張 悅，董 蕊，伊金月，邢懷玉，孫慧峰，張 寧, *，雷 霞*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007）

柚皮苷全稱為柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，是一種二氫黃酮類化合物。大量研究表明，柚皮苷具有抗腫瘤、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)血糖等藥理作用[1-6]。柚皮苷還能通過下調(diào)海馬中乙?；憠A酯酶活性和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）信號傳導(dǎo)途徑來消除順鉑引起的認(rèn)知缺陷和膽堿能功能障礙[7]。

臨床實踐表明，藥物的療效不僅與血液分布有關(guān)，與藥物在各組織內(nèi)的貯藏也密切相關(guān)，對藥物的有效性與安全性具有重要意義[8]。實驗室前期對柚皮苷在大鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)進行研究，結(jié)果顯示柚皮苷具有較好的組織親和性，給藥后能較快向組織分布。本研究通過UPLC-MS/MS 方法，檢測青年組、老年組SD 大鼠灌胃柚皮苷后在不同時間點、不同組織中的藥物濃度，比較在不同年齡段組織分布的差異，為柚皮苷的深度開發(fā)及利用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 儀器

ACQUITYTM 型超高效液相色譜儀、Quattro Premier? XE 型三重四級桿質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）；AL204 型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 材料

柚皮苷（純度 ≥ 98%，批號：110722-201111）、槲皮素（純度 ≥ 98%，批號：100081-201408）購自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈（色譜純）購自美國 Dikama 公司；水為實驗室自制超純水（美國Milli-Q 純水器）；其它試劑均為分析純。

健康Sprague-Dawley（SD）大鼠110 只，雌性，體質(zhì)量為210 ～ 250 g，55 只青年大鼠（8 月齡），55只老年大鼠（18 月齡），由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（黑）2013-004。實驗流程均符合實驗動物管理和保護的相關(guān)規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

ACQUITY UPLCTM BEH C18色 譜 柱（50 mm × 2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）-1%乙酸水（B）等度洗脫（52% A ∶48% B）；流速為0.3 mL/min；柱溫為35 ℃；洗脫時間為6 min；進樣量為5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

Quattro Premier? XE 型三重四級桿線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀連接ESI 電噴霧離子源，在正離子模式下進行多反應(yīng)檢測（MRM）掃描；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；離子源溫度：120 ℃；去溶劑溫度：300 ℃；接口處加熱，全程通入氮氣流速：600 L/h，氬氣：2.61×10-3Mbar，掃描時間：0.2 s。被測成分及內(nèi)標(biāo)的監(jiān)測離子對分別為柚皮苷（581.5 →273.2）、槲皮素（303.2 →153.1），被測物的錐孔電壓（Cone）和碰撞電壓（Collision）分別為20 V 和25 V。

2.3 溶液的配制

精密稱取柚皮苷、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品適量，配成濃度為200 μg/mL 的儲備液。4 ℃冷藏備用。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)組織樣品的制備

精密稱取各空白組織樣本約0.2 g，加入1 mL 生理鹽水，勻漿，取組織液0.5 mL，加入不同質(zhì)量濃度的柚皮苷對照品工作液20 μL，渦旋30 s，依次加入內(nèi)標(biāo)工作液20 μL 和2 mL 甲醇（0.1%乙酸），渦旋2 min，配制成一系列濃度范圍內(nèi)6 個濃度的對照品溶液，離心（4 ℃，12 000 r/min，10 min，下同），吸取上清液，40 ℃下用氮氣吹干，用100 μL 甲醇復(fù)溶，渦旋，離心，取上清液，進樣5 μL。其中以高、中、低質(zhì)量濃度制備質(zhì)量控制組織樣品，均平行制備6份。

2.5 組織樣品預(yù)處理

取各組織0.2 g，分別加入1 mL 的冰生理鹽水勻漿。取0.5 mL 組織勻漿液，置5 mL 的離心管中，加入2 mL 甲醇（0.1%乙酸），20 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋2 min，離心得上清液。40 ℃下用氮氣吹干，用100 μL甲醇復(fù)溶，渦旋，離心，取上清液，進樣5 μL。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 專屬性考察 在實驗條件下測得空白組織、空白組織加柚皮苷和內(nèi)標(biāo)及灌胃給藥后大鼠組織樣品（加內(nèi)標(biāo)）的色譜圖（以腎組織樣品為例），柚皮苷和槲皮素（內(nèi)標(biāo)）的保留時間分別為2.69、3.42 min，顯示各色譜峰之間分離度良好，表明大鼠組織中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾柚皮苷和內(nèi)標(biāo)的測定，本方法具有較高的專屬性，見圖1。

2.6.2 線性范圍考察 按照“2.4”項下得標(biāo)準(zhǔn)組織樣品，“2.1”“2.2”項下條件，以組織中待測物濃度為橫坐標(biāo)（X），以待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)（Y），用加權(quán)最小二乘法進行回歸運算，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2范圍均大于0.999 0，線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表1。

2.6.3 精密度和準(zhǔn)確度 分別取每個臟器的空白組織勻漿，根據(jù)“2.4”項下方法制備柚皮苷成分大鼠組織勻漿液低、中、高3 個濃度的質(zhì)量控制樣品，每一個濃度進行樣本分析，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時進行。根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算質(zhì)量控制樣品的濃度，獲得方法的精密度RSD 和準(zhǔn)確度范圍相對誤差RE。結(jié)果表明柚皮苷日內(nèi)和日間精密度的RSD 均小于15%，RE為-7.62%～12.24%。提示該方法準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好，符合生物樣品分析要求。

圖1 腎組織UPLC-MS/MS 色譜圖Fig. 1 UPLC-MS/MS chromatogram of kidney tissue

表1 不同組織樣品中柚皮苷的含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab. 1 Determination standard curve of naringin in different tissue samples

2.6.4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) 取大鼠空白組織勻漿液500 μL，根據(jù)“2.4”項下方法分別制備6 份低、中、高濃度的質(zhì)量控制樣品，并使用當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線進行測定，進樣，記錄其與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為A；取空白組織，按照組織樣品處理方法制備，氮吹后分別加入相應(yīng)量的質(zhì)量控制樣品，平行進行樣本分析，記錄其與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為B ；用水代替空白組織，分別加入配制的低、中、高濃度的質(zhì)量控制樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法進行處理，平行進行樣本分析，記錄其與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為C。其中回收率= A/B×100%，基質(zhì)效應(yīng) = B/C×100%。對柚皮苷線性范圍內(nèi)低、中、高濃度各組織勻漿液樣品提取回收率進行了考察，平均回收率的RSD 值均小于15%，符合生物樣品測定要求。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗 分別測定柚皮苷低、中、高3個濃度各組織勻漿液質(zhì)量控制樣品在室溫下放置4 h后、放置于-20 ℃的冰箱內(nèi)反復(fù)凍融3 次和放置于-20 ℃的冰箱內(nèi)冷凍30 d 后樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果表明在上述保存條件下，樣品均能達(dá)到穩(wěn)定性的要求。

2.7 組織分布的研究

大鼠青年組和老年組分別隨機分成9 組，每組6 只。按100 mg/kg 體質(zhì)量灌胃給予柚皮苷水溶液，分別在給藥后0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0 h 立即處死，迅速取出心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、子宮、卵巢、小腸，用生理鹽水溶液洗去血跡，用濾紙吸干水分。按“2.4”項下方法處理組織樣品，按“2.1”“2.2”項下方法檢測大鼠給藥后各組織中柚皮苷的含量。

青年組和老年組大鼠口服柚皮苷溶液后，在所有組織中都有分布；在0.25 h和0.5 h時，與青年組比較，老年組柚皮苷在心、肝、脾、肺、腎、胃、卵巢、小腸組織中濃度顯著低于其在青年組組織中濃度；給藥1 h 時，柚皮苷在老年組心、腎、卵巢、小腸中濃度比青年組大鼠低；而胃、子宮中濃度比青年組大鼠高；2 h 時，卵巢中濃度比青年組大鼠高；4 h 時，心、脾、腎、胃、卵巢、小腸中濃度比青年組大鼠高；8 h 時，脾、腎、子宮、卵巢、小腸中濃度比青年組大鼠高；12 h 時，心、腦、子宮中濃度比青年組大鼠高，見表2。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS23.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨立樣本t 檢驗。以P ＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 給藥后柚皮苷在大鼠體內(nèi)的分布情況（±s，n = 6，ng/g）Tab. 2 Distribution of naringin in rats after administration（±s，n = 6，ng/g）

表2 給藥后柚皮苷在大鼠體內(nèi)的分布情況（±s，n = 6，ng/g）Tab. 2 Distribution of naringin in rats after administration（±s，n = 6，ng/g）

時間/ h 心臟 肝臟 脾青年 老年 青年 老年 青年 老年 0.25 41.58±4.51 26.11±3.45** 4 936.58±330.20 4 105.34±429.94** 1 627.19±124.00 1 173.72±78.59** 0.5 506.47±24.26 295.25±21.54** 7 268.61±395.05 6 631.27±745.39 3 468.22±262.72 2 870.39±152.06** 1.0 1 278.64±49.92 936.61±92.36** 9 269.96±646.05 8 443.94±1060.23 8 246.09±551.64 8 531.92±556.78 2.0 157.31±20.14 146.72±6.15 7 583.71±787.96 4 896.26±491.92** 6 830.49±585.66 6 710.72±510.26 4.0 42.76±9.33 62.38±3.84** 3 623.72±362.74 2 778.14±260.69** 4 189.27±416.24 5 130.46±667.68* 8.0 33.32±7.7 35.93±3.84 6 881.85±751.91 5 843.26±310.27* 231.92±74.54 1 536.87±167.26**12.0 9.89±3.96 18.92±2.41** 115.49±62.26 106.88±11.51 78.97±21.74 245.95±29.31 F 2 497.409 509.824 196.373 136.354 460.890 378.736 P ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001時間/ h 肺 腎 腦青年 老年 青年 老年 青年 老年 0.25 3 858.95±9.89 3 591.54±220.05** 5 235.55±115.49 3 335.82±242.94** 314.34±78.97 269.49±12.82 0.5 6 138.87±598.91 6 269.49±374.61 7 820.16±565.82 4 285.43±368.39** 816.53±115.94 732.59±44.44 1.0 8 217.89±578.41 8 691.47±292.61 8 834.72±428.54 7 643.54±679.76** 631.63±107.61 505.19±134.83 2.0 7 721.50±389.00 4 379.33±248.58** 6 205.44±410.27 4 931.42±296.72** 532.41±65.51 434.02±17.2** 4.0 3 518.14±481.57 3 085.29±172.08 1 574.13±114.95 2 268.15±76.36** 414.84±47.41 346.20±20.99* 8.0 430.78±188.4 419.16±34.38 290.39±73.26 881.29±18.56** 269.11±37.58 192.69±8.18**12.0 129.26±45.53 134.68±11.09 15.25±3.07 169.61±4.41 29.82±12.21 69.49±3.23**F 399.643 1 063.667 788.693 365.264 71.173 94.746 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001時間/ h 胃 子宮 卵巢青年 老年 青年 老年 青年 老年 0.25 1 744.17±129.26 1 356.43±64.55** 1 744.17±129.26 1 356.43±64.55** 4 216.83±29.82 1 573.65±127.98** 0.5 4 165.53±368.70 3 841.09±30.58 4 165.53±368.70 3 841.09±30.58 6 332.58±242.19 2 594.63±323.17** 1.0 7 751.82±713.88 16 889.96±857.44** 7 751.82±713.88 16 889.96±857.44** 8 030.13±565.49 4 226.86±268.24** 2.0 8 090.61±661.89 7 533.78±399.73 8 090.61±661.89 7 533.78±399.73 3 701.02±418.34 8 831.37±786.23** 4.0 3 094.10±276.92 3 552.56±121.85** 3 094.10±276.92 3 552.56±121.85** 2 268.39±358.19 7 630.55±968.77** 8.0 329.75±87.53 387.53±19.85 329.75±87.53 387.53±19.85 182.99±35.06 528.88±30.07**12.0 12.14±4.8 13.21±1.61 12.14±4.8 13.21±1.61 - 47.62±3.51 F 383.993 1 608.707 383.993 1 608.707 551.326 284.605 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

注：與青年組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；“-”：未檢測到。

3 討論

研究藥物在機體組織中的分布特征是藥代動力學(xué)的重要組成之一，通過了解藥物在組織器官的分布情況，對于確定藥物在靶點的濃度是否能夠調(diào)節(jié)分子靶點，從而產(chǎn)生最佳的藥效學(xué)反應(yīng)至關(guān)重要[9]。

大鼠口服柚皮苷后，在0.25 h 時各組織中均能檢測到，說明柚皮苷分布較迅速而且廣泛。由組織分布結(jié)果可知，相對其它組織，柚皮苷更多地分布在肝臟中，提示柚皮苷可能主要在肝臟代謝。但在青年大鼠的心和腦中分布較少；在老年大鼠的胃、腸和卵巢中分布較多，卵巢作為性器官，與體內(nèi)雌激素的分泌密切相關(guān)，且隨著年齡的增加，體內(nèi)雌激素的含量逐漸減少，為柚皮苷等黃酮化合物具有與雌激素的作用提供研究思路。值得注意的是，雖然柚皮苷在腦組織中含量較低，但有明顯分布，提示柚皮苷能夠透過血腦屏障，為解釋其具有抗老年癡呆、保護神經(jīng)元損傷等神經(jīng)藥理作用[10-11]提供了實驗依據(jù)。各組織濃度在達(dá)峰值時，柚皮苷在老年組大鼠心臟、肝臟、脾、肺、腎、胃、子宮中比青年組濃度低，而達(dá)峰之后的時間里，心、脾、腎、胃等組織中柚皮苷的濃度，老年組比青年組濃度高。說明柚皮苷在老年組大鼠體內(nèi)存留時間延長，可能存在藥物蓄積趨勢。這可能是因為年齡影響了機體內(nèi)藥物代謝酶、轉(zhuǎn)運蛋白、內(nèi)源性生物因子等的改變，具體原因有待進一步的研究。

4 結(jié)論

本研究利用UPLC-MS/MS 法測定柚皮苷灌胃給藥后在不同年齡大鼠體內(nèi)多種組織的藥物濃度，方法簡單、快速、準(zhǔn)確，可用于不同組織中柚皮苷含量的測定，后續(xù)將進一步研究不同給藥劑量、不同給藥途徑對柚皮苷分布的影響及藥物代謝動力學(xué)特征，為闡明其在體內(nèi)動態(tài)變化和代謝情況的研究奠定基礎(chǔ)。