祝亞芳，黃興波，程金鳳

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵 712100)

生物結(jié)皮(biological crusts)是在土生藻類拓殖作用下，由微小生物及其代謝產(chǎn)物與沙粒組成[1-3]，是水分、有機(jī)物與土壤顆粒緊密結(jié)合在土壤表層形成的一種殼狀體[4]，廣泛地分布在干旱半干旱地區(qū)，其生物組成主要有藻類、地衣、苔蘚，以及真菌、細(xì)菌等[5-6]。其中的藻類是分布在土壤環(huán)境中的土生藻類，在生物結(jié)皮中占據(jù)重要組分[7]。土生藻類能利用自身的固碳、固氮作用增加土壤有機(jī)物含量[8-9]，并通過(guò)藻體及其分泌物粘固沙粒形成活性生物結(jié)皮，從而提高土壤的生物活性[10]，改善土表理化性質(zhì)，起到抗風(fēng)蝕的作用。可見(jiàn)生物結(jié)皮中的藻類對(duì)固定土壤和促進(jìn)養(yǎng)分循環(huán)具有極其重要的作用。

中國(guó)西北部的黃土高原是典型的干旱半干旱生態(tài)系統(tǒng)，面臨著水土流失等諸多生態(tài)問(wèn)題。在退耕還林的政策實(shí)施后，生物結(jié)皮便成為黃土高原典型的地表覆蓋類型，不同降雨量對(duì)其蓋度影響較大[11]。其中，李金峰等[12]在該地區(qū)發(fā)育初期的生物結(jié)皮中發(fā)現(xiàn)了50種藻類，大多是藍(lán)藻和綠藻；楊麗娜等[13]對(duì)該地區(qū)生物結(jié)皮中的藍(lán)藻多樣性進(jìn)行了研究。對(duì)于黃土高原生物結(jié)皮藻類的研究常見(jiàn)為數(shù)量及分布的研究，而利用分子手段對(duì)生物結(jié)皮藻類群落的系統(tǒng)學(xué)研究較少。本研究將對(duì)黃土高原生物結(jié)皮中的7種純化藻類進(jìn)行形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定，并利用MrBayes 3.2.4對(duì)這幾種藻類進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析，為后續(xù)黃土高原生物結(jié)皮藻類的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

在陜北黃土高原不同區(qū)域的每塊樣地上，使用酒精浸泡過(guò)的環(huán)刀和土鉆采集生長(zhǎng)良好的生物結(jié)皮樣品(10 cm × 10 cm)。將采集完整的生物結(jié)皮除去石塊、植物根系等雜物后，保存到牛皮紙信封內(nèi)；將所有樣品編號(hào)標(biāo)記，陰干保存帶回實(shí)驗(yàn)室[14]，在超低溫冰箱中保存。各采樣地點(diǎn)見(jiàn)表1。

1.2 結(jié)皮藻類的培養(yǎng)與純化

1.2.1 結(jié)皮藻類培養(yǎng)選擇合適的錐形瓶并加入80 mL的BG-11[15]培養(yǎng)基后進(jìn)行滅菌處理、冷卻備用。將室外采集的生物結(jié)皮拿到實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，選取發(fā)育良好的生物結(jié)皮，放入錐形瓶中充分混勻后置于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將光照、光暗周期及溫度參數(shù)分別調(diào)至40%，10 h / 14 h，26 ℃，培養(yǎng)1周左右，培養(yǎng)期間隨時(shí)觀察生長(zhǎng)情況，避免生長(zhǎng)過(guò)旺或雜菌污染嚴(yán)重。

表1 陜北黃土高原生物結(jié)皮采樣點(diǎn)信息

1.2.2 藻類純化利用水滴稀釋法或平板法[16]對(duì)上述培養(yǎng)好的混合藻液進(jìn)行單藻種純化。首先將平板上長(zhǎng)出的單個(gè)群落挑出放在倒置顯微鏡下觀察，若形態(tài)一致，將其轉(zhuǎn)入裝有5 mL無(wú)菌培養(yǎng)液的小瓶子中培養(yǎng)；若形態(tài)不一致，則采用微吸管分離法或稀釋水滴分離法進(jìn)行純化。整個(gè)純化期間定時(shí)進(jìn)行鏡檢，直到觀察到的藻類形態(tài)一致為止，即純化完成。最后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液滴于載玻片上，制成臨時(shí)裝片，在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)皮微藻的形態(tài)并對(duì)其形態(tài)特征拍照。

1.3 單藻種的分子鑒定

1.3.1 DNA提取、擴(kuò)增與測(cè)序取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液，3 000 r/min離心10 min，收集沉淀，稱取少量放到2 mL的離心管中，用CTAB方法進(jìn)行基因組DNA提取。用于擴(kuò)增綠藻5.8S+ITS2的引物序列為：正向5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，反向5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[17]；用于擴(kuò)增藍(lán)藻的16S-23S rDNA的引物為：正向5′-TGTACACACCGGCCCGTC-3′，反向5′-CTCTGTGTGCCTAGGTATCC-3′[18]。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：ddH2O為9.5 μL、2×Taq MasterMix為12.5 μL、正反向引物各1 μL、DNA模板1 μL。擴(kuò)增完成后，雙向測(cè)序由西安擎科生物技術(shù)公司完成。

1.3.2 貝葉斯(BI)樹(shù)構(gòu)建測(cè)序完成后數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件Geneious 9.0.2中，進(jìn)行拼接處理，將處理好的序列提交至GeneBank，利用Blast搜索引擎中的nucleotide blastn下載若干同源序列。然后，對(duì)所有序列進(jìn)行比對(duì)、排矩陣后，用jModelTest計(jì)算合適模型，最后用MrBayes 3.2.4構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.3 遺傳距離分析遺傳距離計(jì)算在MEGA 7.0中進(jìn)行，將剔除外類群序列的上述文件導(dǎo)入MEGA中，并對(duì)序列進(jìn)行分組處理，之后在Distance分析選項(xiàng)中計(jì)算遺傳距離三角矩陣，其計(jì)算模型選擇K2P。

2 結(jié)果與分析

2.1 7株結(jié)皮藻的形態(tài)特征

本次研究從生物結(jié)皮中共純化出7種藻類，其中有5種綠藻(編號(hào)分別為SM-2-1、DB-2-1、DB-2-2、SD-1、SD-2)和2種藍(lán)藻(編號(hào)分別為YJ-3和YJ-2)。

(1)綠藻：SM-2-1細(xì)胞為長(zhǎng)圓形，兩端具有突出的尖，常見(jiàn)1或2個(gè)細(xì)胞組成，外有明顯的膠被包裹，細(xì)胞長(zhǎng)約16.7 μm，色素體片狀周生，胞內(nèi)有1個(gè)明顯的蛋白核(圖1 a，b)。DB-2-1常見(jiàn)為2或4個(gè)細(xì)胞，由透明膠被包裹聚集，單個(gè)細(xì)胞為圓球形，直徑約為13.3 μm，色素體呈不規(guī)則狀周生，常見(jiàn)1個(gè)蛋白核(圖1 c，d)。DB-2-2為球形細(xì)胞，胞外有透明的膠被物質(zhì)，常由數(shù)個(gè)細(xì)胞組成，個(gè)體大小差異較大(直徑在15～40 μm間)，色素體均勻分布在藻體細(xì)胞內(nèi)部，有多個(gè)蛋白核(圖1 e，f)。SD-1細(xì)胞為梭形或紡錘狀且兩端有細(xì)長(zhǎng)的喙?fàn)钅┒?，整個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)約80 μm，兩細(xì)長(zhǎng)的喙?fàn)钅┒嘶疽恢拢伢w片狀分布在兩端、中間分布較少，具有1個(gè)蛋白核(圖1 i，j)。SD-2藻體呈單細(xì)胞圓球形，直徑約20 μm，個(gè)體間分散生長(zhǎng)，色素環(huán)狀分布在細(xì)胞上，具有蛋白核(圖1 g，h)。

藻類照片均為100倍油鏡下的光學(xué)照片(標(biāo)尺=10 μm)。其中，a、b.SM-2-1； c、d.DB-2-1； e、f.DB-2-2；g、h.SD-2;i、j.SD-1； k～m.YJ-2； n～p.YJ-3圖1 7種結(jié)皮藻的形態(tài)特征The above photos of algae are optical photos under 100x oil microscope, bar=10 μm. a, b. SM-2-1; c, d. DB-2-1; e, f. DB-2-2; g, h. SD-2; i, j. SD-1; k-m. YJ-2; n-p. YJ-3Fig.1 Morphological characteristics of seven species of biological crust algae

(2)藍(lán)藻：YJ-3的藻絲體外側(cè)有明顯的鞘，常見(jiàn)鞘內(nèi)多個(gè)藻絲體有規(guī)律地纏繞在一起呈束狀，有時(shí)鞘內(nèi)也只出現(xiàn)一個(gè)藻絲體，鞘有收縊現(xiàn)象，單個(gè)藻絲體寬約8.4 μm，束狀寬約33.3 μm，細(xì)胞長(zhǎng)寬分別為6.3 μm和3.0 μm，藻體呈藍(lán)綠色(圖1，n～p)。YJ-2通常單個(gè)藻絲體出現(xiàn)，有時(shí)也會(huì)多個(gè)藻絲相互纏繞出現(xiàn)，細(xì)胞間有收縊，細(xì)胞長(zhǎng)約3.2 μm，寬約1.6 μm，無(wú)外鞘，藻體呈藍(lán)綠色(圖1，k～m)。

2.2 藻株核酸序列分析

從形態(tài)上初步斷定5株編號(hào)為SM-2-1、DB-2-1、DB-2-2、SD-1和SD-2的結(jié)皮藻為綠藻門(mén)植物，進(jìn)行5.8S+ITS2核酸序列擴(kuò)增，序列長(zhǎng)度分別為664 bp、663 bp、662 bp、589 bp和688 bp，其中GC含量分別為33.43%、49.47%、50.15%、50.76%和51.01%；藻株YJ-3和YJ-2判定為藍(lán)藻，16S-23S rDNA序列擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為570 bp和465 bp，序列GC含量分別為46.31%和49.03%，圖2為7株結(jié)皮藻擴(kuò)增片段電泳圖。利用Blast搜索引擎中的nucleotide blastn對(duì)獲得的5.8S+ITS2序列和16S-23S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示如下：

SM-2-1藻株5.8S+ITS2序列與Acutodesmusreginaes CCAP 27666(JQ082326)的比對(duì)序列相似度最高(96%)，存在2個(gè)堿基差異位點(diǎn)。DB-2-1藻株與多條比對(duì)序列相似性均高達(dá)100%，無(wú)堿基差異。DB-2-2藻株序列與雨生紅球藻H(HaematococcuspluvialisH，GQ463618)序列高度相似(99%)，同時(shí)與多種衣藻目(Chlamydomonadales)藻株序列相似(95%左右)。SD-1藻株比對(duì)序列與水生境中的環(huán)藻科Ankyra屬兩藻株序列[19](HQ219412、HQ219430)只發(fā)現(xiàn)一個(gè)堿基差異點(diǎn)，相似度高達(dá)97%，與Atractomorphaporcatastrain SAG 71.90(KM020065)的5.8S+ITS2序列相似性為91%，存在22個(gè)堿基差異位點(diǎn)。SD-2的5.8S+ITS2序列與真眼點(diǎn)藻科(Eustigmataceae)多個(gè)藻株序列高度相似，其中與大真眼點(diǎn)藻(EustigmatosmagnusSAG 2370)存在1個(gè)堿基差異位點(diǎn)，序列相似性高達(dá)99%。藻株YJ-3的16S-23S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)GeneBank中比對(duì)出來(lái)的序列相似度都不高，其中序列相似度最高的是偽魚(yú)腥藻科(Pseudanabaenaceae)藻株，僅為87%，且有10個(gè)位點(diǎn)存在差異。藻株YJ-2的16S-23S rDNA比對(duì)序列與細(xì)鞘絲藻屬(Leptolyngbya)藻株序列相似度高，其中與Haloleptolyngbyasp. PMC 895.15(MH182758)的比對(duì)序列相似度最高(100%)，無(wú)堿基差異。

圖2 7株結(jié)皮藻DNA擴(kuò)增片段電泳圖Fig.2 The electrophoresis patterns of DNA amplified fragments of seven species from biological crust algae

2.3 BI樹(shù)與遺傳距離分析

2.3.1 結(jié)皮綠藻系統(tǒng)樹(shù)分析將結(jié)皮分離藻株的5.8S+ITS2序列或16S-23S rDNA序列進(jìn)行同源比對(duì)后，下載一些相似性高的序列，通過(guò)剪切、排矩陣后，利用MrBayes 3.2.4軟件進(jìn)行建樹(shù)分析。

對(duì)結(jié)皮綠藻的BI樹(shù)(圖3)進(jìn)行分析可以得出，這5株綠藻可分為4個(gè)分支，從上到下分別為柵藻科(Scenedesmaceae)、衣藻目(Chlamydomonadales)、環(huán)藻科(Sphaeropleaceae)、真眼點(diǎn)藻科(Eustigmataceae)。其中，DB-2-1和SM-2-1 都屬于柵藻科。DB-2-1與Scotiellopsisreticulate的4個(gè)物種聚在一支且支持率為100%，且與這4株藻之間的遺傳距離均為0.000，綜合兩種分析結(jié)果得出DB-2-1藻株應(yīng)該歸于Scotiellopsis屬。SM-2-1與Acutodesmusreginae單獨(dú)聚在一起，支持率為64%，兩者間的遺傳距離最小(0.041)，并與NCBI相似性搜索比對(duì)結(jié)果一致，因此應(yīng)該歸于尖帶藻屬(Acutodesmus)。SD-1所在的分支為環(huán)藻科，與淡水生境的Ankyra屬藻株共為一支，支持率為82%，遺傳距離小于0.057，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與遺傳距離分析結(jié)果一致，而SD-1形態(tài)與Ankyra屬藻種形態(tài)極為相似，因此SD-1最有可能是環(huán)藻科Ankyra屬物種。SD-2與真眼點(diǎn)藻科真眼點(diǎn)藻屬(Eustigmatos)藻株聚為一支，且與大真眼點(diǎn)藻SAG2370(EustigmatosmagnusSAG2370)的遺傳距離最小0.008，與真眼點(diǎn)藻屬的其他藻種的遺傳距離也都小于0.02，與同源比對(duì)結(jié)果相結(jié)合可確定SD-2最有可能是真眼點(diǎn)藻屬藻種(Eustigmatos)。DB-2-2與一種雨生紅球藻(HaematococcuspluvialisH)和一種土生紅球藻‘Haematococcussp.’(MF482915)聚為一支，支持率為84%，遺傳距離分別為0.005、0.026，通過(guò)對(duì)DB-2-2的形態(tài)觀察以及序列比對(duì)分析后，其應(yīng)歸于紅球藻屬(Haematococcus)。

圖3 5株結(jié)皮綠藻5.8S+ITS2的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Bayesian phylogenetic tree of 5.8S+ITS2 from five strains of green algae with biological crusts

2.3.2 結(jié)皮藍(lán)藻系統(tǒng)樹(shù)分析對(duì)藍(lán)藻貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)分析顯示，YJ-3和YJ-2聚在一大類分支偽魚(yú)腥藻科(Pseudanabaenaceae)中，從BI樹(shù)中能明顯的發(fā)現(xiàn)這2株藍(lán)藻分別歸于不同的屬。YJ-3與偽魚(yú)腥藻科(Pseudanabaenaceae)藻株KC525096聚為一支，支持率為100%，兩者間遺傳距離為0.273，遺傳距離值偏大，這與上述NCBI同源序列分析結(jié)果一致，因此YJ-3可能為偽魚(yú)腥藻科一新物種。YJ-2與細(xì)鞘絲藻屬(Leptolyngbya)的2個(gè)藻種歸為一個(gè)分支，節(jié)點(diǎn)支持率為100%，但YJ-2藻絲無(wú)鞘，同時(shí)遺傳距離較大分別為0.314和0.327，與其序列相似度最高的是Haloleptolyngbyasp.PMC895.15但兩者間的遺傳距離較遠(yuǎn)，因此YJ-2也有可能是細(xì)鞘絲藻屬(Leptolyngbya)親緣關(guān)系較近的一新物種。

圖4 2株結(jié)皮藍(lán)藻16S-23S rDNA的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Bayesian phylogenetic tree of 16S-23S rDNA from two strains of cyanobacteria with biological crusts

3 討 論

目前國(guó)內(nèi)對(duì)生物結(jié)皮藻類多樣性的研究主要依據(jù)其形態(tài)學(xué)特征來(lái)鑒定，該方法較為費(fèi)時(shí)且需要具有多年藻類形態(tài)鑒定經(jīng)驗(yàn)，但是多數(shù)藻類在不同環(huán)境及發(fā)育階段的形態(tài)特征會(huì)有所不同，因此僅憑形態(tài)學(xué)特征來(lái)進(jìn)行藻種鑒定是非常困難的。近年來(lái)，藻類分子系統(tǒng)學(xué)在其分類、系統(tǒng)發(fā)育發(fā)生和分子進(jìn)化等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[20-21]，多種DNA保守序列(如16S-23S、ITS等)分析越來(lái)越多地用于藻類分子系統(tǒng)研究中[18,22]，確保了鑒定的準(zhǔn)確性。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)形態(tài)觀察并利用5.8S+ITS2和16S-23S rDNA序列分別對(duì)純化的結(jié)皮綠藻與藍(lán)藻完成鑒定，為后續(xù)黃土高原生物結(jié)皮藻類的研究奠定部分理論基礎(chǔ)。

本研究對(duì)7種結(jié)皮藻的系統(tǒng)發(fā)育分析及形態(tài)鑒定可初步確定到屬的水平。在5株結(jié)皮綠藻5.8S+ITS2序列比對(duì)分析中發(fā)現(xiàn)，該序列在多數(shù)屬內(nèi)差異小、非常保守，極易確定到屬。DB-2-1屬于Scotiellopsis屬、SM-2-1屬于尖帶藻屬(Acutodesmus)，均隸屬于柵藻科。柵藻科植物體為真性定性群體，常見(jiàn)多個(gè)藻體細(xì)胞平行或上下交錯(cuò)排列、少數(shù)藻以單細(xì)胞，藻體形態(tài)多樣，只有1個(gè)周生色素體和一個(gè)蛋白核。DB-2-1與Veronika Kaufnerová[23]文中ScotiellopsisreticulateCCALA474的形態(tài)一致，無(wú)論是從形態(tài)還是序列分析都支持DB-2-1是Scotiellopsis屬中的一種。SM-2-1形態(tài)符合尖帶藻屬的描述[24]，但是尖帶藻屬胞外無(wú)膠被而該藻種胞外存在膠被，很有可能是該屬的新種。DB-2-2與雨生紅球藻 H(HaematococcuspluvialisH)同源性序列最為相似，同時(shí)與另外一株紅球藻屬野生藻株(MF482915)聚為一支，因此本文建議DB-2-2歸于紅球藻屬(Haematococcus)。SD-1形態(tài)特征較像弓形藻屬(Schroederia)，但系統(tǒng)發(fā)育分析與序列比對(duì)表明其為Ankyra屬物種，與Yong Jae Kim文中[25]對(duì)環(huán)藻Ankyrajudayi的形態(tài)描述相符，但是兩者生境截然不同，Ankyrajudayi為水生環(huán)境而SD-1則是在較為干旱的陜北黃土高原生物結(jié)皮中分離的，這與沙漠綠藻起源于淡水藻的推論相吻合。根據(jù)分析SD-2可能是真眼點(diǎn)藻屬(Eustigmatos)物種，而真眼點(diǎn)藻是一種單細(xì)胞土生藻，具有高產(chǎn)油和可溶性多糖特性，因此基于這兩方面的研究較多，如吳桂秀等[26]。藻株SD-2在生物結(jié)皮中分離得到，與真眼點(diǎn)藻屬生境相符，可能對(duì)生物結(jié)皮的形成和發(fā)育起著極其重要的作用。另外2株結(jié)皮藍(lán)藻中，YJ-3經(jīng)分子序列分析表明其應(yīng)歸于偽魚(yú)腥藻科，與之歸為一支的偽魚(yú)腥藻(KC525096)生境為阿塔卡馬沙漠[27]，生境相同但在序列中存在多個(gè)堿基差異且遺傳距離值偏大，其較可能為偽魚(yú)腥藻內(nèi)的一個(gè)新種。YJ-3形態(tài)為多條藻絲組裝成緊密的繩索結(jié)構(gòu)，這種超強(qiáng)繩索結(jié)構(gòu)在功能上使藍(lán)藻能夠在泥沙及侵蝕的不穩(wěn)定環(huán)境中成為生態(tài)穩(wěn)定的開(kāi)拓者，在傳統(tǒng)分類學(xué)上又是幾個(gè)屬定義的基礎(chǔ)特性，特別是微鞘藻屬(Microcoleus)和水鞘藻屬(Hydrocoleum)[28]。YJ-2與BI樹(shù)中聚在同一分支的細(xì)鞘絲藻(Leptolyngbya)比對(duì)結(jié)果存在4%的堿基差異，而與藻株Haloleptolyngbyasp. PMC895.15相似度高達(dá)100%且無(wú)堿基差異，但是YJ-2與三者的遺傳距離都較遠(yuǎn)，而YJ-2形態(tài)觀察并無(wú)外鞘，可能為偽魚(yú)腥藻科細(xì)鞘絲藻屬親緣關(guān)系較近的一新物種。Patzelt D. J.[27]在對(duì)沙漠土壤藍(lán)藻多樣性的研究中可以看出細(xì)鞘絲藻屬(Leptolyngbya)呈現(xiàn)多樣性，在偽魚(yú)腥藻科多個(gè)分支中都有出現(xiàn)，還有部分以外類群出現(xiàn)，因此對(duì)于細(xì)鞘絲藻屬還需進(jìn)行深入的分類研究。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，在這7株結(jié)皮藻中，有一半的藻體外部形態(tài)特征具有鞘或者膠囊。這些鞘或者膠囊是微藻以不同形式排出的EPS[29]，能參與沙粒的黏附，促進(jìn)生物結(jié)皮形成。