謝瑜杰, 陳 輝*, 蓋麗娟, 霍思宇, 范春林, 呂美玲

(1. 中國檢驗檢疫科學研究院, 北京 100176; 2. 北京合眾恒星檢測科技有限公司, 北京 100176; 3. 安捷倫科技(中國)有限公司, 北京 100102)

農(nóng)藥殘留是食品安全領域長期關注的問題之一。傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留主流檢測技術有氣相色譜-質(zhì)譜法[1]、氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法[2-7]和液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法等[8-14]。隨著農(nóng)藥種類的不斷增加,目前世界常用農(nóng)藥已經(jīng)增加到1 100多種[15],傳統(tǒng)農(nóng)藥殘留檢測技術已經(jīng)不能滿足實際檢測需求。

高分辨質(zhì)譜以其精確質(zhì)量數(shù)、高分辨率和不依賴標準品進行定性的優(yōu)勢[16,17],在食品中農(nóng)藥殘留高通量篩查方法中得到了廣泛應用[18,19]。例如,趙志遠等[20]應用液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(LC-QTOF/MS)建立281種農(nóng)藥的一級精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫和二級譜圖庫,并采用該數(shù)據(jù)庫和譜圖庫檢索的方式,實現(xiàn)了蘋果、番茄和甘藍中281種農(nóng)藥殘留的快速篩查。宋偉等[21]應用LC-QTOF/MS建立了204種農(nóng)藥的一級精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫和二級譜圖庫,通過化合物的精確質(zhì)量數(shù)、保留時間、同位素比值等信息對檢測結果進行自動檢索,從而在無對照標準品的情況下實現(xiàn)了204種農(nóng)藥的定性鑒定。在這些方法中,通常需要2次進樣篩查,即第一次進樣后通過加合離子、保留時間等信息對化合物進行初步篩查,第二次則是針對初篩化合物建立二級采集方法,通過與二級譜圖庫比對進行化合物確證。盡管這種方式進行農(nóng)殘篩查可以獲得較高的靈敏度,但是從快速、高效和節(jié)約成本的角度考慮,建立一次進樣的篩查方法可以顯著提高篩查效率[22]。

全自動MS/MS采集模式(Auto MS/MS)和全離子MS/MS采集模式(All Ions MS/MS)是LC-QTOF/MS中只需要一次進樣便可對化合物進行篩查的兩種采集模式。在Auto MS/MS模式中,輸入加合離子信息和碰撞能后,質(zhì)譜在一個循環(huán)時間內(nèi)交替對一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜進行掃描,根據(jù)一級和二級質(zhì)譜匹配情況對化合物進行確證[23]。在All Ions MS/MS采集模式中,選擇多個碰撞能通道進行采集,通過分析各通道化合物共流出的特征,得到加合離子和碎片離子的共流出關系,根據(jù)目標物的保留時間、加合離子和碎片離子的精確分子量等信息與數(shù)據(jù)庫進行檢索比對,最終對化合物進行確證[24,25]。

紫甘藍是一種常見的蔬菜,常見于蔬菜沙拉等非加熱類菜品中,在其種植過程中通常會施用多種農(nóng)藥。研究表明,紫甘藍屬于堿性蔬菜,其紫紅色葉片中色素含量非常豐富,不易凈化。紫甘藍由于自身基質(zhì)的復雜性,對其殘留的農(nóng)藥進行準確篩查的難度相對較大。本文以可篩查農(nóng)藥種數(shù)和假陰性農(nóng)藥種數(shù)作為指標,考察了Auto MS/MS和All Ions MS/MS兩種不同采集模式,最終選擇All Ions MS/MS采集模式。然后在選擇的采集模式下,建立了基于LC-QTOF/MS的紫甘藍中415種農(nóng)藥殘留快速篩查方法。將該方法應用于2019年能力驗證紫甘藍中農(nóng)藥殘留的篩查和定量,對該方法的準確性和可靠性進行了考察和驗證。與傳統(tǒng)兩次采集進行篩查的方法相比,本文建立的一次進樣對紫甘藍中農(nóng)藥多殘留進行定性篩查和定量測定的方法,提高了農(nóng)藥殘留篩查的效率,可以為水果和蔬菜中農(nóng)藥多殘留的快速篩查提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290 Infinity II LC-6545 Q-TOF/MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,配有雙噴射電噴霧電離源(美國Agilent公司), AH-30全自動均質(zhì)儀、Fotector Plus高通量全自動固相萃取儀、高通量真空平行濃縮儀(中國?？苾x器有限公司), SR-2DS水平振蕩器(日本Tatec公司), KDC-40低速離心機(安徽中佳公司), N-EVAP 112氮吹濃縮儀(美國Organomation Associates公司), Milli-Q超純水機(美國Millipore公司), PL602-L電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

415種農(nóng)藥標準品純度均≥95%(中國阿爾塔科技有限公司);甲酸和乙酸銨均為質(zhì)譜純;乙腈、甲苯為色譜純(美國Fisher公司);乙酸、氯化鈉、無水硫酸鈉和無水硫酸鎂均為分析純(中國安譜公司); Carbon/NH2柱(美國Agilent公司)。

1.2 標準溶液的配制

稱取10 mg(精確至0.01 mg)標準品,置于10 mL棕色容量瓶中,以甲醇定容至刻度,配制單標準儲備液,于-18 ℃避光保存;根據(jù)需要,移取適量儲備液,用甲醇稀釋,配制所需濃度的標準工作液,于4 ℃避光保存。

1.3 樣品前處理

提取:稱取紫甘藍樣品10 g,置于80 mL離心管中,加入1%醋酸乙腈40 mL,以13 500 r/min均質(zhì)1 min,加入1 g氯化鈉、4 g無水硫酸鎂,振蕩10 min,以4 200 r/min離心5 min,取上清液20 mL,在37 ℃、150 r/min條件下蒸發(fā)濃縮至約2 mL,待凈化。

凈化:在Carbon/NH2柱中加入約2 cm無水硫酸鈉,將Carbon/NH2柱放到自動固相萃取儀上。用4 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)活化SPE柱,并棄去流出液,每次用2 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)洗滌樣液瓶3次,并將洗滌液移入Carbon/NH2柱中。再用25 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)洗脫,合并洗脫液,置于試管中。在37 ℃、150 r/min條件下蒸發(fā)濃縮至約0.5 mL,并將濃縮液置于氮氣下吹干,加入1 mL乙腈-水(3∶2, v/v)混勻,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后,定容。

1.4 儀器條件

色譜柱:ZORBAX SB-C18柱(100 mm×2.1 mm, 3.5 μm);柱溫:40 ℃;流動相:A相為0.1%(v/v)甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸銨), B相為乙腈;流速:0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0～3 min, 1%B; 3～6 min, 1%～30%B; 6～9 min, 30%～40%B; 9～15 min, 40%B; 15～19 min, 40%～60%B; 19～23 min, 60%～90%B; 23～23.01 min, 90%～1%B; 23.01～27.01 min, 1%B。進樣體積:5 μL。

離子源:雙通路噴射流電噴霧電離(Dual AJS ESI)源;掃描方式:正離子全掃描;全掃描范圍:m/z50～1 000;毛細管電壓:4 000 V;霧化氣體:氮氣;霧化氣壓力:0.14 MPa;鞘氣溫度:375 ℃;鞘氣流速:11.0 L/min;干燥氣流速:12.0 L/min;干燥氣溫度:325 ℃;碎裂電壓:145 V。

All Ions MS/MS模式條件:0 min時,碰撞能為0 V; 0.5 min時,碰撞能分別為0、15和35 V。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 415種農(nóng)藥的分子式、保留時間(tR)、加合離子、定量離子和定性離子

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

2 結果與討論

2.1 高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的建立

2.2 采集模式的選擇和參數(shù)優(yōu)化

在基于QTOF/MS的高分辨質(zhì)譜中,要實現(xiàn)同時采集獲取一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜信息,可以通過兩種方式實現(xiàn)。一種是數(shù)據(jù)依賴的采集模式,如Auto MS/MS采集模式;另外一種是數(shù)據(jù)非依賴的模式,如All Ions MS/MS采集模式。本文分別對兩種模式下的參數(shù)進行優(yōu)化,并在各自最優(yōu)的條件下進行比較。

2.2.1Auto MS/MS采集參數(shù)的優(yōu)化

Auto MS/MS采集模式中,可以允許系統(tǒng)根據(jù)質(zhì)譜圖中m/z的響應強度來自動選擇母離子進行二級質(zhì)譜掃描,同時允許對指定化合物列表優(yōu)先進行二級質(zhì)譜掃描。為了保證優(yōu)化效果,本文根據(jù)農(nóng)藥化學性質(zhì)分類,選擇PCDL庫中的214種農(nóng)藥放入指定列表,并在其相應的保留時間窗口優(yōu)先采集其二級質(zhì)譜圖。在固定標準混合溶液質(zhì)量濃度為100 μg/L條件下,對Auto MS/MS采集模式的參數(shù)進行優(yōu)化。結果顯示,在固定一級質(zhì)譜采集速率下,隨著二級質(zhì)譜采集速率從2 spectra/s增加到6 spectra/s,篩查出的農(nóng)藥占比逐漸下降,同時假陰性農(nóng)藥的占比逐漸增加,采集速率為2 spectra/s時的篩查結果相對最佳,篩查出農(nóng)藥占比可以達到79.91%。因此,在采用Auto MS/MS模式時,二級采集速率建議設定為2 spectra/s，以盡可能提升檢出的農(nóng)藥占比,降低假陰性率。

2.2.2All Ions MS/MS優(yōu)化

數(shù)據(jù)非依賴的All Ions MS/MS模式是近年來發(fā)展起來的一種高效采集模式,采集時無需事先設置加合離子信息,可以針對采集的數(shù)據(jù),依據(jù)保留時間、加合離子和二級碎片離子的共流出輪廓匹配情況對化合物進行定性。因此,至少需要高低兩個能量通道以滿足定性和定量數(shù)據(jù)的同時采集。碰撞能和采集速率是影響All Ions MS/MS采集模式性能的重要參數(shù),本文分別對二者進行了優(yōu)化。

實驗首先對碰撞能進行了優(yōu)化。在All Ions MS/MS模式中需要設置碰撞能0 V以獲得化合物的加合離子信息,設置0 V以上的碰撞能以獲得二級質(zhì)譜的信息。本實驗選擇前述214種代表性農(nóng)藥進行碰撞能優(yōu)化。碰撞能較低時,采集到的碎片離子較少,用于定性的離子可能會偏少,導致定性信息不充分。如果碰撞能較高,化合物的主要定性離子強度降低,同時相對分子量較低的碎片離子增加,而基質(zhì)中的干擾峰通常位于低相對分子質(zhì)量端,這會對化合物的定性產(chǎn)生干擾。因此,本文在固定采集速率為2 spectra/s的條件下,對比了在0 V和15 V雙碰撞能通道下和0、15和30 V三碰撞能通道下,以及0、15和35 V三碰撞能通道下采集所篩出農(nóng)藥和假陰性農(nóng)藥的占比情況(見圖1)。可以看出,在0、15和35 V三碰撞能通道下,可篩查出農(nóng)藥的占比明顯高于其他情況,這主要是因為,同時在0、15和35 V三碰撞能通道下采集,可以使得一些相對穩(wěn)定的化合物產(chǎn)生相對較強的二級碎片離子,有助于對化合物進行同時基于母離子和二級碎片離子的準確定性。

圖 1 不同碰撞能下準確篩查出的農(nóng)藥和假陰性農(nóng)藥占比Fig. 1 Percentage of accurately screened and false-negative pesticides using different collision energies

在選定的0、15和35 V三碰撞能通道下,針對這214種農(nóng)藥,對采集速率進行優(yōu)化。圖2給出了2、3、4、5和6 spectra/s等5種采集速率下,篩出農(nóng)藥和假陰性農(nóng)藥的占比情況。從圖2可以看出,對于采集速率2、3和4 spectra/s,隨著采集速率的增加,可篩查出的農(nóng)藥占比增加,采集速率為4 spectra/s時,所有農(nóng)藥均能篩出,但是當采集速率設置為5 spectra/s和6 spectra/s時,可篩出農(nóng)藥數(shù)量的占比有所下降。同時,由于在All Ions MS/MS模式中兩個通道交替采集,采集速率逐漸增加,每個采集點的掃描時間下降,使得加合離子的響應逐漸下降,在保證每個色譜峰采集點數(shù)滿足準確定量的前提下,采集速率為4 spectra/s時的篩查結果最佳。

圖 2 不同采集速率下準確篩查出的農(nóng)藥和假陰性農(nóng)藥占比Fig. 2 Percentage of accurately screened and false-negative pesticides using different acquisition rates

2.2.3不同采集模式的比較

在Auto MS/MS和All Ions MS/MS兩種采集模式的最佳條件下,分別對214種農(nóng)藥的篩查情況進行比較。結果表明,214種農(nóng)藥在All Ions MS/MS采集模式下的篩出農(nóng)藥數(shù)量占比為100%,遠高于在Auto MS/MS采集模式下的檢出率(79.91%)。結合前述分析,Auto MS/MS采集模式下的篩出農(nóng)藥占比均低于All Ions MS/MS采集模式任一碰撞能下的檢出率,說明All Ions MS/MS采集模式更加靈敏,假陰性率明顯降低,優(yōu)于Auto MS/MS采集模式。因此,本文選擇All Ions MS/MS采集模式中0、15和35 V三碰撞能通道和采集速率4 spectra/s作為最佳條件,建立紫甘藍中415種農(nóng)藥的高通量篩查方法。

2.3 方法學驗證

2.3.1線性范圍、篩查限與定量限

稱取6份空白紫甘藍樣品,按1.3節(jié)描述進行前處理后,分別加入不同濃度的混合標準工作液,建立基質(zhì)匹配標準曲線。應用All Ions MS/MS模式測定目標化合物,以加合離子的質(zhì)量濃度對其峰面積繪制標準曲線,415種農(nóng)藥在各自范圍內(nèi)線性關系良好,相關系數(shù)(r2)均高于0.990(見附表1,詳見http://www.chrom-China.com/)。

關于篩查限(SDL)的確定,參照歐盟指南文件SANTE/12682/2019的要求,在一系列濃度水平上做添加回收試驗，每個水平制備20個平行樣,按照1.3節(jié)描述進行前處理后進行檢測。如果在某添加水平下,某個化合物在19個紫甘藍樣品中均能被定性篩查出來,則該濃度被確定為該化合物在紫甘藍中的篩查限。附表1給出了415種農(nóng)藥的篩查限,為1～20 μg/kg,其中411種農(nóng)藥的篩查限小于等于5 μg/kg。

按照1.3節(jié)描述對紫甘藍樣品進行前處理,向空白樣品中添加不同水平的目標化合物,在前述最佳條件下進行測定,以信噪比S/N≥10對應的添加水平作為定量限(LOQ),結果見附表1,紫甘藍中415種農(nóng)藥的定量限為1～20 μg/kg,其中413種農(nóng)藥的LOQ≤10 μg/kg。

2.3.2回收率與精密度

為了考察方法的準確度和精密度,對空白紫甘藍樣品進行添加回收試驗。分別選擇1倍、2倍和10倍LOQ的混合標準工作液作為添加水平,按前述方法進行前處理,每個添加水平制備5個平行樣品。同時進行空白實驗,扣除本底值后計算添加回收率和相對標準偏差。紫甘藍中415種農(nóng)藥在1倍、2倍和10倍LOQ添加水平下的回收率分別為65.7%～118.4%、72.0%～118.8%和70.2%～111.2%,相對標準偏差分別為0.9%～19.7%、0.2%～19.9%和0.6%～19.9%,結果見附表1。說明該方法的準確度和精密度滿足準確定量的要求。

2.4 歐盟能力驗證樣品測定

2019年歐盟組織了紫甘藍中農(nóng)藥殘留檢測的能力驗證,包括定性篩查(EUPT-SM-11)和定量篩查(EUPT-FV-21)兩方面內(nèi)容。將本文建立的篩查方法應用于該能力驗證項目提供的紫甘藍樣品中農(nóng)藥殘留的定性篩查和準確定量,評估了該方法的定性可靠性和定量準確性。樣品前處理按照1.3節(jié)描述進行,用All Ions MS/MS模式在最佳參數(shù)條件下進行數(shù)據(jù)采集。

定性篩查EUPT-SM-11未給定紫甘藍樣品中添加農(nóng)藥的范圍,重點考察篩查出農(nóng)藥的種類,定量僅做參考,而且要求收到樣品72 h內(nèi)上報結果。結果顯示,本實驗室應用本文開發(fā)的方法篩出了添加的16種農(nóng)藥,沒有假陽性結果。與歐盟官方最終公布結果完全一致。

關于定量篩查EUPT-FV-21,組織方提供了強制和自愿農(nóng)藥清單,要求首先對紫甘藍中在清單范圍內(nèi)的農(nóng)藥進行篩查,再對篩查出的農(nóng)藥準確定量。要求檢測范圍覆蓋強制農(nóng)藥清單的90%,檢出所添加農(nóng)藥種類的90%或以上并能準確定量,并且不能出現(xiàn)假陽性結果。

應用本文建立的方法首先進行定性篩查,準確篩查出了其中可以采用基于液相色譜-質(zhì)譜技術檢測的19種非揮發(fā)性農(nóng)藥,并采用相應的標準品進行進一步的準確定量。結果表明,本文建立的紫甘藍中農(nóng)藥多殘留篩查方法定性能力強,沒有假陽性,而且定量結果準確可靠,所有篩查出的化合物的定量結果均在驗證樣品的標準值允許誤差范圍內(nèi)。

3 結論

通過對比不同采集模式,優(yōu)化采集參數(shù),本文應用液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜建立了紫甘藍中415種農(nóng)藥殘留的高通量定性篩查與準確定量方法。將該方法應用于2019年歐盟組織的紫甘藍中農(nóng)藥殘留能力驗證,結果表明,基于All Ions MS/MS采集模式的一次進樣便可快速定性和定量的方法,具有非常強的定性篩查能力,同時可以對篩查出的化合物進行準確定量。該方法具有簡單、快速的特點,適用于對紫甘藍中多種農(nóng)藥殘留的快速篩查,可以為其他水果蔬菜中農(nóng)藥殘留的高通量篩查提供參考。