王智華，李小娟，曹 倩，馬小磊，高慶波

(1 中國科學院 西北高原生物研究所，高原生物適應與進化重點實驗室，西寧 810001；2 中國科學院大學，北京 100049；3 青海民族大學 生態(tài)環(huán)境與資源學院，西寧 810007；4 中國科學院 西北高原生物研究所，青海省作物分子育種重點實驗室，西寧 810001)

特有物種的形成及其居群的不連續(xù)分布通常與生境的片段化密切相關[1-3]，并受到隨后氣候波動和環(huán)境變化的影響[3]。狹域分布的特有物種一般具有特殊的生態(tài)需求，競爭能力和擴散能力相對較弱，形成居群個體數(shù)較少且相互隔離的分布格局[4-6]。狹域分布特有物種的居群由于受到瓶頸效應、遺傳漂變、近交衰退等因素的影響，常常具有較低的遺傳多樣性[3-4]，更易受到環(huán)境波動和人類活動的影響，成為保護生物學關注的熱點。

虎耳草屬(SaxifragaL.)是虎耳草科(Saxifragaceae)最大的屬，全世界約500種，主要分布在北半球的高山地區(qū)和環(huán)北極地區(qū)[7]。中國分布有虎耳草屬植物約216種，其中約60%為中國特有種，主要為青藏高原-喜馬拉雅地區(qū)狹域分布種[8]。目前，關于中國虎耳草屬植物的研究主要集中在分類學[9-13]、系統(tǒng)發(fā)育學[14-15]、物種分化[16-18]及廣布物種的譜系地理學方面[7,19-20]。在青藏高原-喜馬拉雅地區(qū)狹域分布的特有虎耳草屬植物遺傳多樣性研究鮮有報道。

黑虎耳草(SaxifragaatrataEngl.)隸屬于虎耳草屬小花組(sect.Micranthes)[8]。分子系統(tǒng)發(fā)育學研究發(fā)現(xiàn)，小花組與虎耳草屬其他物種親緣關系較遠，而與虎耳草科其他屬親緣關系較近，建議將小花組從虎耳草屬分離出來，成立獨立的屬MicranthesHaworth[21-22]。由于缺乏可接受的中文名，本研究仍將黑虎耳草作為廣義虎耳草屬的物種來處理，并采用原有的拉丁名和中文名。黑虎耳草為多年生草本植物，葉基生，花多數(shù)，組成圓錐狀或總狀花序[23]。該物種生于海拔3 000～4 200 m的高寒草甸或流石灘，為祁連山地區(qū)特有狹域分布種[23]。此外，黑虎耳草為傳統(tǒng)藏藥，以花入藥，微苦，寒；退熱，治肺部疾病[23]。根據(jù)野外調查發(fā)現(xiàn)，該物種分布范圍狹窄，居群間相互隔離，居群內個體數(shù)少，易受到生境變化及人類活動的影響。

本研究選取葉綠體DNA(cpDNA)rbcL、trnS-G片段和核糖體DNA(nrDNA)內轉錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer, ITS)對祁連山區(qū)狹域分布的特有物種黑虎耳草進行居群遺傳多樣性研究。目的在于揭示該物種現(xiàn)有居群的遺傳多樣性水平及其分布格局，探討其現(xiàn)有遺傳格局的歷史成因。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗材料于2015年和2017年采自青海省祁連山地區(qū)，共采集黑虎耳草8個居群115個個體，包括貴德縣、門源縣、大通縣各1個居群，祁連縣5個居群(表1；圖1，a、b)。每個居群隨機采集10～19個個體，個體之間間隔10 m以上。選取生長良好植株的新鮮幼嫩葉片，隨即用硅膠干燥，帶回實驗室存放于-20 ℃冰箱備用。憑證標本由高慶波研究員鑒定，館藏于中國科學院西北高原生物研究所青藏高原生物標本館(青海，西寧)。

1.2 DNA提取與PCR擴增

采用改良的CTAB法從硅膠干燥的葉片中提取總DNA[24]。采用通用引物對所有個體的cpDNArbcL、trnS-G片段和nrDNA ITS片段進行PCR擴增[25-27]。PCR反應體系為50 μL，包含1.5 μL DNA模板 (20 ng/μL)，正反向引物各1 μL (10 μmol/L)，2 μL dNTPs (10 mmol/L)，5 μL 10 × PCR緩沖液 (含1.5 mmol/L Mg2+)，0.5 μL (5 U/μL) Taq DNA聚合酶(TaKaRa，大連)，39 μL雙蒸水。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸3 min。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，然后送北京新時代眾合科技有限公司進行雙向測序，測序引物同PCR擴增引物。

表1 黑虎耳草8個居群的采集信息

1.3 數(shù)據(jù)分析

首先利用Chromas 2.6.4軟件對測序峰圖進行核對，并刪除引物序列[28]。利用MEGA 7.0.26軟件對序列進行對位排列，并加以手工微調，然后裁剪成首尾整齊的序列[29]。將cpDNA 2個片段進行串聯(lián)合并后，用DnaSP 5.10統(tǒng)計單倍型[30]。對于ITS序列，由于內轉錄間隔區(qū)1(ITS1)的測序結果不理想，本研究選取測序結果較好的5.8S核糖體RNA(5.8S rRNA)和內轉錄間隔區(qū)2(ITS2)序列進行后續(xù)分析。若ITS正反序列在某位點均顯示套峰，且較弱峰圖達到較強峰圖的1/4，該位點被視為雜合位點[31-32]。利用DnaSP 5.10軟件包中的PHASE 2.1軟件對ITS序列進行單倍型重建[33-34]。隨后對ITS序列的分析均基于分離出的ITS單倍型序列。

利用PERMUT軟件計算居群內平均遺傳多樣性(HS)、總遺傳多樣性(HT)以及2個居群遺傳分化系數(shù)GST和NST[35]。GST僅考慮單倍型頻率，NST兼顧了單倍型頻率和單倍型之間的相似性。用1 000次的重復置換檢驗對NST和GST進行比較，當NST顯著大于GST時，表明居群在分布范圍內具有顯著的譜系地理結構。利用Arlequin 3.11計算每個居群的遺傳多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)[36-37]。利用Arlequin軟件包中的分子變異分析(AMOVA)檢測居群內和居群間的遺傳變異分布格局，并對居群間遺傳變異分化系數(shù)FST進行評價(1 000次置換檢驗)[36-37]。

中央連接網(wǎng)狀圖可以更好地揭示遺傳分化較小的單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)育關系。以最大簡約法為原則，利用NETWORK 10.1.0.0軟件構件cpDNA和ITS單倍型的中央連接網(wǎng)狀圖[38-39]。多堿基的插入/缺失和點突變被認為是通過一步突變形成，設置相同的權重。在中央連接網(wǎng)狀圖中，古老的單倍型多位于網(wǎng)絡圖的內部，年輕的單倍型多位于網(wǎng)絡圖的邊緣[40-41]。

基于cpDNA數(shù)據(jù)進行歧點分布分析來預測黑虎耳草居群的歷史動態(tài)。若歧點分布呈現(xiàn)單峰曲線，表明居群經(jīng)歷了近期擴張；若歧點分布呈現(xiàn)多峰曲線，則表示在較長的時間內居群大小相對穩(wěn)定，并處于個體平衡中[42-46]。利用1 000次的自展重復來產(chǎn)生居群擴張模型的預期分布。Tajima’sD和Fu & Li’sD*兩種無限突變位點模型的中性檢驗也被用來預測居群歷史動態(tài)，顯著的負值說明居群可能經(jīng)歷過近期擴張[47-48]。歧點分布分析和中性檢驗均在DnaSP 5.10軟件中完成[30]。

2 結果與分析

2.1 單倍型/基因型變異位點和地理分布格局

DNA分子序列對位排列后，黑虎耳草8個居群115個個體cpDNA聯(lián)合片段(rbcL、trnS-G)的序列總長度為1 269 bp(H1/H2/H3和H4中rbcL片段的GenBank登錄號分別為MW296152和MW296153；H1、H2、H3和H4中trnS-G片段的GenBank登錄號分別為MW296154、MW296155、MW296156和MW296157)。通過DnaSP軟件分析，共得到4個單倍型(H1～H4)，檢測出4個變異位點，其中1個位點為點突變，另外3個位點為插入/缺失(表2)。單倍型H2出現(xiàn)頻率最高，出現(xiàn)在黑虎耳草所有8個居群中；其次為單倍型H3，出現(xiàn)在5個居群中；單倍型H1和H4分別只出現(xiàn)在祁連山東南部居群P1和P8中(圖1，b；表3)?；赾pDNA數(shù)據(jù)的居群遺傳多樣性(h)變化范圍為0～0.538 5；居群核苷酸多樣性(π)變化范圍為0～0.002 130(表3)。

由于ITS1的測序結果不理想，本研究選取5.8S+ITS2序列進行后續(xù)分析。對位排列后的序列長度為408 bp。利用PHASE軟件進行單倍型分離，共得到9個單倍型(G1～G9，GenBank登錄號分別為MW296143、MW296144、MW296145、MW296146、MW296147、MW296148、MW296149、MW296150和MW296151)，檢測出10個變異位點(表4)。其中G1出現(xiàn)頻率最高，出現(xiàn)在所有8個居群中，其余ITS單倍型多為居群特有單倍型，絕大部分只出現(xiàn)在祁連山東南部居群中(P7、P8)?；贗TS數(shù)據(jù)的居群遺傳多樣性(h)變化范圍為0～0.609 2；居群核苷酸多樣性(π)變化范圍為0～0.003 589(表3)。

表2 黑虎耳草cpDNA單倍型變異位點

2.2 單倍型間的系統(tǒng)發(fā)育關系

cpDNA和ITS單倍型檢測出較少的突變位點，表明序列之間的遺傳分化較小。Network軟件可更好地揭示系統(tǒng)進化關系較近的序列之間的系統(tǒng)發(fā)育關系?；谧畲笏迫环嫿ǖ闹醒脒B接網(wǎng)狀圖顯示，居群共享單倍型，如cpDNA H3和ITS G1，位于網(wǎng)絡圖的中央位置，根據(jù)溯祖理論，推測為較古老的單倍型。居群特有的單倍型一般位于網(wǎng)絡圖的邊緣，可能是通過近期分化衍生而來的年輕單倍型(圖1，c、d)。

2.3 居群遺傳結構

基于cpDNA數(shù)據(jù)計算得出黑虎耳草居群內平均遺傳多樣性(HS)為0.257、總遺傳多樣性(HT)為0.464，兩個遺傳分化系數(shù)GST和NST分別為0.447和0.513。NST大于GST但不顯著，表明黑虎耳草在整個分布范圍內沒有明顯的譜系地理結構。ITS數(shù)據(jù)揭示了相似的居群遺傳結構：HS= 0.194，HT= 0.219，GST= 0.112，NST= 0.122；NST>GST(P> 0.05)?；赾pDNA和ITS數(shù)據(jù)的分子變異分析結果均表明，黑虎耳草現(xiàn)有遺傳變異主要存在于居群內(cpDNA: 51.83%; ITS: 87.84%)，居群遺傳分化系數(shù)(FST)分別為0.481 75和0.121 56(表5)。

a、b餅狀圖表示每個居群中cpDNA(實線)和ITS(虛線)單倍型的頻率；c、d分別為基于cpDNA和ITS單倍型構建的中央連接網(wǎng)狀圖圖1 黑虎耳草8個居群的采樣圖及cpDNA和ITS單倍型分布圖a and b pie charts show the proportion of haplotypes of cpDNA (solid line) and ITS (dashed line) within each population; c and d show the median-joining networks based on haplotypes of cpDNA and ITS, respectivelyFig.1 A map showing the eight sampled populations of S. atrata and the distribution of cpDNA and ITS haplotypes

表3 黑虎耳草8個居群的單倍型/基因型組成及多樣性信息

表4 黑虎耳草ITS單倍型變異位點

表5 黑虎耳草8個居群的分子變異分析

2.4 基于cpDNA聯(lián)合序列的居群歷史動態(tài)分析

對黑虎耳草cpDNA聯(lián)合序列所有個體進行中性檢驗，結果表明，Tajima’sD(-1.012 30，P> 0.05)和Fu & Li’sD*(-2.066 77，P> 0.05)均為負值，均不顯著。歧點分布分析結果顯示，在黑虎耳草整個分布范圍內觀測到的歧點分布與居群擴張模型預測值高度一致(圖2)，說明該物種在整個分布范圍內經(jīng)歷過近期擴張現(xiàn)象。

圖2 黑虎耳草115個體葉綠體DNA聯(lián)合片段歧點分布分析Fig.2 Mismatch distribution analysis for the 115 individuals based on combined cpDNA fragments of S. atrata

3 討 論

3.1 黑虎耳草的居群遺傳結構和進化歷史

狹域分布物種是否具有較低的遺傳多樣性仍存在爭議[49]。一般認為，與同屬廣域分布物種相比，狹域分布物種往往具有較低的遺傳多樣性。這是因為，狹域分布物種更容易受到如下因素的影響：1)較小的有效居群大?。?)奠基者效應和瓶頸效應；3)遺傳漂變和近交衰退；4)較低的擴散能力和競爭能力[4]。然而，Gitzendanner對分別來自同屬的30多對狹域/廣域分布物種的遺傳多樣性進行比較，發(fā)現(xiàn)上述觀點過于概括[49]。受親緣關系遠近的影響，有些屬植物的遺傳多樣性普遍較高，有些屬的普遍較低，而對于同屬植物來說，大部分情況下狹域分布物種的遺傳多樣性比廣域分布物種低，少部分狹域物種的遺傳多樣性與廣域物種相當，甚至更高[49]。

物種水平的總遺傳多樣性(HT)常被用來比較不同物種間的遺傳多樣性水平[49]?；赾pDNA和ITS數(shù)據(jù)的遺傳變異分析表明，黑虎耳草總遺傳多樣性水平較低(cpDNA：HT= 0.464；ITS：HT= 0.219)。明顯低于虎耳草屬其他青藏高原-喜馬拉雅廣域分布物種，如山地虎耳草(Saxifragasinomontana；cpDNA：HT= 0.978；ITS：HT= 0.896)[7]、小傘虎耳草(S.umbellulata；cpDNA：HT= 0.964；ITS：HT= 1.000)[13]、篦齒虎耳草(S.pasumensis；cpDNA：HT= 0.835；ITS：HT= 0.973)[13]、唐古特虎耳草(S.tangutica；cpDNA：HT= 0.933)[19]、優(yōu)越虎耳草(S.egregia；cpDNA：HT= 0.868)[20]等。這可能是由于：1)所選的分子片段進化速率較慢，低估了黑虎耳草物種水平和居群水平的遺傳多樣性；2)黑虎耳草在居群歷史進化中經(jīng)歷了嚴重的奠基者效應和瓶頸效應。真核生物核糖體DNA內轉錄間隔區(qū)(ITS)被5.8S rRNA基因分為內轉錄間隔區(qū)1(ITS1)和內轉錄間隔區(qū)2(ITS2)[50]。其中，5.8S rRNA基因較為保守，而ITS1和ITS2變異速率較快。由于ITS1區(qū)域測序結果不理想，本研究僅使用5.8S和ITS2區(qū)域的序列會低估基于ITS數(shù)據(jù)計算出的黑虎耳草物種水平和居群水平的遺傳多樣性。然而，本研究選用的cpDNA分子標記與小傘虎耳草和篦齒虎耳草相同[13]?；赾pDNA數(shù)據(jù)計算出的黑虎耳草遺傳多樣性遠低于后者，說明黑虎耳草本身遺傳多樣性較低，而不是由于分子片段的選擇偏向。黑虎耳草物種水平和居群水平較低的遺傳多樣性可能與該物種的居群進化歷史有關。

第四紀冰期和間冰期循環(huán)所引起的氣候波動對物種的遺傳分化和特有物種形成產(chǎn)生了深遠影響[51-52]。譜系地理學通過研究物種現(xiàn)有的遺傳分布格局，推測其歷史成因，重建生物區(qū)系進化歷史[53]。由于獨特的地質氣候歷史和復雜的地理拓撲結構，青藏高原及其周邊地區(qū)的高山植物對第四紀冰期的響應表現(xiàn)出不同的譜系地理模式[54]。其中一種模式認為，冰期時青藏高原臺面的居群退縮到海拔較低的東南部邊緣避難所內，間冰期或冰期后重新擴散到高原臺面。與之相對應的遺傳多樣性分布格局為，高原東南部邊緣避難所內的居群由于分化時間較長積累了較多的遺傳變異，擁有較多的單倍型和特有單倍型，具有較高的遺傳多樣性。而高原臺面的居群由于回遷過程中的奠基者效應僅固定少數(shù)分布廣泛的單倍型，常呈現(xiàn)出較低的遺傳多樣性。位于祁連山脈東南部的黑虎耳草居群，如P1、P7和P8，固定了幾乎所有的cpDNA單倍型和ITS基因型，并具有較高的基因多樣性和(或)核苷酸多樣性。而祁連山西北部的居群僅固定少數(shù)廣泛分布的cpDNA單倍型和ITS基因型，基因多樣性和核苷酸多樣性普遍較低。根據(jù)黑虎耳草居群現(xiàn)有的遺傳分布格局推測，第四紀冰期時該物種退縮到祁連山東南部邊緣避難所，間冰期或冰期后回遷到祁連山西北部地區(qū)。這也得到了中性檢驗和歧點分布分析的支持。雖然中性檢驗呈現(xiàn)不顯著的負值，而歧點分布分析結果顯示，在黑虎耳草整個分布范圍內觀測到的歧點分布與居群擴張模型預測值高度一致，說明該物種在整個分布范圍內經(jīng)歷過近期擴張現(xiàn)象。符合上述譜系地理模式的物種還有長花馬先蒿(Pedicularislongiflora)[55]、青海云杉(Piceacrassifolia)[56]、祁連圓柏(Juniperusprzewalskii)[57]等。然而，狹域分布物種由于居群較小且相互隔離，更易受到瓶頸效應和遺傳漂變的影響，導致黑虎耳草呈現(xiàn)較低的遺傳多樣性。

3.2 保護生物學建議

狹域分布的特有物種常呈現(xiàn)出較低的遺傳多樣性，更易受到環(huán)境波動和人類活動的影響，成為保護生物學關注的熱點[3-4]。青藏高原地理拓撲結構復雜、生境多樣、生態(tài)位分化明顯，是世界生物多樣性熱點地區(qū)，也是世界上特有種密度最高的地區(qū)之一[58]。黑虎耳草為狹域分布的特有物種，只分布在祁連山區(qū)，生于高寒草甸和流石灘。該物種各居群間相互隔離，每居群個體數(shù)較少。較小的居群常不足以抵消遺傳漂變、近交衰退及生境隨機波動的影響[3]。

所幸的是，黑虎耳草的絕大多數(shù)居群位于祁連山國家公園范圍內，最大限度地限制了人類活動對該物種的影響，有助于該物種居群大小的穩(wěn)定和增長。居群遺傳分布格局研究有助于保護策略的制定，可以在自然居群中最大限度地保存物種的遺傳多樣性。值得注意的是，固定特有單倍型或基因型最多的2個居群P1和P8，位于祁連山國家公園范圍之外。建議對這些區(qū)域進行持續(xù)穩(wěn)定的生態(tài)監(jiān)測，避免放牧強度過高，維持生態(tài)系統(tǒng)的相對穩(wěn)定，需要時可以對這2個居群進行種質資源搜集并實施遷地保護。黑虎耳草作為一種藏藥，嘗試開發(fā)其規(guī)模繁殖的方法可以減輕對野生資源的需求壓力，對保護其多樣性也有一定積極意義。