李彩麗，高 靜，黃雙盛，趙永勛，劉 進，黃 濤，李 敏

(1.西北民族大學醫(yī)學部生物化學教研室, 2. 西北民族大學附屬醫(yī)院檢驗科，甘肅 蘭州 730030；3. 蘭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤外科，甘肅 蘭州 730000)

白血病是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，主要臨床表現(xiàn)為出血、感染、貧血和多器官浸潤等，病情進展迅速，病死率高。其發(fā)病原因和發(fā)病機制目前尚不完全清楚[1]。白血病的治療方針是通過合理的綜合性治療，使白血病患者的預后得到極大改善，獲得治愈或長期穩(wěn)定生存[2]?；熞廊皇侵委煱籽〉闹饕椒?，但化療過程中藥物誘導產(chǎn)生的耐藥現(xiàn)象是臨床化療失敗的主要原因之一。白血病耐藥發(fā)生率約占白血病治療人數(shù)的33%[3]，根據(jù)其發(fā)生原因不同分為兩類：一類是細胞天然對某種化療藥物產(chǎn)生耐受，稱為原發(fā)性耐藥(primary drug resistance);另一類是化療藥物長期作用后細胞對該種藥物產(chǎn)生抵抗或耐受現(xiàn)象，稱為繼發(fā)性耐藥(secondary resistance),有些白血病細胞甚至會產(chǎn)生繼發(fā)性多藥耐藥現(xiàn)象(multidrug resistance，MDR)[4]。MDR的發(fā)生機制非常復雜，近年來研究發(fā)現(xiàn)，鉑類藥物和烷化劑等耐藥與細胞自噬水平有關(guān)[5]。本研究以慢性髓系白血病K562細胞為研究對象，用蒽環(huán)類化療藥物阿霉素(adriamycin，ADM)體外“逐步提高藥物濃度+間歇性刺激”的方式逐步誘導建立對ADM有穩(wěn)定耐藥性的K562/ADM細胞，一方面觀察K562/ADM細胞對吡柔比星、柔紅霉素等其它化療藥物是否有交叉耐藥現(xiàn)象，從而篩選出與常規(guī)化療藥物不存在交叉耐藥的新型藥物，為臨床攻克白血病MDR提供研究基礎(chǔ)。另一方面我們通過觀察耐藥前后細胞自噬水平的變化，并用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)抑制細胞自噬，觀察自噬水平對K562/ADM細胞化療敏感性及耐藥相關(guān)蛋白表達的影響，旨在研究K562/ADM細胞產(chǎn)生耐藥的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器

1.1.1細胞株 人類白血病K562細胞購自American Type Culture Collection (ATCC，Manassas，USA)。

1.1.2K562/ADM細胞的誘導與建立 以K562細胞為靶細胞，從ADM濃度0.02 μmol·L-1開始，采用“逐步提高藥物濃度+間歇性刺激”的方式逐步誘導其對ADM產(chǎn)生耐藥，最終誘導產(chǎn)生能夠穩(wěn)定耐受15 μmol·L-1ADM的耐藥細胞，稱之為K562/ADM細胞，該細胞在液氮中凍存3個月以上復蘇后其耐藥性依然維持穩(wěn)定。

1.1.3試劑 MTT(M2003)，三氧化二砷(arsenictrioxide，As2O3)購自美國Sigma公司，As2O3用0.1 mol·L-1NaOH溶解后，用PBS配制成10 mmol·L-1的貯存液；ADM(國藥準字：H44024359)購自深圳萬樂藥業(yè)有限公司；柔紅霉素(國藥準字：H20058349)、吡柔比星(國藥準字：H20045982)購自浙江海正藥業(yè)有限公司；5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil， 5-FU)(國藥準字：H31020593)購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；長春新堿(國藥準字：H20064346)購自廣東嶺南制藥有限公司；單丹黃酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)(貨號：30432)購自美國Sigma公司；蛋白提取及定量試劑盒(索萊寶公司)；兔源LC3-Ⅰ/Ⅱ(貨號：#4108)、Beclin-1(貨號：#3495)、p62(貨號：#5114)、P-gp(貨號：#13978)、MRP1(貨號：#72202)、BCRP(貨號：#4477)一抗和鼠源β-actin一抗(貨號：#3700)均購自美國CST公司；IRDye800DX標記的羊抗鼠(C80816-10)和IRDye700DX標記的羊抗兔(C81106-06)紅外熒光抗體均購自LI-COR公司。

1.1.4儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Bio-Tek公司)；透射電鏡(日本電子公司)；轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠)；熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；流式細胞儀(美國BECKMAN COULTER)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與處理 K562細胞及K562/ADM細胞以5×104個·L-1接種到含10%胎牛血清及2 mmol·L-1谷氨酰胺的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，置于5% CO2、37 ℃ 及飽和濕度培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2MTT法檢測細胞對化療藥物的敏感性 將處于對數(shù)生長期的K562細胞和K562/ADM細胞分別按5×107·L-1接種96孔板，按照一定梯度分別加入不同濃度的阿霉素、柔和霉素、As2O3、吡柔比星、5-FU、長春新堿等，5 % CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48和72 h,于培養(yǎng)終止前4 h 每孔加入MTT(5 g·L-1)10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入10%SDS后放培養(yǎng)箱過夜，用酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm波長檢測吸光值(A值)，依據(jù)細胞生長抑制率公式計算藥物對細胞的增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)，每個濃度設(shè)4個復孔。抑制率計算公式為：細胞生長抑制率/%=(對照組A值 -實驗組A值)/對照組A值 ×100%。

1.2.3透射電鏡觀察細胞的自噬形態(tài)學改變 收集細胞，PBS洗滌，3%戊二醛固定，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，切片，枸櫞酸鉛及醋酸鈾雙重染色，透射電鏡觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)。

1.2.4MDC染色熒光顯微鏡觀察細胞自噬水平 在培養(yǎng)的K562細胞和K562/ADM細胞中分別加入酸性囊泡染液MDC使其終濃度為0.05 mmol·L-1，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗滌，調(diào)整細胞濃度并滴片，用熒光顯微鏡觀察細胞自噬變化。

1.2.5Annexin-V/PI 雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率 離心收集細胞，PBS洗滌，結(jié)合緩沖液重懸細胞，加入Annexin-V和PI染液，避光孵育，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，實驗重復3次。

1.2.6Western blot法檢測自噬及耐藥相關(guān)蛋白的表達 收集各組細胞，用RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸5 min后上樣，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉+PBST封閉，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后按1 ∶10 000比例加入IRDye700DX和IRDye800CW二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌，用Odyssey紅外熒光掃描儀掃描并分析。

1.2.7統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行分析處理，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 ADM對K562細胞及K562/ADM細胞的增殖抑制作用不同濃度ADM對親本K562細胞和K562/ADM細胞的增殖抑制程度存在明顯差異(Fig 1A)。ADM對K562細胞24 h、48 h和72 h的IC50分別為5.53、3.87和0.74 μmol·L-1；而ADM對K562/ADM細胞24 h、48 h和72 h的IC50分別為134.4、79.7和53.8μmol·L-1(Fig 1B)，3個時間段的藥物抗性系數(shù)均大于20。

2.2 K562/ADM細胞出現(xiàn)多藥耐藥現(xiàn)象用不同濃度5-FU、吡柔比星、柔紅霉素、長春新堿和As2O3分別作用于親本K562細胞和K562/ADM細胞24、48和72h，計算IC50值并比較這兩種細胞對以上幾種化療藥物的敏感性。結(jié)果表明K562/ADM細胞對5-FU、吡柔比星、柔紅霉素、長春新堿等4種化療藥物均出現(xiàn)明顯的交叉耐藥現(xiàn)象，但對As2O3并不出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。相反，K562/ADM細胞對As2O3更加敏感，24 h、48 h和72 h的IC50值較K562細胞分別下降31.6%、36.3%和42.7%(Fig 2)。這也進一步說明As2O3與其他化療藥物的作用靶點不同，可用于治療對其他化療藥物耐受或化療后復發(fā)的白血病患者。

2.3 K562/ADM細胞耐藥前后細胞自噬水平的變化用透射電鏡和MDC染色熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，K562/ADM細胞內(nèi)自噬體數(shù)量和MDC點塊狀熒光強度較K562細胞顯著增多。用Western blot檢測K562/ADM細胞耐藥前后自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅰ/Ⅱ、p62的表達水平。結(jié)果表明，K562/ADM細胞內(nèi)與自噬體形成有關(guān)的蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達水平較親本K562細胞分別增加了0.78倍和6.5倍。而p62作為自噬的底物蛋白，其表達水平隨著細胞自噬水平的增高反而降低(Fig 3)。這說明K562細胞對ADM耐藥后細胞自噬水平較耐藥前明顯增強。

Fig 1 The inhibitory effect of ADM on K562 and

2.4 3-MA對K562/ADM細胞化療敏感性的影響用3 mmol·L-13-MA預處理K562/ADM細胞3 h后再用不同濃度ADM作用細胞72 h，對K562/ADM細胞的增殖抑制程度較ADM單獨作用組顯著增加。3-MA與ADM聯(lián)合作用組的IC50為11.3 μmol·L-1，較ADM單獨作用組降低了74.8%(Fig 4A)。用Annexin V/PI雙染檢測細胞凋亡率，3 mmol·L-13-MA與30 μmol·L-1ADM聯(lián)合作用組的總凋亡率為41.4%，而ADM單獨作用組的總凋亡率為18.5%，兩者相比差異有顯著性(P<0.01)(Fig 4B，4C)。

2.5 3-MA對K562/ADM細胞內(nèi)耐藥相關(guān)蛋白表達水平的影響P-gp和BCRP均可作為多種親脂性化療藥物(如阿霉素、長春新堿、柔紅霉素、吡柔比星等)的“外排泵”直接將藥物泵出細胞外，避免藥物對細胞造成損傷，從而導致腫瘤耐藥。MRP1能夠識別多種化療藥物與谷胱甘肽(GSH)形成的偶合物并將其轉(zhuǎn)運出細胞[6-7]，因此，P-gp、MRP1和BCRP 3種蛋白均與腫瘤耐藥有關(guān)。我們用Western blot檢測K562/ADM細胞耐藥前后及3 mmol·L-13-MA作用48 h后耐藥相關(guān)蛋白P-gp、MRP1和BCRP的表達水平。結(jié)果表明，K562/ADM細胞內(nèi)P-gp、MRP1和BCRP的表達水平較親本K562細胞均顯著上調(diào)，而3-MA能有效抑制K562/ADM細胞內(nèi)P-gp、MRP1和BCRP蛋白的表達(Fig 5)。

Fig 2 K562 /ADM cells resistance to otherchemotherapeutic drugs n=4)

Fig 3 Comparison of autophagy level between K562 and

3 討論

自噬是細胞在外環(huán)境刺激下，通過溶酶體降解其內(nèi)部錯誤折疊的蛋白質(zhì)、受損的細胞器等內(nèi)容物而實現(xiàn)自我調(diào)節(jié)的復雜過程，有眾多基因參與細胞自噬的調(diào)節(jié)。細胞自噬產(chǎn)生的物質(zhì)可以供細胞重新利用，可以使細胞在十分嚴峻的生存條件下通過降解自身物質(zhì)提供營養(yǎng)成分和能量從而得以生存[8]。自噬與腫瘤關(guān)系密切，在不利的腫瘤微環(huán)境中，自噬降解系統(tǒng)及其嚴密的防御體系構(gòu)成了腫瘤細胞賴以生存、增殖甚至耐藥和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)[6,9-10]。

白血病化療過程中由化療藥物誘發(fā)的MDR現(xiàn)象往往是白血病治療失敗和復發(fā)的主要原因之一。目前關(guān)于MDR現(xiàn)象的確切機制尚不明確，而且至今也缺乏有效的干預措施。有文獻報道證實，自噬參與胃癌、食道癌和肝癌等實體瘤的耐藥性形成[11-13]?；谶@些研究背景我們考慮：白血病細胞在某種化療藥物誘導下是否會產(chǎn)生MDR現(xiàn)象？耐藥是否與自噬有關(guān)？在本研究中，我們通過模擬臨床化療過程，從0.02 μmol·L-1ADM開始，逐漸提高藥物濃度、間歇性誘導K562細胞對ADM產(chǎn)生耐藥并建立穩(wěn)定耐受15 μmol·L-1ADM的K562/ADM細胞，并測定該細胞對阿霉素、吡柔比星、柔紅霉素、5-FU、長春新堿和As2O3的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)K562/ADM細胞對吡柔比星、柔紅霉素、5-FU和長春新堿均產(chǎn)生交叉耐藥現(xiàn)象，而對As2O3較K562細胞更加敏感。這一方面說明K562/ADM細胞出現(xiàn)MDR現(xiàn)象,另一方面說明As2O3在治療白血病方面有獨特優(yōu)勢，且沒有明顯的骨髓抑制和其他毒副作用。臨床發(fā)現(xiàn)在維甲酸治療后達到緩解的急性早幼粒細胞白血病患者中，聯(lián)合使用As2O3可以鞏固維甲酸的療效，因此As2O3被認為是維甲酸的黃金搭檔[14-15]。陳竺、陳賽娟等科學家通過臨床試驗使用As2O3對抗全反式維甲酸耐藥取得了成功，這表明As2O3在抗白血病和抗耐藥方面有顯著的效果和獨特的作用機制。因此，開發(fā)出與常規(guī)化療藥物不存在交叉耐藥并能增強常規(guī)藥物療效的新型藥物是攻克白血病MDR的潛在有效機制，也是我們進一步研究的方向。

阿霉素曾被認為是最有效的化療藥物之一，但近年來日趨嚴重的MDR現(xiàn)象嚴重制約了其臨床使用，其引起MDR的機制非常復雜，主要與ABC(ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運蛋白家族有關(guān)，該家族成員P-gp、MRP1和BCRP等耐藥相關(guān)蛋白能通過不同機制將化療藥物外排[16]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，K562/ADM細胞通過高表達P-gp、MRP1和BCRP等蛋白將吡柔比星、柔紅霉素、5-FU和長春新堿等化療藥物泵出細胞，是K562/ADM細胞出現(xiàn)交叉耐藥的重要原因之一。此外，我們通過觀察自噬形態(tài)學改變和自噬相關(guān)蛋白表達變化客觀反映細胞自噬強度，發(fā)現(xiàn)K562/ADM細胞的基礎(chǔ)自噬水平較親本K562細胞顯著增加，抑制自噬既能顯著提高K562/ADM細胞對ADM的敏感性，促進細胞發(fā)生凋亡，也能抑制耐藥相關(guān)蛋白的表達，這說明細胞自噬水平增高是K562/ADM細胞出現(xiàn)耐藥的另一重要原因。

Fig 4 Effectof 3-MA on sensitivity of K562/ADM cells to n=3)

Fig 5 Expression of resistance-associated n=3)

如今，靶向自噬也逐漸成為靶向治療白細胞等血液腫瘤的重要機制之一，使自噬在血液系統(tǒng)腫瘤中的作用機制得到越來越多的研究和認識。本研究從MDR和自噬角度對K562/ADM細胞進行了初步探究，還需要進一步深入研究。相信隨著科學的發(fā)展，自噬與白血病復發(fā)、自噬調(diào)控及耐藥等問題將會不斷得到揭示。