伍廣濤 蒲紅宇 張蓉 王曉雯 朱華

摘 要：為了解高錳酸鉀消毒對(duì)錦鯉幼魚毒性毒理的影響，采用靜水生物測(cè)試法研究高錳酸鉀（KMnO4）對(duì)錦鯉幼魚的急性毒性并進(jìn)行安全評(píng)價(jià)。以（16.36± 0.01）g錦鯉幼魚為試驗(yàn)對(duì)象，設(shè)定0.5、1、2 mg·L-1和3 mg·L-1 4個(gè)KMnO4濃度梯度進(jìn)行48 h急性暴露試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)累計(jì)死亡率，將剩余幼魚進(jìn)行48 h恢復(fù)試驗(yàn)。在脅迫0、24 h、48 h和恢復(fù)24 h、48 h等5個(gè)時(shí)間段取樣，以肝臟組織超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性以及谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）含量為指標(biāo)，研究KMnO4對(duì)錦鯉幼魚的毒理作用。結(jié)果表明：2 mg·L-1以上的高錳酸鉀溶液浸泡24 h能使錦鯉幼魚致死，SOD、CAT、GOT受到抑制。在解除脅迫后基本能恢復(fù)到正常水平。而GHS和MDA含量在脅迫過程中是呈升高趨勢(shì)的，但在解除脅迫后均下降到與對(duì)照組相似水平。研究結(jié)果表明KMnO4會(huì)造成錦鯉肝臟的損傷，且損傷程度隨著濃度和時(shí)間的增加而加重，但是解除脅迫后，SOD、CAT、GOT和GSH、MDA等均能達(dá)到不同程度的恢復(fù)。使用溶液濃度為1 mg·L-1的高錳酸鉀對(duì)錦鯉幼魚消毒最為合適。

關(guān)鍵詞：高錳酸鉀;急性脅迫;肝臟;抗氧化;錦鯉;SOD

鯉魚（Cyprinus carpio）是中國主要的淡水養(yǎng)殖品種之一[1]。錦鯉是鯉魚的亞種，是經(jīng)過人工選育而成的名貴觀賞魚類，在個(gè)人娛樂和競(jìng)技表演中作為寵物魚來養(yǎng)殖[2]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，養(yǎng)殖期間病害頻發(fā)，所以廣泛使用高錳酸鉀等藥物消毒，但對(duì)于其作用機(jī)制研究較少。到目前為止，對(duì)錦鯉的急性毒性研究主要在于對(duì)不同藥物對(duì)其存活率的影響，但對(duì)于高錳酸鉀消毒后對(duì)錦鯉肝臟的損傷以及相關(guān)指標(biāo)的變化未見報(bào)道。

高錳酸鉀（KMnO4）是一直被用作治療和防御魚類疾病的綠色化學(xué)藥物，通過其具有的強(qiáng)氧化性，達(dá)到殺死細(xì)菌、真菌以及寄生蟲的效果。其殺菌力隨濃度升高而增強(qiáng)，0.1%時(shí)可殺死多數(shù)細(xì)菌的繁殖體，2%～5%溶液能在24小時(shí)內(nèi)殺死細(xì)菌[3]，但使用過量，則會(huì)對(duì)魚的鰓及肝臟等組織產(chǎn)生不利的影響，可造成組織的氧化損傷。KMnO4還原生成的二氧化錳與蛋白質(zhì)結(jié)合形成的蛋白鹽復(fù)合物具有刺激和腐蝕作用[4]。生產(chǎn)上推薦的潑灑濃度為1～2 mg·L-1。但由于魚的品種以及大小規(guī)格的不同，導(dǎo)致使用高錳酸鉀消毒的劑量也相差較大。目前國內(nèi)外有許多關(guān)于高錳酸鉀脅迫對(duì)水生動(dòng)物影響的報(bào)道。Straus[5]報(bào)道在經(jīng)濟(jì)魚和觀賞魚養(yǎng)殖中，高錳酸鉀通常是直接加入養(yǎng)殖水體中或通過藥浴的方式處理魚體上的原生動(dòng)物和寄生蟲。另外如鱸鯉（Percocypris pingi）[6]、草魚（Ctenopharyngodon idella）[7]、中國花鱸（Lateolabrax japonicus）[8]、紅耳彩龜（Trachemys scripta elegans）[9]、血鸚鵡（Amphilophus citrinellus）[10]、斑點(diǎn)叉尾鮰（Ietalurus Punetaus）[11]等，然而現(xiàn)有研究對(duì)高錳酸鉀對(duì)錦鯉脅迫的影響主要集中在安全濃度以及死亡率上[12]，對(duì)于肝臟組織酶活性的變化以及脅迫后的恢復(fù)能力研究還鮮有報(bào)道。本研究通過試驗(yàn)確定高錳酸鉀對(duì)錦鯉幼魚的半致死濃度，并在高錳酸鉀急性脅迫下測(cè)定不同處理時(shí)間段錦鯉肝臟組織酶活性的變化以及脅迫后恢復(fù)情況。探討高錳酸鉀脅迫對(duì)錦鯉幼魚的毒性作用機(jī)制，旨在為錦鯉及其他觀賞魚養(yǎng)殖中高錳酸鉀脅迫的應(yīng)激反應(yīng)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚

試驗(yàn)魚由北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所水族實(shí)驗(yàn)室提供，魚體質(zhì)量為（16.36±0.01）g，體長（10.5±0.2）cm，試驗(yàn)前 1 d 停食，試驗(yàn)時(shí)選取體質(zhì)健壯、反應(yīng)靈敏、個(gè)體大小基本一致的幼魚進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)期間不喂食。

1.2 試驗(yàn)藥物及試驗(yàn)條件

試驗(yàn)藥物：高錳酸鉀（分析純）購自拜耳農(nóng)藥生物公司。

試驗(yàn)用水為曝氣 2 d以上的自來水，pH 值7.4，溶氧5.6 mg·L-1、水溫（20.7±0.1）℃。試驗(yàn)容器為40 L的塑料桶。

1.3 試驗(yàn)方法

通過預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，分別設(shè)定4個(gè)高錳酸鉀濃度梯度組（0.5、1、2 mg·L-1和3 mg·L-1），和一個(gè)空白對(duì)照組，試驗(yàn)均在室內(nèi)進(jìn)行。先將高錳酸鉀溶于純水，配制成母液，再按比例稀釋成所需的質(zhì)量濃度，藥液現(xiàn)配現(xiàn)用。每個(gè)塑料桶裝有10 L各梯度的高錳酸鉀溶液，同時(shí)分別放入10尾幼魚，試驗(yàn)過程中不更換藥液。前8個(gè)小時(shí)觀察試驗(yàn)魚的行為變化。記錄魚的死亡時(shí)間以及死亡數(shù)，及時(shí)撈出死亡個(gè)體。試驗(yàn)開始前，先將一尾幼魚解剖取其肝臟組織進(jìn)行保存，并在急性脅迫12 h、48 h以及將剩余個(gè)體放入清水恢復(fù)24 h、48 h四個(gè)時(shí)間段，每組隨機(jī)取一尾幼魚快速進(jìn)行解剖，取出肝臟組織，放入5 mL塑料離心管中，先放置于液氮罐中保存，待取樣完畢后放到-80 ℃冰箱進(jìn)行保存。

1.4 樣品測(cè)定

應(yīng)用羥胺法測(cè)定SOD活力;采用鉬酸銨法測(cè)定CAT活力;比色法測(cè)定GSH和GOT活性;采用TBA法測(cè)定MDA含量變化情況。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS19.0進(jìn)行處理，所給結(jié)果均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差（MEAN±SD）;用單因素方差方法分析，組間數(shù)據(jù)的兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 錦鯉中毒癥狀

錦鯉在不同質(zhì)量濃度的高錳酸鉀溶液中呈現(xiàn)明顯的中毒癥狀。在高濃度組，其應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈，游動(dòng)迅速，不斷亂竄。在6小時(shí)，出現(xiàn)側(cè)游、運(yùn)動(dòng)減慢的錦鯉。由表1可知，在6～24 h期間，低濃度組沒有出現(xiàn)死亡，2 mg·L-1組死亡率為40%，3 mg·L-1組死亡率為50%。但隨著時(shí)間的延長，并不再出現(xiàn)死亡情況。

2.2 對(duì)錦鯉肝臟SOD活性的影響

由表2可以看出，錦鯉在經(jīng)過高錳酸鉀處理24 h后，各濃度組肝臟的SOD活性與對(duì)照組相比均顯著下降，差異極顯著（P<0.01）。到48 h，2 mg·L-1組與對(duì)照組差異顯著（P<0.05），3 mg·L-1組與對(duì)照組差異極顯著（P<0.01），并且達(dá)到最低點(diǎn)。解除脅迫后24 h，各處理組的SOD活性均開始回升，2 mg·L-1組已基本恢復(fù)到與對(duì)照組差不多水平。但是解除脅迫后48 h，3 mg·L-1組SOD的活性仍與對(duì)照組存在極顯著差異（P<001）。

從表3可知，隨著高錳酸鉀濃度的增加，24 h錦鯉肝臟CAT活性被抑制，其中隨著處理濃度的升高，CAT活性被抑制得更加明顯。各處理組內(nèi)CAT活性極顯著低于對(duì)照組（P<0.01），48 h各個(gè)組的CAT活性均達(dá)到最低值，除了0.5 mg·L-1組與對(duì)照組無顯著差異外，其他處理組均極顯著低于對(duì)照組（P<0.01），解除脅迫24 h各組CAT活性逐漸回升。但均與對(duì)照組存在顯著性差異，恢復(fù)48 h后，僅有2 mg·L-1組與對(duì)照組存在顯著性差異（P<0.05），其余處理組CAT活性基本恢復(fù)到正常水平。

通過分析表4可知，隨著高錳酸鉀濃度的增加，錦鯉肝臟GOT酶活性誘導(dǎo)增強(qiáng)。24 h和48 h各處理組的GOT活性升高，其中1 mg·L-1和2 mg·L-1組顯著高于對(duì)照組（P<0.05），3 mg·L-1組極顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。并且在脅迫48 h后，GOT活性達(dá)到最高值。在解除脅迫48 h，GOT活性逐漸下降，低濃度組基本恢復(fù)到對(duì)照組水平，2 mg·L-1和3 mg·L-1組仍極顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。

從表5可以看出，錦鯉在經(jīng)高錳酸鉀處理24 h到48 h后，錦鯉幼魚肝臟GSH含量升高，2 mg·L-1組在脅迫24 h后，極顯著高于對(duì)照組（P<0.01），脅迫48 h后，顯著高于對(duì)照組（P<0.05），解除脅迫48 h后基本恢復(fù)到與對(duì)照組相似水平。

通過分析表6可知，高錳酸鉀處理急性脅迫以及解除脅迫后，錦鯉幼魚肝臟MDA含量呈先升高后降低的趨勢(shì)。高錳酸鉀處理24 h后，各處理組MDA含量升高，并均極顯著高于對(duì)照組（P<001）。48 h MDA含量達(dá)到最高值，3 mg·L-1處理組的MDA含量達(dá)到（11.225±0.09）nmol·mL-1。解除脅迫24 h和48 h后MDA含量均有所下降，但仍均顯著高于對(duì)照組（P<001）。

3 討論

3.1 錦鯉幼魚中毒癥狀

錦鯉幼魚KMnO4中毒后， 在水中上下亂竄，表現(xiàn)得急促不安，呼吸頻率加快。將死亡個(gè)體撈出，觀察到魚的體表和鰓絲上充滿黏液。表明KMnO4可能損傷了錦鯉幼魚的鰓導(dǎo)致魚體缺氧，神經(jīng)系統(tǒng)受損。這與周禮敬等[13]和張?jiān)虑俚萚14]觀察到的魚類急性高錳酸鉀中毒癥狀相似。在急性脅迫結(jié)束后，將存活錦鯉幼魚移入清水中繼續(xù)暫養(yǎng)48 h，并沒有出現(xiàn)繼續(xù)死亡現(xiàn)象，表明錦鯉幼魚具有一定的生理調(diào)節(jié)機(jī)能。

3.2 KMnO4對(duì)錦鯉幼魚抗氧化酶活性的影響

SOD-CAT作為魚類抗氧化損傷的第一道防線，它們?cè)诰S持自由基平衡和減少氧化損傷方面發(fā)揮著重要作用[15]。本次研究中，在脅迫2 d時(shí)對(duì)照組的SOD與CAT也是呈先下降趨勢(shì)，只是下降趨勢(shì)沒有試驗(yàn)組明顯，說明低氧脅迫對(duì)錦鯉抗氧化系統(tǒng)有一定影響。在斑馬魚[16]的研究中有過SOD和CAT下降的現(xiàn)象?？赡苁窃擊~肝臟產(chǎn)生過多的ROS，反過來抑制了SOD、CAT活性。先天免疫系統(tǒng)是脊椎動(dòng)物抵御壓力的第一道防線，但也是無脊椎動(dòng)物唯一的防線[17]。由于缺乏特定的免疫系統(tǒng)，酶（如CAT和SOD）在無脊椎動(dòng)物的免疫中起著至關(guān)重要的作用[18]。超氧化物歧化酶和過氧化氫酶是關(guān)鍵的內(nèi)源性抗氧化酶，它們反過來參與超氧化物自由基的水解：SOD將超氧化物轉(zhuǎn)化為過氧化氫，然后過氧化氫被過氧化氫酶水解為水和氧氣[19]。GSH則在參與清除H2O2過程中也起到重要的作用。一些研究表明，當(dāng)生物體受到輕度逆境脅迫時(shí)，SOD活性往往升高，這其實(shí)是一種應(yīng)激反應(yīng)，通過產(chǎn)生大量SOD來清除體內(nèi)超氧離子自由基，使機(jī)體達(dá)到一種新的動(dòng)態(tài)平衡現(xiàn)象，這一現(xiàn)象也被稱為“毒物興奮效應(yīng)”;而當(dāng)受到重度環(huán)境脅迫時(shí)，SOD活性通常降低，使生物體內(nèi)積累過量的活性氧，從而導(dǎo)致生物體的傷害[20]。本次試驗(yàn)中，錦鯉幼魚受到高錳酸鉀脅迫后體內(nèi)肝臟組織的SOD和CAT的活性被極顯著的抑制，說明高錳酸鉀并沒有使錦鯉幼魚產(chǎn)生“毒物興奮效應(yīng)”，而是魚體內(nèi)的活性氧超過了SOD的耐性閾值，細(xì)胞受到了嚴(yán)重傷害，導(dǎo)致其應(yīng)激的能力下降，因此SOD活性也不可避免地降低。因此，KMnO4脅迫下SOD與CAT活性的降低，造成錦鯉幼魚的活性氧傷害很可能是KMnO4對(duì)錦鯉幼魚形成毒害的重要原因之一。但是通過放入清水中解除脅迫48 h后，SOD和CAT的活性均能恢復(fù)到與對(duì)照組相似水平，說明錦鯉具有一定的自我調(diào)節(jié)功能。

本次研究中，GSH的含量極顯著地上升了?？赡苁窃矩?fù)責(zé)將過氧化氫水解為H2O與氧氣的CAT活性被抑制。只能靠產(chǎn)生大量GSH酶來清除體內(nèi)過多的H2O2。反映機(jī)體氧化損傷最具代表性的指標(biāo)之一的是MDA，其含量變化通常與SOD酶的活力成負(fù)相關(guān)[21]。本次研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。在高錳酸鉀脅迫48 h內(nèi)，SOD酶活力下降，而MDA的含量上升。說明高錳酸鉀脅迫48 h已經(jīng)損害了錦鯉的抗氧化系統(tǒng)。

GOT是廣泛存在于動(dòng)物線粒體中的重要氨基酸轉(zhuǎn)氨酶，其活性的變化可以有效測(cè)定肝臟的損傷程度。本次試驗(yàn)錦鯉受高錳酸鉀脅迫過程中，肝臟GOT活性是持續(xù)上升的，這與朱仙珍[22]等對(duì)湘云鯽的研究相一致。表明KMnO4脅迫對(duì)錦鯉肝臟有一定程度的損害。但經(jīng)過解除脅迫48 h試驗(yàn)可以看出，這種損害是可逆的，可以通過自身調(diào)節(jié)修復(fù)。

本次研究通過分析各項(xiàng)抗氧化酶指標(biāo)可以看出，1 mg·L-1高錳酸鉀脅迫錦鯉幼魚不僅不會(huì)使其致死，除MDA外，其余指標(biāo)都基本能恢復(fù)到正常水平。所以在錦鯉幼魚養(yǎng)殖過程中，使用溶液濃度為1 mg·L-1的高錳酸鉀比較合適。

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Effects of potassium permanganate stress and post-toxic recovery on liver tissue of Cyprinus Carpio

WU Guangtao1，2， PU Hongyu1， ZHANG Rong2， WANG Xiaowen2， ZHU Hua2

（1. School of Aquatic products and Life， Dalian Ocean University， Dalian 116023，China;2. Beijing key Laboratory of Fisheries Biotechnology， Beijing Institute of Aquatic Sciences， Beijing 100068，China）

Abstract：In order to understand the toxicological effect of potassium permanganate disinfection on juvenile koi， the acute toxicity of potassium permanganate （KMnO4） to juvenile koi was studied by static water bioassay and safety evaluation was carried out. The acute exposure experiment of 48 h was carried out with 0.5，1， 2 mg ·L-1 and 3 mg ·L-1 KMnO4 concentration gradients， and the cumulative mortality was calculated， and the 48 h recovery experiment for the rest of fist was carried out. The activities of superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT） and glutamic oxaloacetic transaminase （GOT） and the contents of glutathione （GSH） and malondialdehyde （MDA） in liver tissue were taken at 0，24 and 48 hours after stress and 24 hours and 48 hours after recovery. The toxicological effects of KMnO4 on juvenile koi were studied. The results showed that soaking in 2 mg ·L-1 potassium permanganate solution for 24 hours could kill juvenile koi and inhibit SOD， CAT and GOT. After relieving the stress， it can basically return to the normal level. The contents of GHS and MDA increased in the process of stress， but decreased to a level similar to that of the control group after relieving stress. The results showed that KMnO4 could cause liver damage of koi， and the degree of damage was aggravated with the increase of concentration and time， but after relieving stress， SOD， CAT， GOT， GSH， MDA and so on could recover to different degrees. Potassium permanganate with the concentration of 1 mg ·L-1 is the most suitable for disinfection of juvenile koi.

Key words：potassium permanganate; acute stress; liver; antioxidation; koi; SOD

（收稿日期：2021-01-16）