來自于飲食，包括未消化或未完全消化的碳水化合物，如抗性淀粉和膳食纖維，還有作為額外底物的粘蛋白、脫落的上皮細胞和消化酶由宿主提供［51］。

有許多研究已經(jīng)進一步證實飲食對腸道菌群的影響。Desai 等［52］將包含14 種完全測序人造細菌的腸道菌群移植到無菌小鼠中，將無菌小鼠分別以富含膳食纖維（fiber-rich，F(xiàn)R）、缺乏膳食纖維（fiberfree，F(xiàn)F）和益生元（prebiotic，Pre）3 種膳食喂養(yǎng)。無菌小鼠糞便微生物群落動態(tài)研究表明，F(xiàn)F 飲食組幾個物種的豐度發(fā)生了迅速而重復的變化，其中4 種糞便微生物——A. muciniphila、B. caccae、B.ovatus和E. rectale的 變 化 顯 著。A. muciniphila和B. caccae均能在體外降解黏蛋白O-聚糖，B. ovatus和E. rectale不能代謝黏蛋白O-聚糖，但可以一起降解膳食纖維中的大部分多糖，在沒有纖維的情況下，A. muciniphila和B. caccae的豐度迅速增加，纖維降解物種相應減少。當交替使用FR 和FF 飲食時，上述4 種細菌的豐度每天都快速波動，表明了它們對膳食纖維變化的動態(tài)響應能力。而在交替使用Pre 組和FF 組飲食的情況下，糞便菌群豐富度的波動變化與僅使用FF 方案相似。在缺乏膳食纖維的情況下，腸道菌群降解黏膜多糖、產(chǎn)生低度炎癥、結腸長度變短和免疫反應發(fā)生變化等問題會出現(xiàn)，促進機體病原體易感性，過薄的結腸粘液層導致與病原體接觸時，共生菌群與病原體一同引起嚴重疾病。Sonnenburg 等［53］將人源化小鼠分別喂養(yǎng)低微生物群相關碳水化合物（microbiota-accessible carbohy?drates，MACs）和高MACs 飲食7 周，再恢 復到 高MACs 飲食6 周，對比2 組小鼠的腸道菌群，并將實驗小鼠用于繁殖幼崽，在斷奶后，低MACs 飲食的親代小鼠被恢復到高MACs 飲食，觀察低MACs 組的菌群是否會在高MACs 飲食下恢復。該實驗結果表明，低MACs 飲食會導致人源化小鼠微生物群多樣性喪失，引入高MACs 飲食不能恢復微生物群多樣性，在幾代后再引入高MACs 飲食也不能恢復菌群多樣性。Turnbaugh 等［54］對10 只雄性C57BL/6J 無菌小鼠飼喂富含結構復雜植物多糖的低脂膳食（“CHO 膳食”），12 周齡時對它們移植常規(guī)飼養(yǎng)小鼠的盲腸微生物。4 周后，將動物分為2 組，5 只飼喂富含飽和脂肪、不飽和脂肪及通常用作人類食物添加劑的碳水化合物的西式膳食，另外5 只飼喂CHO 膳食，對群體脫氧核糖核酸的聚合酶鏈反應產(chǎn)生的全長16S rRNA 基因擴增子進行測序，以確定每只小鼠的盲腸微生物群體結構，再使用UniFrac 指標對社區(qū)進行比較。結果表明，5 個西方飲食相關的盲腸群落比5 個CHO 飲食的盲腸群落彼此之間更相似，西方飲食相關的盲腸群落中厚壁菌門的相對豐度明顯較高，擬桿菌門的相對豐度明顯較低。此外，長期攝入高纖維食物也具有增加腸道菌群中普氏桿菌和類桿菌比例，從而改善腸道菌群糖代謝的作用［55-56］。

這些研究表明了飲食對于腸道菌群的重要影響。隨著飲食的變化，腸道菌群的組成會自發(fā)地進行調整以適應新的環(huán)境，同時，在特定的飲食下，腸道菌群發(fā)生的變化是不可逆的。

5 總結

腸道菌群與機體健康關系密切，不同生理狀態(tài)、疾病和飲食可影響腸道菌群的構成，腸道菌群也影響疾病的進展。近15 年來，大量研究證實腸道微生態(tài)系統(tǒng)失衡與多種疾病的發(fā)生關系密切，特別是肥胖、2型糖尿病等慢性代謝性疾病方向的研究發(fā)展迅猛［57］，無菌鼠逐漸成為腸道菌群研究的有利工具。當前無菌鼠相關研究仍有一些值得改進的地方。例如關于人類腸道菌群組成的大多數(shù)知識都來源于對糞便樣品的分析，但是基于這些分析的微生物數(shù)據(jù)不能準確代表各種腸道部分的情況［58］，若能攻克相關問題，相信會取得更大的進展。無菌鼠作為腸道菌群研究的利器，相關技術也在近幾年飛速發(fā)展。在國內，第三軍醫(yī)大學已經(jīng)突破了無菌剖腹產(chǎn)、乳鼠人工哺乳及污染監(jiān)測室等無菌小鼠培育的關鍵技術，建立了我國最具影響力的無菌動物平臺［59］，目前擁有C57BL/6J、BALB/c、DBA 及Kunming小鼠等無菌小鼠系列品系［59］，為國內進行相關研究提供了堅實的基礎。

總體而言，腸道菌群的研究為許多疾病的研究及治療提供了新的思路和方法，可以預見將來會有越來越多基于無菌鼠的研究，這無疑將拓展我們對腸道菌群及相關疾病的認識，為治病救人提供更多的研究依據(jù)。