李建設(shè) 何文龍 孟珂 付云

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 1神經(jīng)重癥監(jiān)護(hù)病房,河南 新鄉(xiāng) 453000;2全科醫(yī)學(xué)科)

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞的重要組成部分，其表面分布許多神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體、神經(jīng)肽、激素及Na+、K+和Ca2+通道等，與神經(jīng)元相互作用，在免疫調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮重要作用，與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、阿爾茨海默病和癲癇等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)〔1～3〕。當(dāng)中樞神經(jīng)細(xì)胞受損時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活，伴隨標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和細(xì)胞因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6等分泌增多，對(duì)神經(jīng)元起到保護(hù)或毒性作用。因此，探討星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化機(jī)制對(duì)認(rèn)識(shí)和改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病具有重要意義。姜黃素是從姜黃屬植物姜黃、郁金和莪術(shù)等多年生的草本植物中提取的酚性色素，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、降血脂和抗腫瘤等多種藥理活性〔4，5〕；NF-κB信號(hào)通路是與細(xì)胞炎癥密切相關(guān)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促炎細(xì)胞因子、脂多糖 (LPS)、生長(zhǎng)因子及抗原受體等均可激活核因子(NF)-κB，參與細(xì)胞免疫、炎癥、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞發(fā)育和淋巴器官形成等生理過(guò)程〔6〕。已有報(bào)道證實(shí)〔7〕，姜黃素可通過(guò)抑制TNF-α誘導(dǎo)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1表達(dá)和釋放減輕神經(jīng)病理性痛，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷起到保護(hù)作用，但其對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響并不清楚。LPS是革蘭陰性桿菌胞壁外膜層的重要組分，可誘導(dǎo)炎癥因子的釋放造成炎癥損傷〔8～10〕。本研究構(gòu)建LPS誘導(dǎo)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后的炎癥反應(yīng)模型，觀察姜黃素對(duì)細(xì)胞中NF-κB炎癥因子信號(hào)通路的影響，以期為預(yù)防和改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病提供新的線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 出生1～2 d的清潔級(jí)SD大鼠購(gòu)于福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司，D-Hanks液、Triton、4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、姜黃素、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、蛋白裂解液、LPS、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)抗體和GFAP抗體購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，p-p65、p65和GAPDH抗體購(gòu)于英國(guó)Signal cell公司，一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光劑和二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗購(gòu)于北京中杉公司，Lipofectamine 2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Promega公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)于武漢博士德公司。

1.2大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 采用濃度為75%乙醇對(duì)SD大鼠進(jìn)行消毒。在超凈臺(tái)上取大腦皮層組織。置于含D-Hanks培養(yǎng)液中，剔除腦膜和血管組織。在培養(yǎng)皿中，將組織剪碎(約1 mm3小塊)，研磨后，加入0.25%胰蛋白酶消化10～20 min。待細(xì)胞分散后，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，以200目篩網(wǎng)過(guò)濾，并以1 000 r/min離心10 min。加入培養(yǎng)基調(diào)整濃度約為6×105個(gè)/ml。取適量細(xì)胞懸液接種至含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。待培養(yǎng)9～12 d后，加入胰蛋白酶消化，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。待細(xì)胞突觸皺縮后，加培養(yǎng)基終止消化。吹打后離心棄上清。加入培養(yǎng)液行差速黏附處理30 min后，以每毫升5×105個(gè)細(xì)胞接種至培養(yǎng)瓶中。收集第4代細(xì)胞，以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種至96孔板上，常規(guī)培養(yǎng)2 d后，以4%多聚甲醛常溫固定30 min。經(jīng)0.2%Triton破膜后，加入1∶1 000倍稀釋的GFAP抗體4℃下孵育24 h。再加入1∶100倍稀釋的二抗37℃下孵育1 h。最后，加入DAPI(濃度1 μg/ml)37℃下復(fù)染10 min。采用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3MTT檢測(cè)細(xì)胞活性 收集長(zhǎng)勢(shì)良好的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/ml，以每孔100 μl接種至96孔板上。設(shè)置不做藥物處理的對(duì)照組和不含細(xì)胞的空白組。以濃度為100 ng/ml LPS單獨(dú)處理或聯(lián)合5、10、20、40、80 μmol/L姜黃素共同作用24 h后，加入5 mg/ml MTT溶液10 μl反應(yīng)4 h。以DMSO溶解(體積150 μl)藍(lán)紫色晶體后，上酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔細(xì)胞在490 nm處的光密度(A)值。細(xì)胞活力(%)=(加藥孔A值-空白孔A值)/(對(duì)照孔A值-空白孔A值)×100%。

1.4硝酸還原酶法檢測(cè)NO含量 將大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞以每孔3×104個(gè)接種至12孔細(xì)胞板上，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，濃度為100 ng/ml LPS單獨(dú)處理或聯(lián)合5、10、20 μmol/L姜黃素共同作用24 h。收集上清液。參照NO檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行檢測(cè)。其中以100 ng/ml LPS單獨(dú)處理下NO含量作為1，采用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為550 nm比色，觀察各組細(xì)胞NO相對(duì)含量。

1.5Western印跡檢測(cè)iNOS、p-p65和p65蛋白表達(dá) 參照總蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取待測(cè)細(xì)胞的總蛋白，并以BCA法對(duì)總蛋白定量。將總蛋白上樣至十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳分離后，轉(zhuǎn)膜。取聚偏氟乙烯(PVDF)膜浸入含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉1 h。加入1∶500倍稀釋的iNOS、p-p65、p65和GAPDH抗體于4℃下孵育24 h。經(jīng)封閉液洗滌后，加入1∶5 000倍細(xì)胞的二抗于37℃下孵育1 h。暗室內(nèi)加入ECL化學(xué)發(fā)光劑顯影后，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.6ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β和IL-6含量 收集 LPS單獨(dú)(100 ng/ml)處理或聯(lián)合姜黃素(5、10、20 μmol/L)共同作用24 h后的星形膠質(zhì)細(xì)胞，嚴(yán)格參照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)各組細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

1.7熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)NF-κB活性 將構(gòu)建的NF-κB報(bào)告基因質(zhì)粒參照轉(zhuǎn)染試Lipofectamine 2000使用說(shuō)明書(shū)步驟轉(zhuǎn)染至星型膠質(zhì)細(xì)胞中，分別以不做藥物處理的細(xì)胞作為L(zhǎng)PS(-)+ Cur(-)對(duì)照組，以100 ng/ml LPS作用6 h的細(xì)胞作為L(zhǎng)PS(+)+Cur(-)組，以5、10、20 μmol/L姜黃素預(yù)處理1 h后，再給予100 ng/ml LPS作用6 h的細(xì)胞作為L(zhǎng)PS(+)+Cur(+)組。加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白后，取適量總蛋白加入檢測(cè)試劑后，上機(jī)檢測(cè)，將LPS(+)+Cur(-)組細(xì)胞熒光素酶活性作為1，計(jì)算各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定結(jié)果 首次接種的星形膠質(zhì)細(xì)胞在2～3 d完全貼壁，折光性較好，部分細(xì)胞開(kāi)始鋪展，甚至長(zhǎng)出細(xì)長(zhǎng)的胞突，可見(jiàn)胞體成多角形，個(gè)別細(xì)胞核呈圓形或卵圓形，有些胞體向四周發(fā)出幾個(gè)放射狀突起。10 d左右可長(zhǎng)滿(mǎn)，主要以星形膠質(zhì)細(xì)胞為主，還含有少量的少突膠質(zhì)細(xì)胞和極少量的成纖維細(xì)胞。傳代后細(xì)胞保持原狀態(tài)，但生長(zhǎng)更活躍，培養(yǎng)4 d左右細(xì)胞可鋪滿(mǎn)瓶底。顯微鏡下細(xì)胞胞質(zhì)較豐富，突起增多，胞核常偏于一側(cè)，多為橢圓形。培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞在未長(zhǎng)滿(mǎn)至前，細(xì)胞形態(tài)似成纖維細(xì)胞樣，形態(tài)不一，扁平狀，細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后匯合形成均一的鋪路石樣外觀。星形膠質(zhì)細(xì)胞傳代到第4代時(shí)應(yīng)用GFAP抗體免疫熒光鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞染成綠色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，陽(yáng)性率達(dá)到95%以上，證實(shí)絕大多數(shù)細(xì)胞為星形膠質(zhì)細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

圖1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定結(jié)果(×400)

2.2姜黃素和LPS對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響 與對(duì)照(無(wú)任何藥物作用)組(97.78%±2.78%)相比，100 ng/ml LPS單獨(dú)作用(96.70%±3.24%)與姜黃素5、10、20 μmol/L共同作用后星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力(96.34%±2.53%、95.78%±3.08%、95.57%±3.16%)無(wú)顯著變化(P>0.05)，而姜黃素40、80 μmol/L 與LPS共同作用后細(xì)胞活力(65.25%±1.99%、22.02%±1.11%)較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃素濃度低于40 μmol/L時(shí)，對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞活力無(wú)顯著影響。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究采用5、10、20 μmol/L濃度的姜黃素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。

2.3姜黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)NO 生成和iNOS表達(dá)的抑制作用 給予100 ng/ml LPS單獨(dú)作用24 h后，星形膠質(zhì)細(xì)胞中NO含量和iNOS蛋白表達(dá)(0.99±0.07、0.93±0.07)較對(duì)照組(0.32±0.03、0.09±0.01)明顯升高(P<0.05)；給予5、10、20 μmol/L濃度的姜黃素處理后，細(xì)胞中NO含量和iNOS蛋白表達(dá)(0.74±0.04、0.72±0.05，0.55±0.03、0.53±0.04，0.41±0.02、0.26±0.02)較100 ng/ml LPS單獨(dú)處理組明顯降低(P<0.05)，且呈濃度依賴(lài)性。見(jiàn)圖2。

圖2 Western印跡檢測(cè)iNOS蛋白表達(dá)

2.4姜黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)的促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的抑制作用 與對(duì)照組相比，給予100 ng/ml LPS單獨(dú)作用后，星形膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均明顯升高(P<0.05)；與100 ng/ml LPS單獨(dú)處理組相比，給予5、10、20 μmol/L濃度的姜黃素處理后，TNF-α、IF-1β、IF-6含量均呈濃度依賴(lài)性明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 姜黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β和IL-6的影響

2.5姜黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路活化的抑制作用 給予100 ng/ml LPS單獨(dú)作用后，星形膠質(zhì)細(xì)胞中p-p65/p65比值和NF-κB活性(0.95±0.09、0.98±0.07)較對(duì)照組(0.08±0.01、0.05±0.01)明顯升高(P<0.05)；而給予5、10、20 μmol/L濃度的姜黃素處理后，細(xì)胞中p-p65/p65比值(0.72±0.07、0.37±0.03、0.16±0.01)和NF-κB活性(0.75±0.05、0.53±0.04、0.23±0.02)明顯依次降低，與100 ng/ml LPS組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 Western印跡檢測(cè)p-p65和p65蛋白表達(dá)

3 討 論

在炎癥環(huán)境下，星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮免疫細(xì)胞的作用，可通過(guò)產(chǎn)生和釋放TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎反應(yīng)調(diào)節(jié)因子促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重神經(jīng)細(xì)胞損傷；另外，激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞可大量表達(dá)iNOS，產(chǎn)生大量的NO，對(duì)神經(jīng)元起到毒性作用〔11～13〕。因此，探討星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化及炎癥機(jī)制，減輕其炎癥反應(yīng)對(duì)認(rèn)識(shí)和治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病具有重要意義。姜黃素是一種天然的酚性色素，具有抗炎、抗氧化、抗病毒和抗腫瘤等藥理作用，且毒性小和不良反應(yīng)小，可通過(guò)調(diào)控多種基因或信號(hào)通路的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用。Nakatake等〔14〕發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過(guò)抑制肝細(xì)胞NF-κB活化影響炎癥介質(zhì)iNOS、IL-6、TNF-α的表達(dá)，被認(rèn)為具有治療器官損傷的潛力。Zhang等〔15〕指出，姜黃素可通過(guò)抑制外傷性脊髓損傷誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β、IL-6的產(chǎn)生，抑制TAK1和NF-κB通路活化，減輕脊髓損傷。本研究結(jié)果提示，姜黃素可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)參與神經(jīng)系統(tǒng)損傷的保護(hù)機(jī)制。

NF-κB是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞的免疫、炎癥、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞發(fā)育和淋巴器官形成等生理過(guò)程；p65是其5個(gè)亞單位(Rel、RelB、p52、p50和p65)之一；正常情況下，p65可與抑制蛋白IκB結(jié)合形成復(fù)合物，以無(wú)活性形式存在于胞質(zhì)中；但當(dāng)受到細(xì)胞外信號(hào)如LPS刺激時(shí)，IκB蛋白降解，p65被磷酸化(p-p65)，NF-κB激活，p-p65/p65比值可間接反映NF-κB通路激活程度〔16〕。研究〔17～19〕已證實(shí)，被LPS誘導(dǎo)活化的NF-κB可通過(guò)促進(jìn)炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6表達(dá)，同時(shí)還可啟動(dòng)iNOS轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)iNOS表達(dá)，產(chǎn)生NO?？梢?jiàn)，活化的NF-κB可通過(guò)調(diào)控炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的產(chǎn)生促進(jìn)炎癥進(jìn)展。Tsubaki等〔20〕和Cao等〔21〕證實(shí)，抑制或阻斷NF-κB活化可下調(diào)細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α和NO表達(dá)，減弱炎癥，改善組織損傷。曹念等〔22〕研究指出，姜黃素可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮改善慢性阻塞性肺疾病肺病理?yè)p傷的作用。為了進(jìn)一步探討姜黃素保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的分子機(jī)制，本文通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)，結(jié)果提示姜黃素可通過(guò)抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的作用。