余秋岫，金曉玲，羅 峰，劉彩賢*

(1 中南林業(yè)科技大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院，長(zhǎng)沙 410004；2 廣州市綠化公司，廣州 510000)

花色創(chuàng)新是花卉育種的重要內(nèi)容，研究色彩形成的原因?qū)τ谛滦陀^花品種的選育具有重要意義[1]。花色是復(fù)雜的表型性狀，花瓣色素種類(lèi)及其含量是影響月季[2]、部分忍冬屬[1]植物呈色的主要原因。除受色素類(lèi)型與比例影響外，還有細(xì)胞液pH值、光照、溫度等多種因素的影響[3-4]，其中花瓣表皮細(xì)胞形態(tài)是影響花色變化的重要因素之一[5]。Zhang等[6]提出錐形細(xì)胞將光線(xiàn)聚焦到內(nèi)部花色素上，從而增強(qiáng)花瓣顏色的強(qiáng)度[7]；不同花色菊花徒手切片結(jié)果表明，圓錐形上表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)入射光進(jìn)入細(xì)胞比例比扁平形增加[8]。另外，對(duì)萬(wàn)壽菊舌狀花超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，葉綠體向有色體的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變可導(dǎo)致花色呈橘黃色變化[9]。

紫花含笑 (Micheliacrassipes) 是木蘭科 (Magnoliaceae) 含笑屬 (Michelia) 常綠小喬木或灌木，花色紫紅，是含笑屬中為數(shù)不多紫色系植物，近年來(lái)常用作雜交親本進(jìn)行木蘭科植物花色改良[10-11]。目前，對(duì)紫花含笑的研究主要集中在孢粉學(xué)[12]、生物學(xué)特性[13]、雜交新品種選育[11,14]、無(wú)性繁殖方式[15-16]以及花葉提取物開(kāi)發(fā)[17]等方面，據(jù)觀察其花被在蕾期完成由綠轉(zhuǎn)紫的著色過(guò)程，現(xiàn)蕾時(shí)為綠色而在花蕾期花冠呈紫色，但紫花含笑花被顏色形成的機(jī)理尚不明確，花被的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其對(duì)呈色影響也無(wú)報(bào)道。本研究采用光鏡和電鏡方法觀察比較不同顏色花被顯微及超微結(jié)構(gòu)，結(jié)合花色表型分析花被呈色過(guò)程中花色素和細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異，為探討紫花含笑的花色呈色機(jī)制提供依據(jù)，也為木蘭科植物花色育種及功能利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采自湖南省林業(yè)廳木蘭科資源圃的健康紫花含笑植株。根據(jù)花期發(fā)育過(guò)程中花被顏色的變化進(jìn)程，分為綠被期和紫被期2個(gè)階段。分別取綠色和紫色花被片作為石蠟切片、掃描電鏡、透射電鏡及色素含量分析試驗(yàn)材料(圖1)。取樣時(shí)去除花被基部與頂部位置，取花被2/3的部分。

1.2 觀測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.1 花色表型測(cè)定參照張楊青慧等[3]的方法，用CM-700d型號(hào)色差儀(Konica minolta，Japan)對(duì)紫花含笑花被上表皮進(jìn)行測(cè)量，獲得花色明度(L*值)、色相a*和b*值，彩度C*值和色相角度h根據(jù)公式計(jì)算[18]，5次生物學(xué)重復(fù)。其中，C*=(a*2+b*2)1/2,h=arctan(b*/a*)

1.2.2 花被色素含量類(lèi)黃酮含量分析采用Flavonoid Kit比色試劑盒法(南京建成生物工程研究所)；花青素含量提取采用1%鹽酸溶液水解法[19]；葉綠素及類(lèi)胡蘿卜素含量測(cè)定參照于娜[20]乙醇浸提法。所有指標(biāo)含量測(cè)定均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)均設(shè)3次技術(shù)重復(fù)。

1.2.3 花被表皮色素分布觀察參照程怡等[21]方法，尖頭鑷子撕下花被2/3處上表皮，于EVOS XL Core細(xì)胞成像系統(tǒng)40倍鏡下拍照觀察。

1.2.4 花被石蠟切片樣品制備及觀測(cè)以綠色和紫色花被為試材，取花被2/3處置于FAA固定液中，采用常規(guī)石蠟切片法制片[9,22]觀測(cè)。利用數(shù)字切片掃描系統(tǒng)Motic VM1(廈門(mén)麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)觀察、拍照，用Digimizer 4.5.1軟件測(cè)定花被表皮形態(tài)，包括上表皮長(zhǎng)度、寬度及其長(zhǎng)寬比。

1.2.5 花被掃描電鏡樣品制備及觀測(cè)參照肖文芳[5]的方法。從紫花含笑植株上采集新鮮花朵，用蒸餾水漂洗干凈；截取大小為5 mm×5 mm樣品，置于戊二醛固定液中；用磷酸緩沖液對(duì)樣品進(jìn)行沖洗，共3次，每次10 min；用30%～100%乙醇梯度脫水處理；用醋酸異戊酯替換掉細(xì)胞中的乙醇，2次，每次15 min；使用真空冷卻干燥器進(jìn)行干燥處理； 樣品粘附在鋁制托盤(pán)，用離子濺射鍍膜儀(IB-5 型)在樣品表面鍍1層金屬膜；使用JSM-6390 LV 掃描電鏡(Hitachi，Japan)對(duì)樣品進(jìn)行觀察及拍照記錄。

圖1 紫花含笑花被變色前后上表面Fig.1 The upper surface of different color perianths in Michelia crassipes

1.2.6 花被透射電鏡樣品制備及觀測(cè)取花被2/3部分，剪成小細(xì)條，迅速放入2%戊二醛固定液中，抽真空防止材料上浮，4 ℃保存；4 ℃，1%四氧化鋨(OsO4)固定3 h；30%～100%乙醇梯度脫水處理；環(huán)氧樹(shù)脂812包埋劑包埋樣品；超薄切片機(jī)切片，分別置于乙酸雙氧鈾[UO2(CH3COO)2·2H2O]、檸檬酸鉛(C6H5O7Pb)中染色；于透射電鏡下觀察(H-7650，Hitachi，Japan)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Origin 2017繪制圖表和SPSS 2.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)以及逐步回歸分析，指標(biāo)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花含笑花色變化過(guò)程中花被表型參數(shù)和色素含量變化特征及其相關(guān)性

2.1.1 花色表型參數(shù)如圖2，A所示，不同顏色花被L*、a*、b*差異明顯。其中，隨著花被顏色由綠轉(zhuǎn)紫，其明度L*值大幅降低；色相a*值上升表示由綠到紅的變化，花被顏色向紅色相偏移，色相b*值大幅降低說(shuō)明顏色由黃轉(zhuǎn)藍(lán)的變化趨勢(shì)；彩度C*值大幅降低，色相角h則上升。

2.1.2 色素含量圖2，B顯示，在紫花含笑花被呈色過(guò)程中，花被類(lèi)黃酮、花青素和類(lèi)胡蘿卜素含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，葉綠素則呈下降趨勢(shì)。其中，在花色由綠轉(zhuǎn)紫變化過(guò)程中，花被類(lèi)黃酮含量上升了1.2倍，花青素含量上升了3.25倍，類(lèi)胡蘿卜素含量上升了11.3倍，而葉綠素含量下降了1.05倍；但與其他色素含量相比，花被類(lèi)胡蘿卜素總含量上升幅度最大，含量卻最低。同時(shí)，比較紫花含笑花被呈色變化過(guò)程中花青素與其他各色素含量比值，發(fā)現(xiàn)花被花青素/類(lèi)黃酮略微有所增大，花被花青素/葉綠素明顯增大，增加了7.69倍，而花被花青素/類(lèi)胡蘿卜素卻顯著降低了65.48%；但就比值大小而言，不同顏色花被均以花青素/類(lèi)胡蘿卜素最大，花青素/葉綠素次之，花青素/類(lèi)黃酮最小(圖2，C)。

2.1.3 花色表型與色素含量的關(guān)系從簡(jiǎn)單相關(guān)分析結(jié)果(表1)可知，花被片明度L*值與a*值呈極顯著負(fù)相關(guān)，同時(shí)與花青素、類(lèi)黃酮、類(lèi)胡蘿卜素及花青素/類(lèi)黃酮、花青素/葉綠素的比值也呈負(fù)相關(guān)，而與b*值、葉綠素含量及花青素/類(lèi)胡蘿卜素呈正相關(guān)；a*值與b*值、葉綠素含量及花青素/類(lèi)胡蘿卜素呈負(fù)相關(guān)，與花青素、類(lèi)黃酮和類(lèi)胡蘿卜素含量及花青素/類(lèi)黃酮、花青素/葉綠素呈正相關(guān)；b*值與葉綠素含量和花青素/類(lèi)胡蘿卜素呈正相關(guān)，與花青素、類(lèi)黃酮、類(lèi)胡蘿卜素含量、花青素/類(lèi)黃酮和花青素/葉綠素呈負(fù)相關(guān)?？梢?jiàn)，在紫花含笑花被花色由綠轉(zhuǎn)紫的過(guò)程中，花被表面明度L*降低，花色紫紅變化程度主要與花青素、類(lèi)黃酮、類(lèi)胡蘿卜素等色素含量以及花青素/類(lèi)黃酮、花青素/葉綠素呈顯著正相關(guān)，而與葉綠素含量和花青素/類(lèi)胡蘿卜素呈顯著負(fù)相關(guān)；各色素間相互影響，相互制約，共同影響花被呈色。

圖2 紫花含笑不同顏色時(shí)期花被表型參數(shù)和色素含量、比值比較Fig.2 Comparison of phenotypic parameters, pigment content and ratio of perianth in different color periods of Michelia crassipes

表1 各指標(biāo)間簡(jiǎn)單相關(guān)性分析

同時(shí)，簡(jiǎn)單相關(guān)分析中與花被呈色表現(xiàn)出極顯著相關(guān)因素較多，進(jìn)一步對(duì)各色素含量變化進(jìn)行逐步回歸分析，擬從不同花色素中找到花色(a*、b*)影響最顯著的因子。在5%的顯著水平下，逐個(gè)淘汰不顯著自變量，選出偏回歸系數(shù)達(dá)到顯著或極顯著水平的因子，進(jìn)入花色的回歸方程(表2)。如表2所示，花被色度a*值的逐步回歸方程中，僅保留了花青素1個(gè)因子，且二者呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，其余因子全部被剔除；花被色度b*值的逐步回歸方程中，也只保留了花青素1個(gè)因子，但二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。這一結(jié)果表明，花青素對(duì)紫花含笑花冠呈紫色有顯著作用。

綜合以上分析，花被中各色素組分的相對(duì)含量變化共同影響紫花含笑呈色，其中花青素含量上升以及類(lèi)胡蘿卜素、類(lèi)黃酮等含量增加輔助增色可能是紫花含笑花被顯紫色的主要原因，同時(shí)還伴隨著葉綠素的降解。

2.2 紫花含笑花被上表皮色素分布特征

通過(guò)40倍光鏡觀察紫花含笑花被上表皮徒手切片(圖3)發(fā)現(xiàn)，綠色花被中主要是葉綠素分布，未觀察到花青素的存在(圖3，A)；而紫色花被中，花青素出現(xiàn)，并大面積分布于上表皮中，葉綠素含量降低(圖3，B)。因此，花青素的出現(xiàn)可能是紫花含笑花冠著紫色的主要原因。

2.3 紫花含笑花被表皮細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)

2.3.1 基本形態(tài)特點(diǎn)對(duì)不同顏色花被的上表皮細(xì)胞長(zhǎng)度、寬度及長(zhǎng)寬比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)不同花色花被的細(xì)胞形態(tài)存在差異。其中，綠色花被上表皮細(xì)胞近似為正方形，細(xì)胞排列緊密、間隙小，表面平整(圖3，C)，細(xì)胞面積較小，長(zhǎng)寬比為1.497(表3)；紫色花被上表皮多為橢圓形，單個(gè)細(xì)胞的裸露面大于細(xì)胞間接觸面，表面呈弧形，細(xì)胞面積較大，長(zhǎng)寬比為1.855(圖3，D；表3)。

表3 紫花含笑不同顏色花被上表皮細(xì)胞解剖形態(tài)比較

2.3.2 不同顏色花被片上表皮細(xì)胞形態(tài)比較肖文芳等[5]將蝴蝶蘭花瓣表皮細(xì)胞形態(tài)分為扁平型、穹頂型、長(zhǎng)穹頂型和乳突型。本試驗(yàn)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，紫花含笑綠色花被上表皮細(xì)胞形態(tài)完整，均為扁平型(圖4，A)，細(xì)胞基本飽滿(mǎn)，細(xì)胞間隙處有輕微皺縮；細(xì)胞排列緊密，基本處于同一個(gè)平面，無(wú)空隙，具氣孔器(圖4，B)。紫花含笑紫色花被除氣孔器外(圖4，C)，上表皮細(xì)胞垂周壁上覆蓋不規(guī)則的褶皺條紋，條紋間有空隙；細(xì)胞凸起為穹頂型，細(xì)胞排列緊湊但不處于同一個(gè)平面，單個(gè)細(xì)胞呈弧形凸起(圖4，D)。花被上表皮結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果表明，花被呈紫色過(guò)程中，表皮細(xì)胞由扁平型向圓錐凸起變化，單個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)寬比增大，細(xì)胞垂周壁出現(xiàn)褶皺，表皮結(jié)構(gòu)形態(tài)上向增加光照吸收面積變化。

A、C.綠色花被；B,D.紫色花被;ue.上表皮; le.下表皮圖3 紫花含笑不同顏色花被上表皮色素分布及細(xì)胞形態(tài)變化A,C. Green tepal; B,D. Purple tepal; ue. Upper epidermis; le. Lower epidermisFig.3 The pigment distribution and transverse sections of upper epidermal cells in different color perianth of Michelia crassipes

A.綠色花被上表皮；B.綠色花被表皮細(xì)節(jié)圖；C.紫色花被上表皮；D.紫色花被表皮細(xì)節(jié)圖圖4 紫花含笑變色前后花被表皮結(jié)構(gòu)變化A. The upper surface of green tepal; B. The details of upper surface of green tepal; C. The upper surface of purple tepal; D. The details of upper surface of purple tepalFig.4 Electron microscopic images of the upper surface of different color perianth in Michelia crassipes

A～C. 綠色花被:A. 花被超顯微結(jié)構(gòu);B. 細(xì)胞結(jié)構(gòu);C.葉綠體結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)圖;D～F. 紫色花被:D. 花被超顯微結(jié)構(gòu);E. 細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖;F.有色體結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)圖;Chl.葉綠體;g.基粒;O.黑色嗜鋨滴;V.液泡;M.線(xiàn)粒體;N.細(xì)胞核;IS.細(xì)胞間隙;P.質(zhì)體;S.淀粉粒圖5 紫花含笑兩種顏色花被超顯微結(jié)構(gòu)比較A-C. Green tepal: A. Ultrastructure of petals of green tepal; B. Cellular structure diagram; C. The details of chloroplasts; D-F. Purple tepal: D. Ultrastructure of petals of purple tepal; E. Cellular structure diagram; F. The details of chromoplasts; Chl. Chloroplast; G. Granum; O. Osmiophilic droplet; V. Vacuole; M. Mitochondrion; N. Nucleus; IS. Intercellular space; P. Plasmid; S. Starch grainsFig.5 Ultrastructure of perianth with different colors in Michelia crassipes

2.3.3 不同顏色花被細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)差異從兩種顏色花被表皮結(jié)構(gòu)觀察可知，不同顏色花被表皮結(jié)構(gòu)有所差異，現(xiàn)進(jìn)一步對(duì)花被細(xì)胞進(jìn)行超顯微觀察。結(jié)果顯示：紫花含笑綠色花被細(xì)胞有豐富的細(xì)胞器，尤以葉綠體和線(xiàn)粒體居多，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞質(zhì)充盈，細(xì)胞間隙較寬；液泡體積小而分散，在細(xì)胞中與其他細(xì)胞器體積約各占1/3～1/2(圖5，A、B)；葉綠體體積較大，呈長(zhǎng)橢圓形，內(nèi)部基粒片層結(jié)構(gòu)清晰(圖5，C)；花被細(xì)胞中存在大量黑色嗜鋨滴，多為圓形且體積較大(圖5，A～C)。

紫花含笑紫色花被細(xì)胞間隙相比綠色花被窄，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)相對(duì)飽滿(mǎn)；出現(xiàn)葉綠體轉(zhuǎn)化為有色體的超顯微結(jié)構(gòu)，但有色體結(jié)構(gòu)細(xì)胞器數(shù)量不多，中央大液泡占據(jù)花被細(xì)胞體積最大(圖5，D)，多數(shù)細(xì)胞中央大液泡體積幾乎占據(jù)整個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞器擠壓向細(xì)胞邊緣凝聚；偶有細(xì)胞淀粉粒及質(zhì)體球占據(jù)細(xì)胞中央(圖5，E)；存在巨大的淀粉?，F(xiàn)象，淀粉粒近似為圓形或多邊形，質(zhì)體球體積較大(圖5，F(xiàn))。該結(jié)果表明，隨著花被顯紫色，液泡體積增大與葉綠體向有色體轉(zhuǎn)化是主要的細(xì)胞器變化。

3 討 論

色素組成及其含量的時(shí)空組合是決定花色形成的重要因素[1,4,18]，本研究中通過(guò)相關(guān)分析以及逐步回歸方程發(fā)現(xiàn)，紫花含笑花被顯紫色可能是花青素含量顯著上升，伴隨著葉綠素的降解，以及類(lèi)黃酮和類(lèi)胡蘿卜素含量增加起輔助增色作用所致，結(jié)果與Liu[23]研究一致?；ㄇ嗨睾孔兓彩怯绊懨赊r(nóng)紅豆草[24]、麗格海棠[25]等植物花瓣呈色的主要色素。黃酮或黃酮醇等類(lèi)黃酮物質(zhì)本無(wú)色，有顯著的輔助色素效應(yīng)，即與花青苷結(jié)合呈現(xiàn)增色效應(yīng)及紅移[1,26-27]，類(lèi)胡蘿卜素與花青素復(fù)合也產(chǎn)生不同色調(diào)的紅色[8]。本研究中紫花含笑花青素、類(lèi)黃酮和類(lèi)胡蘿卜素含量變化及花青素/葉綠素與紅度a*值呈顯著正相關(guān)，與明度L*值、b*值顯著負(fù)相關(guān)，這與王藝光等[28]發(fā)現(xiàn)類(lèi)胡蘿卜素的積累改變桂花花瓣的紅度a*值結(jié)果一致，也與花青素含量積累降低花瓣明度和黃色程度，有利于睡蓮花色紅色化原因相似[29]。

花瓣錐形表皮細(xì)胞形態(tài)能夠影響其光捕獲能力和光的反射比[30]。菊花[8]和萬(wàn)壽菊[9]細(xì)胞表型對(duì)花色變化的影響研究表明，圓錐形結(jié)構(gòu)相比扁平狀結(jié)構(gòu)入射光進(jìn)入花瓣表皮細(xì)胞的比例增加而花色加深。本研究中，紫花含笑花被呈色前后上表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異性變化與前人結(jié)果一致，即綠色花被表皮細(xì)胞扁平規(guī)整，而紫色花被上表皮細(xì)胞呈橢圓形凸起，表皮細(xì)胞長(zhǎng)寬比變化與色素含量均呈顯著相關(guān)；而且細(xì)胞垂周壁覆蓋褶皺條紋，說(shuō)明花瓣表皮細(xì)胞表面積增大，可能有利于入射光的吸收。

植物花色與花瓣細(xì)胞中質(zhì)體的結(jié)構(gòu)具有密切關(guān)系，煙草花蜜腺綠色轉(zhuǎn)橙過(guò)程中出現(xiàn)葉綠體向有色體轉(zhuǎn)化，并伴隨著一定程度的液泡增大[31]；矢車(chē)菊盛花期花瓣液泡明顯增大并且存在有色質(zhì)體[32]，葉綠體、淀粉體轉(zhuǎn)化為積累類(lèi)胡蘿卜素的有色體細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，是花、果實(shí)顏色黃轉(zhuǎn)橙的主要原因之一[9,33-34]。本研究中，紫花含笑花被超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞液泡體積增大及有色質(zhì)體的轉(zhuǎn)化是其花被呈紫色的主要細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。紫花含笑花冠轉(zhuǎn)紫色過(guò)程中液泡體積占比從1/3直達(dá)2/3以上，更甚者幾乎占據(jù)整個(gè)細(xì)胞，出現(xiàn)了葉綠體結(jié)構(gòu)向淀粉粒以及有色體轉(zhuǎn)化，但數(shù)量不多，與紫被期葉綠素降解、類(lèi)胡蘿卜素含量有明顯增加但含量較少結(jié)果一致。考慮到花青素苷在細(xì)胞質(zhì)中合成，在液泡中積累[26]，因此推測(cè)紫花含笑由綠轉(zhuǎn)紫過(guò)程中，隨著花青素的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)，最終積累在液泡中從而導(dǎo)致液泡體積的增大。另外，在綠色花被細(xì)胞內(nèi)存在大量黑色嗜鋨滴，即油細(xì)胞等脂類(lèi)物質(zhì)被鋨酸固定為嗜鋨滴，許多含鋨酸物質(zhì)的質(zhì)體是精油的合成場(chǎng)所[35-36]，因此推測(cè)綠被期是花香物質(zhì)合成的重要時(shí)期。

綜上所述，紫花含笑花被呈色過(guò)程中，花青素的積累伴隨著類(lèi)胡蘿卜素及類(lèi)黃酮等色素含量增加輔助增色可能是其花被呈紫色的主要原因，細(xì)胞結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為液泡體積增大，葉綠體向有色體轉(zhuǎn)化?；ū怀噬嵌嘁蛩刈饔玫慕Y(jié)果，為更好地詮釋其花被呈色的成因，尚需從植物體內(nèi)色素代謝調(diào)控及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控開(kāi)展深入研究，此結(jié)果為今后木蘭科花色呈色機(jī)制研究提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。