謝 童，李發(fā)珍，張成瑞，范彥英，楊彩紅

(山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，山西 太原 030001)

近年來，組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACI)廣泛用于臨床治療腫瘤，目前HDACI按化學(xué)結(jié)構(gòu)主要分為四類，分別為短鏈脂肪酸類、苯胺類、異羥肟酸類和親電酮類等[1]。根據(jù)藥物的結(jié)構(gòu)改造，合成的辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)成為首個獲得批準(zhǔn)上市的HDACI，通用名稱為伏立諾他，臨床上主要用于T細(xì)胞淋巴瘤的治療[2-3]。在心血管方面，近年研究發(fā)現(xiàn)HDACI可以改善動脈粥樣硬化、高血壓和肺動脈高壓、心肌梗死等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程[4]，但SAHA對血管的作用機(jī)制目前尚不明確，本文旨在探討SAHA對大鼠離體胸主動脈的作用，研究內(nèi)皮舒張因子一氧化氮(nitric oxide，NO)和前列環(huán)素(prostacyclin，PGI2)以及蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和Ca2+在SAHA舒張血管中的作用，以求豐富SAHA在血管方面的藥理學(xué)資料，期望為心血管疾病的治療找到新方法。

1 材料與方法

1.1 動物清潔級SD♂大鼠，體質(zhì)量(300±25)g，大鼠飼養(yǎng)條件：溫度(22±2) ℃，濕 度(45%-60%)，光、暗每12 h循環(huán)1次，自由飲食與飲水。獲自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(許可證號SCXK(晉)2009-0001)。

1.2 試劑SAHA(批號0510B022)、氯化乙酰膽堿(acetylcholine chloride，ACh，批號323D011)、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO，批號520C0314)和乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸[ethyleneglycol bis (2-aminoethylether) tetraacetic acid，EGTA，批號526E052]均購自北京索萊寶科技有限公司，吲哚美辛(indomethacin，Indo，批號056M4036V)、佛波酯(phorbol ester，PMA，批號MKBX7267V)和左旋硝基精氨酸甲酯(L-nitroarginiemethylester，L-NAME，批號WXBC4975V)均購自美國Sigma公司。十字孢堿(staurosporine，SP，批號21226)購自MedChemExpress公司，重酒石酸去甲腎上腺素(norepinephrine，NE，批號1806141)購自天津金耀氨基酸有限公司，苯腎上腺素(phenylephrine，PE，批號H1816053)購自上海晶純生化科技股份有限公司。生理鹽溶液成分(mmol·L-1)：NaCl 144，KCl 5.8，CaCl22.5，MgCl21.2，葡萄糖11.1，HEPES 5。60 mmol·L-1KCl溶液成分(mmol·L-1)：NaCl 89.6，KCl 60，CaCl22.5，MgCl21.2，葡萄糖11.1，HEPES 5?，F(xiàn)配現(xiàn)用，使用前pH值調(diào)節(jié)為7.4，溫度調(diào)為37 ℃。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器PowerLab 8/30信號分析系統(tǒng)購自澳大利亞埃德公司；HYJ-501S超級恒溫水槽購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；CP124C電子天平購自奧豪斯儀器(常州)有限公司；SV-8離體組織器官灌流系統(tǒng)購自四川泰盟科技有限公司；雷磁pH計購自上海儀電科學(xué)儀器有限公司。

1.4 方法[5-8]

1.4.1大鼠離體胸主動脈環(huán)制備與內(nèi)皮功能測定 斷頭處死300 g左右的SD♂大鼠，從心臟方向分離出整條胸主動脈，置于4 ℃ pH值為7.4的生理鹽溶液中，快速分離血管周圍結(jié)締組織，均勻分成每段約3-4 mm長的血管環(huán)，用自制棉棒在血管環(huán)內(nèi)壁輕輕摩擦3-4次即可制成去內(nèi)皮胸主動脈環(huán)。用自制的三角形細(xì)鋼絲掛鉤輕輕穿過血管將其固定，然后再用自制的L形細(xì)鋼絲再次輕輕穿過血管管腔，水平懸掛于充滿5 mL 37 ℃ pH值為7.4的生理鹽溶液的浴管中，上方連接張力轉(zhuǎn)換器，下方固定于浴管底部，浴管內(nèi)持續(xù)通入100% O2，調(diào)節(jié)血管前負(fù)荷為2 g，每15 min更換生理鹽溶液1次，重新調(diào)節(jié)血管前負(fù)荷為2 g，經(jīng)過4次共60 min后血管基礎(chǔ)張力穩(wěn)定在2 g左右，然后用5 mL 37 ℃ pH值為7.4的60 mmol·L-1KCl溶液替換浴管中的生理鹽溶液，刺激血管收縮，每15 min更換1次KCl溶液，使血管收縮達(dá)到坪值，KCl收縮2次的幅度差值低于5 %說明血管活性良好。KCl收縮完后重新更換為新鮮的生理鹽溶液，用1 μmol·L-1PE收縮血管，穩(wěn)定后用10 μmol·L-1ACh舒張，以ACh舒張幅度比PE收縮幅度作為舒張率，如果舒張率高于0.75即可認(rèn)定血管內(nèi)皮完整(endothelium-intact，End+)，如果舒張率低于0.05即可認(rèn)定血管內(nèi)皮完全去除(endothelium-denuded，End-)。待內(nèi)皮功能檢測完，更換生理鹽溶液使血管恢復(fù)基礎(chǔ)狀態(tài)進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4.2SAHA影響基礎(chǔ)狀態(tài)大鼠離體胸主動脈張力的測定 采用內(nèi)皮完整的大鼠胸主動脈環(huán)，實驗組每隔10 min依次加入SAHA系列藥物溶液，使其終濃度分別達(dá)到0.3、1、3、10和30 μmol·L-1，對照組加入等體積SAHA系列藥物溶液配制溶劑DMSO，觀察SAHA累積加藥實驗組與溶劑對照DMSO組血管基礎(chǔ)張力的變化。

1.4.3SAHA影響KCl預(yù)收縮的End+與End-大鼠離體胸主動脈張力的測定 分別用60 mmol·L-1KCl預(yù)收縮End+與End-大鼠胸主動脈環(huán)，收縮穩(wěn)定后，實驗組每隔10 min分別向孵育End+與End-大鼠胸主動脈環(huán)的生理鹽溶液中依次加入SAHA系列藥物溶液，使其終濃度分別達(dá)到0.3、1、3、10和30 μmol·L-1，對照組每隔10 min分別向孵育End+與End-大鼠胸主動脈環(huán)的生理鹽溶液中加入等體積SAHA系列藥物溶液配制溶劑DMSO。以KCl預(yù)收縮血管達(dá)到的最大收縮幅度為1，分別計算End++SAHA組、End-+SAHA組、End++DMSO組和End-+DMSO組中SAHA與DMSO各個累積濃度下的舒張幅度在 KCl最大收縮幅度中所占比例。

1.4.4SAHA影響NE預(yù)收縮的End+與End-大鼠離體胸主動脈張力的測定 分別用1 μmol·L-1NE預(yù)收縮End+與End-大鼠胸主動脈環(huán)，收縮達(dá)坪值后，實驗組每隔10 min分別向孵育End+與End-大鼠胸主動脈環(huán)的生理鹽溶液中依次加入SAHA系列藥物溶液，使其終濃度分別達(dá)到0.3、1、3、10和30 μmol·L-1，對照組每隔10 min分別向孵育End+與End-大鼠胸主動脈環(huán)的生理鹽溶液中加入等體積SAHA系列藥物溶液配制溶劑DMSO。以NE預(yù)收縮血管達(dá)到的最大收縮幅度為1，分別計算End++SAHA組、End-+SAHA組、End++DMSO組和End-+DMSO組中SAHA與DMSO各個累積濃度下的舒張幅度在 NE最大收縮幅度中所占比例。

1.4.5L-NAME和Indo影響SAHA舒張大鼠離體胸主動脈的測定 分別使用一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)和環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)抑制劑L-NAME與Indo預(yù)處理內(nèi)皮完整的大鼠胸主動脈環(huán)，實驗組分別孵育0.1 mmol·L-1L-NAME和0.01 mmol·L-1Indo 30 min，SAHA對照組不孵育L-NAME和Indo，然后3組均用1 μmol·L-1NE預(yù)收縮血管，穩(wěn)定后每隔10 min依次加入SAHA系列藥物溶液使其分別達(dá)到0.3、1、3、10和30 μmol·L-1的終濃度，分別計算End++SAHA+L-NAME組、End++SAHA+Indo組和End++SAHA組中SAHA各個累積濃度下的舒張幅度在NE最大收縮幅度中所占比例。

1.4.6PMA和SP影響SAHA舒張大鼠離體胸主動脈的測定 分別使用PKC激動劑PMA和PKC抑制劑SP預(yù)處理內(nèi)皮完整的大鼠胸主動脈環(huán)，實驗組分別孵育0.1 μmol·L-1PMA和0.01 μmol·L-1SP 30 min，SAHA對照組不孵育PMA和SP，然后3組均用1 μmol·L-1NE預(yù)收縮血管，穩(wěn)定后每隔10 min依次加入SAHA系列藥物溶液使其分別達(dá)到0.3、1、3、10和30 μmol·L-1的終濃度，分別計算End++SAHA+PMA組、End++SAHA+SP組和End++SAHA組中SAHA各個累積濃度下的舒張幅度在NE最大收縮幅度中所占比例。

1.4.7測定SAHA對外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放誘導(dǎo)大鼠離體胸主動脈收縮的影響 采用內(nèi)皮完整的大鼠胸主動脈環(huán)，基礎(chǔ)狀態(tài)穩(wěn)定后，用含EGTA無Ca2+的生理鹽溶液替換浴管內(nèi)正常含Ca2+的生理鹽溶液，以此來螯合血管的細(xì)胞外鈣，20 min后重新更換為不含EGTA無Ca2+的生理鹽溶液，穩(wěn)定后用1 μmol·L-1NE預(yù)收縮血管，此時血管通過細(xì)胞釋放的Ca2+而引起收縮，收縮穩(wěn)定后加入CaCl2系列溶液，使其終濃度分別達(dá)到0.03、0.1、0.3、1和3 mmol·L-1，由于細(xì)胞外鈣內(nèi)流，血管收縮增強(qiáng)，當(dāng)血管收縮達(dá)到坪值后，用含EGTA無Ca2+的生理鹽溶液替換浴管內(nèi)液體，以此來絡(luò)合細(xì)胞外鈣，20 min后再重新更換為不含EGTA無Ca2+的生理鹽溶液，實驗組分別孵育0.1、1和10 μmol·L-1SAHA 30 min，對照組孵育等體積SAHA系列藥物溶液配制溶劑DMSO 30 min，然后各組加入1 μmol·L-1NE預(yù)收縮血管，收縮穩(wěn)定后各組依次加入CaCl2系列溶液使其終濃度分別達(dá)到0.03、0.1、0.3、1和3 mmol·L-1，比較實驗組孵育0.1、1和10 μmol·L-1SAHA和對照組孵育DMSO前后CaCl2和NE收縮幅度變化，以孵育之前CaCl2和NE的最大收縮幅度為1，分別計算孵育之后累積濃度CaCl2和NE的收縮率，觀察SAHA對血管外Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放的影響。

2 實驗結(jié)果

2.1 SAHA對基礎(chǔ)狀態(tài)大鼠離體胸主動脈張力的作用如Fig 1所示，累積濃度SAHA(0.3、1、3、10和30 μmol·L-1)不改變基礎(chǔ)狀態(tài)大鼠離體胸主動脈環(huán)張力。

2.2 SAHA對KCl預(yù)收縮的End+與End-大鼠離體胸主動脈張力的作用SAHA可以舒張KCl預(yù)收縮的End+(Fig 2A)與End-(Fig 2B)胸主動脈，最大濃度SAHA對KCl預(yù)收縮的End+與End-胸主動脈的舒張率分別為(0.124±0.013)和(0.065±0.013)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，對End+胸主動脈舒張率高于End-胸主動脈(Fig 2C)。

2.3 SAHA對NE預(yù)收縮的End+與End-大鼠離體胸主動脈張力的作用從Fig 3可以看出，SAHA可以濃度依賴性的舒張NE預(yù)收縮的End+(Fig 3A)和End-(Fig 3B)胸主動脈，最大舒張率分別為(0.656±0.06)和(0.320±0.014)，對End+胸主動脈舒張率高于End-胸主動脈(Fig 3C)，結(jié)果差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

Fig 1 Effect of SAHA on basal tension of isolated thoracic aorta rings of rats n=6)

2.4 L-NAME和Indo對SAHA舒張大鼠離體胸主動脈的影響如Fig 4A所示，L-NAME (0.1 mmol·L-1)和Indo (0.01 mmol·L-1)預(yù)處理實驗組與SAHA對照組相比，L-NAME和Indo預(yù)處理組SAHA各個累積濃度下對NE預(yù)收縮血管的舒張明顯減小，End++SAHA+L-NAME組、End++SAHA+Indo組和End++SAHA組中SAHA的最大舒張率分別為(0.301±0.04)、(0.552±0.05)和(0.623±0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明預(yù)孵L-NAME和Indo可以減弱NE預(yù)收縮下SAHA的血管舒張作用，揭示SAHA舒張血管可能與增加內(nèi)皮舒張因子NO和PGI2生成有關(guān)。

2.5 PMA和SP對SAHA舒張大鼠離體胸主動脈的影響從Fig 5A可以看出，預(yù)孵PKC抑制劑SP(0.01 μmol·L-1)可以促進(jìn)SAHA的血管舒張作用，End++SAHA+SP組與End++SAHA組最大舒張率分別為(0.797±0.06)和(0.650±0.03)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。而預(yù)孵PKC激動劑PMA(0.1 μmol·L-1)能抑制SAHA舒張血管，但是隨著SAHA累積濃度的增大，PMA的抑制作用減弱，在SAHA濃度累積達(dá)到30 μmol·L-1時，無抑制作用。結(jié)果說明SAHA舒張血管作用可能部分與PKC有關(guān)。

Fig 2 Effect of SAHA on End+ and End- isolated thoracic aorta rings of rats precontracted with KCl n=6)

2.6 SAHA對外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放誘導(dǎo)大鼠離體胸主動脈收縮的影響如Fig 6A所示，孵育1和10 μmol·L-1SAHA 均能顯著抑制累積濃度CaCl2(0.03、0.1、0.3、1和3 mmol·L-1)在無鈣生理鹽溶液中引起的血管收縮，最大收縮率分別為(0.804 ± 0.04)和(0.600±0.04)，與溶劑對照DMSO組收縮率(0.928 ± 0.05)比較，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。而低濃度SAHA(0.1 μmol·L-1)在CaCl2累積濃度達(dá)到3 mmol·L-1時就不能發(fā)揮抑制作用。預(yù)孵0.1、1和10 μmol·L-1SAHA也能顯著抑制無鈣液中NE誘導(dǎo)的血管收縮(Fig 6B)，收縮率分別為(0.275 ± 0.03)、(0.172 ± 0.029)和(0.108 ± 0.04)，與溶劑對照DMSO組收縮率(0.734±0.07)比較，結(jié)果差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。提示一定濃度下SAHA舒張血管可能與抑制外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放有關(guān)。

3 討論

由于心血管疾病嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,抑制組蛋白去乙酰化酶漸成為心血管疾病領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。為了進(jìn)一步豐富SAHA在血管方面的藥理學(xué)資料，本文在離體條件下探究了SAHA對大鼠胸主動脈的作用，發(fā)現(xiàn)其能舒張血管，并初步研究了SAHA的舒張機(jī)制。

研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠分泌產(chǎn)生多種調(diào)節(jié)血管收縮與舒張功能的活性物質(zhì)，其中內(nèi)皮型一氧化氮合酶合成的NO和COX合成的PGI2是兩種重要的血管內(nèi)皮舒張因子[9]。NO和PGI2分別活化血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鳥苷酸環(huán)化酶和腺苷酸環(huán)化酶，使胞質(zhì)中環(huán)鳥苷酸和環(huán)腺苷酸水平升高，胞內(nèi)鈣離子濃度降低，進(jìn)而舒張血管[10]。實驗結(jié)果表明SAHA對完整內(nèi)皮血管的舒張要強(qiáng)于去內(nèi)皮血管，具有內(nèi)皮相關(guān)性，使用NOS和COX抑制劑L-NAME與Indo預(yù)孵血管后，發(fā)現(xiàn)SAHA的舒張作用明顯減弱，表明SAHA舒張血管可能與增加內(nèi)皮舒張因子NO和PGI2生成有關(guān)。

Fig 3 Effect of SAHA on End+ and End- isolated thoracic aorta rings of rats precontracted with NE n=6)

另外，PKC也通過多種途徑參與血管收縮舒張的調(diào)節(jié)，一是抑制PKC可以增強(qiáng)內(nèi)皮型一氧化氮合酶的活性，導(dǎo)致NO合成增加，從而引起血管發(fā)生舒張[11]。二是PKC能夠通過多種機(jī)制抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酯酶，增強(qiáng)肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)磷酸化，促使平滑肌收縮[12]。還有研究發(fā)現(xiàn)，PKC可以通過增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的敏感性，使肌細(xì)胞膜去極化，促進(jìn)鈣離子通過電壓依賴性鈣通道進(jìn)入細(xì)胞，從而增強(qiáng)平滑肌的收縮[13]。本文應(yīng)用PKC激動劑PMA孵育血管后發(fā)現(xiàn)SAHA的血管舒張作用降低，而使用PKC抑制劑SP則能促進(jìn)SAHA舒張血管，提示SAHA舒張血管與抑制PKC活性也有關(guān)。

在血管平滑肌的收縮與舒張過程中，鈣離子的參與至關(guān)重要，細(xì)胞內(nèi)鈣離子結(jié)合鈣調(diào)蛋白后活化肌球蛋白輕鏈激酶，使橫橋中的MLC磷酸化，引起橫橋肌絲滑行，從而誘發(fā)平滑肌收縮[14]。細(xì)胞內(nèi)的鈣離子水平升高主要有兩個途徑，一個是細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流進(jìn)入細(xì)胞，另外一個途徑是細(xì)胞內(nèi)鈣庫釋放儲存的鈣離子。在本實驗中預(yù)收縮劑KCl引起血管收縮就是由于細(xì)胞外高K+使平滑肌細(xì)胞膜去極化，從而活化細(xì)胞膜上電壓依賴性鈣通道，致鈣離子內(nèi)流進(jìn)入細(xì)胞而收縮血管。預(yù)收縮劑NE是通過活化受體依賴性鈣離子通道，誘發(fā)外鈣內(nèi)流而使血管發(fā)生收縮。在無鈣生理鹽溶液中加入累積濃度CaCl2引起血管收縮是通過增加細(xì)胞外鈣離子水平，而促進(jìn)鈣離子內(nèi)流引起血管收縮。實驗結(jié)果表明，累積濃度SAHA能夠舒張KCl和NE預(yù)收縮的大鼠離體胸主動脈，且抑制累積濃度CaCl2誘導(dǎo)的血管收縮，提示SAHA舒張血管可能與抑制外鈣內(nèi)流相關(guān)。在本實驗中預(yù)收縮劑NE可以活化磷脂酶C，刺激三磷酸肌醇產(chǎn)生，而后者能促使肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣離子釋放[15]。NE在無鈣生理鹽溶液中收縮血管就是通過內(nèi)鈣釋放增加鈣離子濃度，實驗結(jié)果表明隨著預(yù)孵SAHA濃度的增加，無鈣液中NE引起的收縮作用減弱，揭示SAHA舒張血管與抑制內(nèi)鈣釋放也有關(guān)。

Fig 4 Effect of L-NAME and Indo on SAHA-mediated vasodilating effect on isolated thoracic aorta rings of rats precontracted with NE n=6)

Fig 5 Effect of SP and PMA on SAHA-mediated vasodilating effect on isolated thoracic aorta rings of rats precontracted with NE n=6)

Fig 6 Effect of SAHA on vascular contraction induced by extracellular calcium influx and intracellular calcium release n=6)

綜上所述，SAHA的血管舒張作用具有內(nèi)皮相關(guān)性，可能與增加內(nèi)皮舒張因子NO和PGI2生成有關(guān)，另外，其舒張血管還可能與抑制PKC活性，抑制細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放有關(guān)。本實驗僅做了基礎(chǔ)性的初步研究，關(guān)于SAHA舒張血管的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的深入研究。

(致謝：特別感謝山西醫(yī)科大學(xué)藥理教研室各位老師和同學(xué)們的幫助。)