王轉(zhuǎn)娥，吳永濤

（1.海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院，海南 ?？?570228；2.甘肅省張掖市氣象局，甘肅 張掖 734000）

水稻是中國重要的糧食作物，種植面積常年在3000萬hm2左右，水稻生產(chǎn)肩負(fù)著保衛(wèi)中國糧食安全的重要責(zé)任[1]。近幾年來，水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展快速，水稻基因飄流研究的熱度越來越高。我們獲取水稻基因飄流規(guī)律的主要方法之一是田間試驗(yàn)。Song等[2-3]通過設(shè)計長方形試驗(yàn)，研究得出明恢63向普通稻的最大基因飄流距離為43.2m，明恢63向紅稻和普通野生稻的最大基因飄流率分別為0.011%～0.046%和1.21%～2.94%；Messeguer等[4]采用了同心圓的設(shè)計，研究了轉(zhuǎn)基因水稻在不同方向的基因飄流率，研究表明轉(zhuǎn)基因水稻在不同方向上向非轉(zhuǎn)基因水稻品種Senia和紅稻的最高基因飄流率為0.53%；戎俊等[5]得出常規(guī)稻品種Huangkenuo和Shangyou-63之間的基因飄流率為0.04%～0.18%；程林等[6]得出轉(zhuǎn)基因水稻向不同受體的基因飄流率有顯著差異，基因飄流率不但與受體的異交特性緊密相關(guān)，還與試驗(yàn)地的風(fēng)向、風(fēng)速等氣象因素有關(guān)。

水稻轉(zhuǎn)基因逃離的重要路徑之一是花粉介導(dǎo)的基因飄流[7]。在這個過程中，基因飄流率是花粉擴(kuò)散過程和受精結(jié)實(shí)過程的綜合結(jié)果?；ǚ圩鳛檫z傳物質(zhì)的承載體，花粉濃度決定了基因飄流率的分布[8]，表現(xiàn)在基因飄流率和花粉濃度均隨著距離的增加而呈現(xiàn)負(fù)指數(shù)衰減[9]。但是在以往的研究中，很少有直接觀測水稻花粉擴(kuò)散的。其中，Song等[2]設(shè)計了6個不同面積的花粉源，處理了1-5個面積分別是半徑為0.3m、0.6m、1.2m、2.4m和4.8m的圓形花粉源，第6個處理為103.6m的矩形花粉源，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水稻花粉的擴(kuò)散隨著與花粉源之間距離的增加而減少，在給定的范圍內(nèi)，花粉濃度與花粉源大小呈正相關(guān)關(guān)系。但是，上述田間試驗(yàn)存在的最大缺陷就是花粉源面積。Song等、Scheffler和Timmons通過對比不同面積的花粉源發(fā)現(xiàn)，花粉源大小也是影響花粉傳播距離的一個重要因素，花粉濃度會隨著花粉源面積的增大而增加。未來轉(zhuǎn)基因水稻商業(yè)化種植后，轉(zhuǎn)基因水稻的面積將遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過目前水稻試驗(yàn)中的花粉源面積，目前試驗(yàn)中只有半徑為0.3m、0.6m、1.2m、2.4m和4.8m的圓形，邊長為5m、10m和15m的正方形以及面積為6310m2的矩形花粉源。由此可以推斷，當(dāng)前對于轉(zhuǎn)基因水稻的基因飄流風(fēng)險存在明顯的低估。

在上述研究背景下，本研究共設(shè)計了5m×5m（T1）、10m×10m（T2）、15m×15m（T3）和 340m×130m（T4）4 種花粉源面積，由有效穗數(shù)、每穗的開花穎花數(shù)和單個穎花的花粉量的實(shí)測值計算出各個處理的花粉釋放量；根據(jù)主風(fēng)向上不同距離的花粉沉降量和對應(yīng)的氣象數(shù)據(jù)，運(yùn)用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖，描述不同處理的花粉沉降量在時空分布上的特征，以期為合理規(guī)劃轉(zhuǎn)基因水稻的隔離距離提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計

在2017年4-11月份的江蘇省鎮(zhèn)江市京口區(qū)新民洲共青團(tuán)農(nóng)場進(jìn)行了該試驗(yàn)。試驗(yàn)中所選用的兩個花粉源品種分別為“特秈占25”和“陵兩優(yōu)”。其中，“陵兩優(yōu)”于2017年4月20日播種，“特秈占25”于2017年5月8日播種。所有材料均于6月4日移栽，移栽密度為17cm×30cm?！傲陜蓛?yōu)”的開花期為7月4-14日，平均株高為0.8m?！疤囟i占25”的開花期為8月21-28日，平均株高為1.2m。以上試驗(yàn)的花粉源采用正方形和矩形兩種設(shè)計方式，設(shè)置4個處理。其中，“陵兩優(yōu)”試驗(yàn)有3個處理，花粉源面積分別是 5m×5m（T1）、10m×10m（T2）、15m×15m（T3）；“特秈占 25”試驗(yàn)只有 1 個處理，花粉源面積為340m×130m（T4）。為了減少處理之間的相互干擾，“陵兩優(yōu)”試驗(yàn)采用距離隔離，T1、T2、T3垂直于盛行風(fēng)向依次排列，間隔距離超過40m?！疤囟i占25”試驗(yàn)采用花期隔離，通過調(diào)整花粉源的播種期，使之比其他水稻提前1-2個月開花。

1.2 試驗(yàn)觀測

1.2.1 氣象因子

為了得到實(shí)時的氣象資料，在兩個品種開花期間，試驗(yàn)田內(nèi)的空氣溫度和相對濕度由芬蘭產(chǎn)的HMP155A型溫濕度傳感器測得；風(fēng)速和風(fēng)向由美國產(chǎn)的010C和020C型風(fēng)速/風(fēng)向傳感器測得；太陽總輻射由美國產(chǎn)的LI200X型短波輻射傳感器測得。所有傳感器均安裝在試驗(yàn)田中央，其高度距離地面2.0m（距離冠層頂1.0m），實(shí)測所得的氣象數(shù)據(jù)由美國產(chǎn)的CR3000型數(shù)據(jù)采集器采集和存儲，采集器的采樣頻率為1Hz，每半小時存儲一次各氣象因子平均值。天氣情況由人工觀測記錄。

由以上方法得到的氣象數(shù)據(jù)可知，“陵兩優(yōu)”品種開花期間平均風(fēng)速為2.3m/s；主風(fēng)向?yàn)槟巷L(fēng)，空氣相對濕度為68.3%～84.1%；日平均氣溫為27.0℃～32.2℃。7月6日和7月8-10日有持續(xù)性降雨,這個時間段未進(jìn)行花粉擴(kuò)散的觀測，因?yàn)樵诮涤晏鞖鈼l件下即便有開放的穎花，花粉也會因過量吸水而膨脹破裂?！疤囟i占25”品種開花期間平均風(fēng)速1.32m/s；日平均氣溫為24.7℃～30.5℃；空氣相對濕度為-2.6%～10.6%。該時期沒有降水，風(fēng)速比較小且相對濕度很低，天氣干燥。

1.2.2 花粉釋放量

這里的花粉釋放量指的是從水稻花藥中能夠釋放到大氣中的最大花粉量。它包括花粉源面積和單位面積的花粉源強(qiáng)兩個量。單位面積的花粉源強(qiáng)（粒/m2）的算法是單位面積的有效穗數(shù)、每穗的開花穎花數(shù)和單個穎花的花粉量三者的乘積。水稻抽穗后，在每個處理中任意選取30穴，統(tǒng)計出每穴的有效分蘗數(shù)，然后乘以移栽密度，即可得到單位面積的有效穗數(shù)（穗/m2）。在開花期來臨前，每個處理采用隨機(jī)方式預(yù)先選取18個有效分蘗，自標(biāo)記的分蘗開始開花起直到開花結(jié)束（7月4-14日和8月21-28日），于7：00-16：00的每個整點(diǎn)剪去并記錄已開放的穎花，這就是每穗開花穎花數(shù)的日變化，將之累計求和，求得每個分蘗的開花穎花數(shù)。在開花盛期，采集尚未開放的穎花將其剝除穎殼后把花藥放入65℃的烘箱中干燥，待花藥完全裂開后，在離心管中加入20%的偏磷酸鈉（NaPO3）6溶液，振蕩搖勻成后制成6ml的花粉懸浮液。然后，利用血球計數(shù)板統(tǒng)計單位體積溶液中的花粉量，計算得到單個穎花的花粉量（?！しf花-1）。為了減少試驗(yàn)誤差，以上試驗(yàn)需重復(fù)3次。

1.2.3 花粉沉降量

本試驗(yàn)采用Durham法獲取花粉濃度，利用涂有凡士林的載玻片捕捉大氣中的花粉顆粒。因此，這里用花粉沉降量表示花粉濃度，即沉降到載玻片上的花粉密度（粒/cm2）。在開花期間，每日的7：00將涂有凡士林的載玻片水平放置在觀測支架上，觀測支架在田間的水稻冠層高度。每日的16：00收回全部的載玻片，其中7月4-5日和7月7日因?yàn)橄挛缬薪邓?，提前收回了載玻片。收回的載玻片用顯微鏡觀察花粉數(shù)量。為了減少花粉沉降量的觀測誤差，本研究在每個載玻片上按順序選取了50個視野，讀取了每個視野的花粉數(shù)量后，再除以視野面積，得到每日的花粉沉降量（粒/cm2·d-1），整個開花期的花粉沉降量之和為總的花粉沉降量（粒/cm2）。T1、T2、T3處理各有11個花粉沉降量的觀測點(diǎn)，相鄰觀測點(diǎn)之間的距離分別為 1m（T1）、2m（T2）和 3m（T3），T4 處理共有34個花粉沉降量的觀測點(diǎn)，相鄰觀測點(diǎn)之間的距離為10m，它們都位于花粉源的中軸線上，沿著風(fēng)向方向由南向北依次分布。其中T1、T2花粉源區(qū)內(nèi)有6個觀測點(diǎn)，下風(fēng)區(qū)也有6個觀測點(diǎn)，觀測點(diǎn)“O”位于花粉源區(qū)和下風(fēng)區(qū)邊界線上，是兩個區(qū)域共有的觀測點(diǎn)，T4在花粉源區(qū)內(nèi)有31個觀測點(diǎn)，下風(fēng)區(qū)有4個觀測點(diǎn)，由于面積比較大，所以大部分的觀測點(diǎn)都在花粉源區(qū)內(nèi)部。所有觀測點(diǎn)的高度均為穗頂高度。

1.3 計算比例

從花藥中釋放出來的所有花粉可分成兩部分：一部分是落在花粉源區(qū)內(nèi)，這些花粉不會發(fā)生基因飄流，對其他風(fēng)媒物種無風(fēng)險。另一部分花粉會擴(kuò)散至花粉源區(qū)以外，當(dāng)這些花粉落在其他稻種的柱頭上就會發(fā)生基因飄流。為了量化這種基因漂流風(fēng)險性，用有效源強(qiáng)比來反映這種風(fēng)險，即源區(qū)外的花粉沉降量占總花粉沉降量的比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉沉降總量的空間分布

經(jīng)T1、T2、T3、T4處理的花粉沉降總量均為先上升達(dá)到最大值然后再下降的試驗(yàn)結(jié)果，特別是由于T4處理的面積大，花粉沉降總量達(dá)到最大值后就不再增加，但是因?yàn)樗什痪囊蛩鼐蜁霈F(xiàn)振蕩情況?？梢姡?種處理空間變化趨勢大致相同，且最大值都出現(xiàn)在花粉源區(qū)內(nèi)部。產(chǎn)生上述相同現(xiàn)象的原因包括兩個方面，首先，由于花粉的不斷釋放，大部分會沉降在花粉源內(nèi)，使得花粉沉降總量在距離增加時不斷增大。其次，由于風(fēng)速的影響，花粉從花藥中釋放出來后就會隨著風(fēng)向向下游擴(kuò)散稀釋，使得上風(fēng)向的一部分花粉被吹到下風(fēng)向，從而在花粉源區(qū)的下風(fēng)方向達(dá)到一個花粉沉降總量的最大值。當(dāng)接近花粉源區(qū)邊緣處時，花粉來源不斷減少，花粉源區(qū)外的花粉只能被風(fēng)帶動擴(kuò)散出去。所以在往花粉源外部擴(kuò)散時，花粉沉降總量會隨著與源區(qū)之間距離的增加而不斷下降，就使得空間分布特征大致呈先上升后下降的趨勢。但是，不同處理之間也是存在明顯差異的。首先，相同距離上的花粉沉降總量大小為T4＞T3＞T2＞T1，其最大值也在不斷增大。其中，T1為309.5粒/cm2、T2 為 390.9 粒/cm2、T3 為 450.9 粒/cm2、T4 為1242.45粒/cm2。其次，當(dāng)其面積越大時，花粉沉降總量的最大值距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，即越靠近花粉源內(nèi)部。T1、T2、T3、T4的最大值距原點(diǎn)的距離分別為2m、4m、6m、190m。最后，花粉源面積越大時，花粉向花粉源區(qū)外擴(kuò)散的距離越大，隨著T1、T2、T3、T4面積增大，其擴(kuò)散到源區(qū)外的距離分別為5m、10m、15m和30m。

造成處理間差異的原因是：隨著花粉源面積的不斷增大，4種處理的釋放量也幾乎成倍增加，這使得相同距離上的花粉沉降總量也在不斷增長。此外，風(fēng)速、溫度、濕度等氣象條件在空間上的分布也會對花粉的擴(kuò)散產(chǎn)生一定影響：風(fēng)速越大，擴(kuò)散距離越大；在其他條件相同時，濕度越大，花粉含水量越大，花粉擴(kuò)散距離越小。由于花粉里面含有遺傳物質(zhì)，對于轉(zhuǎn)基因水稻而言，這些遺傳物質(zhì)中包括外源基因，如果擴(kuò)散超出花粉源區(qū)的范圍，就有可能落在其他非轉(zhuǎn)基因品種的柱頭上受精結(jié)實(shí)，從而帶來基因污染和其他生態(tài)問題。因此，這里計算了花粉源外部的花粉沉降總量占花粉釋放總量的比例。如表1所示，隨著面積的增大，擴(kuò)散出去的花粉也越來越多，但是增加幅度和占比卻越來越小。我們可以推測隨著花粉源面積繼續(xù)增大，花粉源外部的花粉沉降總量會趨向于一個定值。當(dāng)研究面積小于這個花粉沉降總量臨界值的面積時，由此所得到的基因飄流率就會被低估。

表1 不同處理花粉源外部花粉沉降總量占內(nèi)部沉降總量的比例

2.2 花粉沉降量的時間變化

花粉沉降量的時間變化具有相同點(diǎn)，3種處理方式的花粉沉降量均從起始值先上升到峰值后再下降。其中，7月4日至7月7日，3種處理的花粉沉降量都比較低，平均值為 T1：23.57 粒/cm2、T2：25.67 粒/cm2、T3：31.96粒/cm2。7月7日至11日，由于降雨，未對花粉沉降量進(jìn)行觀測。7月12日天氣轉(zhuǎn)晴后，花粉沉降量增加迅速達(dá)到峰值，然后又下降。T4在8月21日至24日先是上升到23日的峰值148.51粒/cm2，然后下降到47.72粒/cm2。其次，7月4和14日、7月5和7日以及7月12和13日這三個時間段的花粉釋放量大致相同，而此時T1、T2、T3的花粉沉降量最大值都有相同的差異性，花粉沉降量7月14日＞7月4日、7月7日＞7月5日、7月12日＞7月13日，而且面積越大其差值越大?？梢?，T1、T2、T3花粉沉降量時間變化趨勢大致相同，最大值都出現(xiàn)在同一天。

但是，不同處理之間也有明顯的差異。第一，T1、T2、T3 這 3 種處理每日的花粉沉降量 T3＞T2＞T1，且 T1、T2、T3的花粉沉降量的峰值分別為92.52粒/cm2、126.42粒/cm2、152.09粒/cm2。第二，其花粉沉降量的增加并不隨面積成倍增加。T2、T3的峰值分別為T1的1.36倍和1.64倍，并且增加幅度在逐步減小。第三，T1、T2、T3共用9天時間才達(dá)到花粉沉降量的峰值，而T4用了3天時間就達(dá)到了第一個峰值，在花粉沉降速度上T4明顯大于T1、T2和T3。第四，T4在8月21日至8月28日的時間段內(nèi)，它的時間變化曲線出現(xiàn)了兩個峰值，而T1、T2和T3只有一個峰值。由此可見，T1、T2、T3雖然隨時間的變化趨勢大致相同，但是其日花粉沉降量卻有差異，且花粉沉降速度都不相同。

形成上述現(xiàn)象的內(nèi)因是花粉釋放量的變化以及花粉源面積的不同。如圖1所示，花粉釋放量的變化是從5.70×105粒/穴開始先略微降低然后一直增大到最大值9.41×105粒/穴之后再下降。由于7月4日至7月7日是陰雨天氣，所以花粉釋放量都很少且釋放量大致相同，進(jìn)而影響了花粉沉降，因此，T1、T2、T3的值都比較低且大致相等，它們的時間變化特征也大致相同。7月11日后由于天氣轉(zhuǎn)晴，花粉釋放量和沉降量均迅速增加，7月12日花粉釋放量達(dá)到最大值，此時T1、T2、T3的花粉沉降量也達(dá)到了峰值，分別是T1為92.52粒/cm2、T2 為 126.43 粒/cm2、T3 為 152.09 粒/cm2，然后花粉釋放量減少，所以花粉釋放量的變化趨勢直接導(dǎo)致了T1、T2、T3具有相同的變化趨勢。其次，面積的不同造成了每日沉降量 T4＞T3＞T2＞T1 的結(jié)果，T2、T3、T4面積分別為T1面積的4倍、9倍和1768倍，而且由于T4的面積大得多，所以其相同時間內(nèi)的花粉釋放量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他三種處理，且花粉沉降量達(dá)到峰值的時間也更短。

圖1 花粉釋放量變化特征

形成上述現(xiàn)象的外在原因是氣象條件，直接原因是風(fēng)速、溫度等的直接作用。溫度上升時，會促進(jìn)花粉的釋放和花粉的擴(kuò)散；風(fēng)速增大時，會將花粉從花藥中吹出來；濕度對花粉的釋放也有一定的影響，濕度比較大時，花藥含水量增加不利于花粉從花藥中釋放出來。

間接原因是水稻品種和生育期特性對氣象條件的選擇。水稻花粉源強(qiáng)一方面是由開花習(xí)性決定的，開花量隨時間的變化為正態(tài)分布或泊松分布[10]，主要由品種特性決定；但氣象條件也會影響水稻開花，最適溫度為28℃-32℃，最適相對濕度為80%-90%，當(dāng)氣溫低于20℃、相對濕度低于60%或者有露水時，不利于穎花開放，散粉期將延長[11]。氣象因子對不同品種的影響程度不同，影響秈稻開花的主要?dú)庀笠蜃邮菧囟?，次要是風(fēng)和日照；對于粳稻而言，溫度、濕度是影響其開花的主要因素，其次是日照[12]。另一方面，氣象條件也影響著花粉從花藥中脫落。有學(xué)者的研究表明，有風(fēng)時，植株晃動可以加速花粉的脫落。

3 結(jié)論

水稻花粉是遺傳物質(zhì)的承載體，會在風(fēng)的作用或者其他動物的傳播下擴(kuò)散到其他地方。當(dāng)它們落在花粉源區(qū)外的其他品種上受精結(jié)實(shí)時就會發(fā)生基因飄流。因此當(dāng)評估轉(zhuǎn)基因水稻的基因飄流遇到風(fēng)險時，水稻花粉擴(kuò)散規(guī)律對其有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

首先，花粉來源直接決定花粉量的多少，所以決定花粉擴(kuò)散的內(nèi)在因素是花粉源強(qiáng)。因?yàn)樽魑锲贩N不同，其開花特性也存在差異，這種特性的差異造成作物花粉源強(qiáng)有著顯著的日變化。大多作物的散粉都是從日出后開始，在日出后4h左右達(dá)到頂峰[11]。但是由于每個試驗(yàn)都有不同的試驗(yàn)條件或存在試驗(yàn)誤差，且因?yàn)樽魑锲贩N、生育性狀的不同，以及其種類的差異，所以得到的花粉源強(qiáng)大小會有明顯的區(qū)別[12-14]。另外，由于不同的研究人員選擇的花粉源大小也有差別，所以這些人為原因同樣是造成花粉濃度存在明顯差異的重要因素[15-20]。

在轉(zhuǎn)基因飄流中我們密切關(guān)注的指標(biāo)之一是花粉擴(kuò)散距離。花粉擴(kuò)散距離決定著基因飄流的范圍，研究花粉擴(kuò)散距離對防范這種基因飄流風(fēng)險有著重要的意義。不同的研究中得出的花粉擴(kuò)散距離不同，花粉源大小對花粉擴(kuò)散的影響并沒有明確的結(jié)論。本研究設(shè)置了5m×5m、10m×10m、15m×15m 和 340m×130m 4種不同的花粉源大小，通過對比分析，對花粉源大小和花粉擴(kuò)散之間的聯(lián)系進(jìn)行了討論。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著花粉源面積的成倍增加，花粉沉降量并沒有成倍增加，且其擴(kuò)散到花粉源區(qū)外的花粉沉降量占源區(qū)花粉沉降總量的比例越來越小，分別為 T1：23%、T2：20%、T3：19%、T4：7%。雖然隨著面積的增大，擴(kuò)散到源區(qū)外的花粉量越來越多，但其增加趨勢在逐漸減緩，由此我們可以推測當(dāng)花粉源大小增加到一定的程度后，花粉沉降量將會趨向一個定值，花粉源面積再增大時花粉沉降量將不再增加，Rong[21]等人的試驗(yàn)因?yàn)榛ǚ墼疵娣e較小，所以無法發(fā)現(xiàn)這個飽和現(xiàn)象。